王利平，陸富永，魏　嬌，楊鳳元，蒙　堅(jiān)，羅婧瑩，程培華

免疫調(diào)節(jié)劑對(duì)亞臨床型生殖器皰疹豚鼠模型排毒及IL-2和IL-4水平的影響

王利平，陸富永，魏嬌，楊鳳元，蒙堅(jiān)，羅婧瑩，程培華

王利平

目的觀察匹多莫德聯(lián)合銅綠假單胞菌注射液治療亞臨床型生殖器皰疹(genital herpes，GH)豚鼠模型的排毒及機(jī)體免疫的情況，借以揭示人類亞臨床型GH患者聯(lián)合服用免疫調(diào)節(jié)劑后的療效。方法以人單純皰疹病毒(HSV)-2Sav感染從未感染過HSV的雌性中華彩豚，建成GH豚鼠模型，待其癥狀好轉(zhuǎn)后，通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測(cè)豚鼠外生殖器及生殖道拭子HSV-DNA的陽性率，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）測(cè)出其血清白細(xì)胞介素(IL)-2、IL-4的濃度，再分別與空白對(duì)照組及用藥組比較。結(jié)果亞臨床型GH豚鼠模型仍有HSV排泌，且其IL-2濃度顯著低于空白對(duì)照組（P ＜0.01），而IL-4濃度高于空白對(duì)照組（P ＜0.05）；用藥組的豚鼠HSV-DNA陽性率明顯減少，而其血清IL-2濃度高于亞臨床GH豚鼠模型組，IL-4的水平低于亞臨床GH豚鼠模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。結(jié)論亞臨床型GH豚鼠模型確實(shí)存在HSV排泌，同時(shí)其血清中細(xì)胞因子的分泌也發(fā)生了異常，匹多莫德聯(lián)合銅綠假單胞菌注射液治療后不僅能減少HSV排泌，還能改善機(jī)體免疫失衡狀態(tài)。

生殖器皰疹，亞臨床型；匹多莫德；銅綠假單胞菌；單純皰疹病毒；白細(xì)胞介素

亞臨床型生殖器皰疹（GH）也即無癥狀病毒攜帶，是指缺乏典型的癥狀（如簇集性水皰、膿皰、裂隙、糜爛、潰瘍等皮損）及體征，但仍能在患者的外生殖器、宮頸或肛周等部位檢測(cè)到單純皰疹病毒(HSV)的一種特殊的生殖器皰疹臨床類型。易被門診醫(yī)生及患者忽視，導(dǎo)致HSV在性伴之間廣泛傳播[1]。HSV屬α皰疹病毒科，其感染的一個(gè)主要特點(diǎn)就是能夠在宿主體內(nèi)潛伏感染[2]。HSV-1易潛伏于三叉神經(jīng)節(jié)，而HSV-2易潛伏于骶尾神經(jīng)節(jié)，當(dāng)患者機(jī)體免疫功能下降可再次使HSV被激活而使病情反復(fù)。這也可能是GH發(fā)病率居高不下的根本原因。因此減少亞臨床型GH患者HSV排泌[3]，以及糾正機(jī)體免疫紊亂[4]狀況是治療和預(yù)防GH最重要的一環(huán)。探尋出一種減少和控制GH患者HSV排泌同時(shí)又能改善免疫功能的治療方案具有重要意義。本項(xiàng)目在HSV核酸及細(xì)胞因子生物檢測(cè)水平進(jìn)行研究，以探索治療人類亞臨床型GH的有效方法。

1　材料與方法

1.1材料

雌性中華彩豚（桂林醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室提供），重量約250（±20）g[5]。用于GH模型的HSV-2Sav株從中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒所引進(jìn)。豚鼠白細(xì)胞介素(IL)-2酶聯(lián)免疫試劑盒（產(chǎn)品編號(hào)CSB-E12914Gp）、豚鼠IL-4酶聯(lián)免疫試劑盒（產(chǎn)品編號(hào)CSB-E10126Gu）均由武漢華美生物工程有限公司（CUSABIO）提供。匹多莫德片（萬適寧）由太陽石藥業(yè)生產(chǎn)。銅綠假單胞菌注射液（MSHA菌毛株，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字S20043022），由北京萬特爾生物制藥有限公司生產(chǎn)。離心機(jī)（中大儀器 TGL-16），培養(yǎng)箱（精宏儀器GNP-9270，酶標(biāo)儀（Thermo MK-3）。HSV核酸檢測(cè)試劑盒（HSV-2型）及MJ2型熒光聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測(cè)儀均由深圳市匹基生物工程股份有限公司提供。

1.2方法

1.2.1分組隨機(jī)選用已排除HSV感染的雌性中華彩豚，共36只，采用數(shù)字表法隨機(jī)選取10只設(shè)為空白對(duì)照組，其余均建成GH豚鼠模型，待GH癥狀好轉(zhuǎn)后（約16 d后GH豚鼠模型外生殖器部位無典型皮損），隨機(jī)選取11只為亞臨床型GH豚鼠模型組，余下10只為用藥組，再通過PCR定性檢測(cè)各組豚鼠外生殖器及宮頸拭子HSV-DNA的陽性率及用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）測(cè)定出各組豚鼠機(jī)體血清IL-2、IL-4的濃度（pg/ml），其中5只死于繼發(fā)感染。

1.2.2入選條件 有皮損的GH豚鼠模型好轉(zhuǎn)后外生殖器部位已無典型GH的癥狀。

1.2.3建模GH豚鼠模型的制作[5]：建模前一天晚上豚鼠停止飲水，建模時(shí)先用無菌棉簽蘸取適量生理鹽水清洗豚鼠外陰，用七星針輕叩會(huì)陰部數(shù)次至有少許出血，繼之用1 ml注射器吸取0.1 ml HSV-2Sav病毒液配上灌胃針頭伸入豚鼠陰道內(nèi)約3～4 cm，將病毒液注入陰道穹隆處后緩慢退出，再用明膠海綿置入陰道口，防止病毒液溢出。

1.2.4免疫調(diào)節(jié)劑的使用建立GH豚鼠模型后約第16天（原發(fā)皮損消退），再分為亞臨床型GH豚鼠模型組（不給藥）及用藥組；用藥組給藥方法為每日飼喂匹多莫德1/2片，銅綠假單胞菌注射液按每只1 ml，每30天于皮下注射1次。

1.2.5 HSV-DNA檢測(cè)及ELISA測(cè)定亞臨床型豚鼠模型組和用藥90 d后的用藥組豚鼠在灌胃針幫助下用無菌棉拭子在宮頸上皮、尿道口、陰道黏膜及外生殖器患過皮損部位取材，再采用新型HSV-DNA檢測(cè)試劑盒（HSV-2型）及MJ2型熒光PCR檢測(cè)儀分別檢測(cè)亞臨床型GH豚鼠模型組及用藥組豚鼠HSVDNA的陽性率。后將空白對(duì)照組、亞臨床型GH豚鼠模型組及已聯(lián)合用藥90 d的用藥組豚鼠用3.5%水合氯醛溶液按350 ml/kg腹腔注射麻醉后心臟取血，離心（2 500 r/min，8 ℃）分離出血清，繼之用雙抗體夾心ELISA法分別測(cè)定出各組豚鼠血清IL-2及IL-4的濃度（pg/ml）。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，HSVDNA檢測(cè)陽性率用兩獨(dú)立樣本的卡方檢驗(yàn)，而各組豚鼠IL-2、IL-4的濃度均為計(jì)量資料符合正態(tài)分布（P＞0.1），方差齊（P ＞0.1），采用方差分析，數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（xˉ ±s）描述。P ≤ 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1HSV的排泌情況

11只亞臨床型GH模型組的豚鼠，HSV排泌陽性7只（63.6%），而10只聯(lián)合使用匹多莫德片及銅綠假單胞菌注射液治療的豚鼠，HSV排泌陽性僅有1只（表1）。

表1　兩組豚鼠HSV-DNA檢測(cè)陽性率 [只(%)]

2.2各組血清IL-2和IL-4的水平

亞臨床型GH模型組的豚鼠血清IL-2的濃度顯著低于空白對(duì)照組（P＜0.01），而其血清IL-4濃度高于空白對(duì)照組（P＜0.05），聯(lián)合使用匹多莫德片及銅綠假單胞菌注射液治療組的豚鼠血清IL-2濃度高于亞臨床型GH模型組（P＜0.05），而IL-4濃度低于亞臨床型GH模型組，兩組相比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。空白對(duì)照組與用藥組豚鼠血清IL-2、IL-4的濃度相比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

表2　各組血清IL-2和IL-4水平檢測(cè)結(jié)果 （xˉ ±s）

3　討論

亞臨床型GH是皮膚與性病科門診易被忽略的一種特殊類型的性傳播疾病[6]，而GH患病70%是通過無癥狀的GH患者進(jìn)行傳染，因此其危害不容小覷。細(xì)胞因子IL-2主要是由Th1細(xì)胞分泌的，主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫[7]；而IL-4是由Th2細(xì)胞分泌的，主要介導(dǎo)體液免疫。以上實(shí)驗(yàn)表明，亞臨床型GH豚鼠模型不僅有HSV的排泌還存在細(xì)胞免疫及體液免疫功能不平衡的狀況。11只亞臨床型GH模型組的豚鼠HSV-DNA陽性有7只(63.6%)，而10只用藥組的豚鼠HSV-DNA陽性僅有1只(10%)；亞臨床型GH豚鼠模型組的IL-2的水平明顯低于空白對(duì)照組（P＜0.01），而其血清IL-4的水平高于空白對(duì)照組（P＜0.05），用藥組的豚鼠IL-2的水平高于亞臨床型GH豚鼠模型組（P＜0.05），而IL-4濃度低于亞臨床型GH模型組（P＜0.05），用藥組與空白對(duì)照組的豚鼠IL-2、IL-4的水平相比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。由此可知亞臨床型豚鼠模型同樣存在Th1/Th2平衡失調(diào)（即Th1向Th2漂移）[8]，聯(lián)合使用匹多莫德及銅綠假單胞菌注射液治療后不僅能夠使亞臨床型GH豚鼠模型HSV的排泌得到控制，還能通過上調(diào)IL-2濃度和下調(diào)IL-4濃度來改善細(xì)胞免疫及體液免疫失衡狀態(tài)。銅綠假單胞菌注射液（PAMSHA）[9]是一種具有廣泛的免疫調(diào)節(jié)作用和較強(qiáng)的免疫刺激活性的制劑，其可以促進(jìn)Th1細(xì)胞因子干擾素（IFN）-γ、IL-2、腫瘤壞死因子(TNF)-β等的分泌，從而增強(qiáng)機(jī)體的細(xì)胞免疫，還可以間接活化自然殺傷（NK）細(xì)胞[10]，以增強(qiáng)機(jī)體防御的能力。匹多莫德亦是一種新型的、人工合成的免疫調(diào)節(jié)劑[11]，可刺激機(jī)體的特異性免疫應(yīng)答及非特異性免疫應(yīng)答[12]，能雙向高效調(diào)節(jié)機(jī)體細(xì)胞及體液免疫不平衡狀態(tài),進(jìn)而間接促使機(jī)體發(fā)揮抗病毒作用。因此聯(lián)合使用匹多莫德及銅綠假單胞菌注射液既能夠加強(qiáng)抗病毒作用又能夠調(diào)控機(jī)體的免疫功能，而且長(zhǎng)期應(yīng)用后未見明顯不良反應(yīng)，因此值得臨床應(yīng)用。

[1] Tronstein E, Johnston C, Huang ML, et al. Genital shedding of herpes simplex virus among symptomatic and asymptomatic persons with HSV-2 infection [J]. JAMA, 2011, 305(14):1441-1449.

[2] Johnston C, Zhu J, Jing L, et al. Virologic and immunologic evidence of multifocal genital herpes simplex virus 2 infection [J]. J Virol, 2014, 88(9):4921-4931.

[3] Awasthi S, Mahairas GG, Shaw CE, et al. A dual modality HSV-2 vaccine for preventing genital herpes using glycoproteins C and D subunit antigens to induce potent antibody responses and adenovirus vectors containing capsid and tegument proteins as T cell immunogens [J]. J Virol, 2015, 89(16):8497-8509.

[4] 李萍, 邵路平. 復(fù)發(fā)性生殖器皰疹患者血清細(xì)胞因子的表達(dá)及機(jī)體細(xì)胞免疫功能的研究 [J]. 內(nèi)蒙古中醫(yī)藥, 2010, 29(15):106-107.

[5] 李紅毅, 鄭毅春, 范瑞強(qiáng), 等. 中藥對(duì)復(fù)發(fā)性生殖器皰疹模型神經(jīng)節(jié)的超微結(jié)構(gòu)和潛伏病毒的影響 [J]. 中國(guó)皮膚性病學(xué)雜志, 2007, 21(10):590-592.

[6] 夏利, 劉升學(xué), 蒙堅(jiān), 等. 亞臨床型生殖器皰疹脫排病毒及藥物干預(yù)的臨床研究 [J]. 中國(guó)性科學(xué), 2013, 22(8):49-52.

[7] 陳建華, 鐘文俊, 吳蕊, 等. 生殖器皰疹患者血清IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10水平檢測(cè)及意義 [J]. 中國(guó)麻風(fēng)皮膚病雜志, 2007, 23(11):968-969.

[8] 鄧云華, 萬沐芬, 楊東亮, 等. 復(fù)發(fā)性生殖器皰疹患者外周血Tc1/Tc2亞群檢測(cè)及意義 [J]. 中國(guó)皮膚性病學(xué)雜志, 2005, 19(4):206-209.

[9] 萬志華, 蔡艷, 陳新. 銅綠假單胞菌注射液對(duì)非小細(xì)胞肺癌患者圍手術(shù)期免疫水平的影響 [J]. 中南藥學(xué), 2014, 12(7):696-699.

[10] 靳雋. 銅綠假單胞菌制劑聯(lián)合泛昔洛韋治療復(fù)發(fā)性生殖器皰疹療效觀察 [J]. 中國(guó)現(xiàn)代藥物應(yīng)用, 2007, 1(4):19-20.

[11] Fogli M, Caccuri F, Iaria ML, et al. The immunomodulatory molecule pidotimod induces the expression of the NOD-like receptor NLRP12 and attenuates TLR-induced inflammation [J]. J Biol Regul Homeost Agents, 2014, 28(4):753-766.

[12] 李慧, 王永軍, 孫進(jìn). 匹多莫德及其制劑的研究進(jìn)展. 中國(guó)藥劑學(xué)雜志(網(wǎng)絡(luò)版), 2012, 10(4):68-73.

（本文編輯耿建麗）

The influence of combined application of immunomodulator on the asymptomatic shedding and serum IL-2, IL-4 levels of subclinical GH guinea pig model

WANG Li-ping，LU Fu-yong，WEI Jiao，et al
Department of Dermatology, Affiliated Hospital of Giulin Medical University, Giulin 541001, China

ObjectiveTo observe the detoxification and immunity status of subclinical genital herpes(GH) guinea pig model which accepted combined treatment of pidotimod tablets and pseudomonas aeruginosa injection, so as to reveal the effect of administration of immunomodulator in patients with subclinical GH. MethodsGH guinea pig model was gained by using HSV-2 sav to infect female guinea pig which had never been infected by HSV, polymerase chain reaction (PCR) was used to detect the HSV-DNA of guinea pig genital and genital tract swab, and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was adopted to detect the concentration of serum IL-2 and IL-4(pg/ml). Finally the data of the different groups were analyzed and compared. ResultsGuinea pigs model of subclinical GH shedding HSV was confirmed, and the serum IL-2 levels of subclinical GH guinea pig model group was significantly lower than that of blank control group (P＜0.01), IL-4 levels of subclinical GH guinea pigs model group was higher than that of blank control group (P＜0.05). The HSV-DNA positive rate of medication group decreased significantly, and the serum IL-2 levels of medication group was higher than that of subclinical GH guinea pigs model group, the serum IL-4 levels of medication group was lower than that of subclinical GH guinea pigs model group, and the difference was statistically significant (P＜0.05). ConclusionThe guinea pig model of subclinical GH shedding HSV was confirmed and the secretion of serum cytokine became abnormality. Combined application of pidotimod and pseudomonas aeruginosa injection can reduce HSV shedding and improve immune imbalance.

Herpes genital，subclinical；Pidotimod；Pseudomonas aeruginosa；HSV；IL [J Pract Dermatol, 2016, 9(1):12-14]

R752.11

A

1674-1293(2016)01-0012-03

10.11786/sypfbxzz.1674-1293.20160104

廣西自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（2013GXNSFAA019206）；桂林科技局公關(guān)項(xiàng)目（2013012010）

541001 桂林，桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院皮膚與性病科（王利平，魏嬌，楊鳳元，蒙堅(jiān)，羅婧瑩，程培華）；南溪山醫(yī)院皮膚科（陸富永）

王利平，醫(yī)師，研究方向：生殖器皰疹，

E-mail: 646053871@qq.com

程培華，E-mail: phchengg@163.com

（2015-08-05

2015-10-20）