邵娟，吳基良，李敏才

（湖北科技學院，湖北咸寧437100）

miR-206對高磷誘導大鼠血管平滑肌細胞鈣化的影響及機制

邵娟，吳基良，李敏才

（湖北科技學院，湖北咸寧437100）

目的 觀察微小RNA-206（miR-206）對β-甘油磷酸鈉（β-GP）誘導的大鼠血管平滑肌細胞（VSMCs）鈣化的影響，并探討其機制。方法 取原代培養(yǎng)大鼠主動脈VSMCs并進行細胞鑒定。將VSMCs隨機分為5組：空白對照組、模擬物陰性對照組、miR-206模擬物組、抑制物陰性對照組、miR-206抑制物組，用相應引物進行轉染。轉染后48 h，各組給予β-GP 10 mmol／L誘導VSMCs鈣化。誘導4 d，茜素紅染色鏡下觀察各組鈣化情況，采用微量酶標法檢測細胞堿性磷酸酶（ALP）活性，采用免疫熒光法檢測細胞縫隙連接蛋白43（Cx-43）表達。結果 VSMCs轉染后48 h，經(jīng)β-GP誘導4 d，與陰性對照組比較，miR-206模擬物組鈣化結節(jié)減少，miR-206抑制物組鈣化結節(jié)增多；與陰性對照組比較，miR-206模擬物組ALP活性及Cx43表達降低（P均＜0.05），miR-206抑制物組ALP活性及Cx43表達升高（P均＜0.05）。結論 miR-206可能通過調控Cx43表達抑制β-GP誘導的大鼠VSMCs鈣化。

微小RNA-206；β-甘油磷酸鈉；血管平滑肌細胞；鈣化；大鼠

血管鈣化是動脈粥樣硬化、糖尿病、慢性腎衰竭等疾病普遍存在的病理改變［1］。既往研究認為，血管鈣化是一個被動的鈣磷沉積于血管壁的過程；但近年來發(fā)現(xiàn)血管鈣化是一個主動的可調控的生物學過程［2］。微小RNA（miRNA）是一類由22個核苷酸組成小RNA分子［3］，通常在轉錄后調控基因表達，是近年來的研究熱點。最近研究發(fā)現(xiàn)，miR-206參與了血管平滑肌細胞（VSMCs）的功能調節(jié)和心血管系統(tǒng)疾病的進程［4］，但具體機制尚不明確。2014年12月～2015年12月，本研究以高磷誘導的大鼠VSMCs鈣化為基礎，探討miR-206對VSMC鈣化的影響及可能的機制。

1　材料與方法

1.1動物、試劑及儀器 清潔級SD雄性大鼠15只，8周齡，180～200 g，購自武漢大學實驗動物中心；DMEM／F12培養(yǎng)基（Hyclone）、FBS及Opti-MEM無血清培養(yǎng)基（Gibco）、Lipo2000（Invitrogen）、miR-206相關轉染試劑（上海吉瑪公司）；引物序列（由上海吉瑪公司合成）：miR-206模擬物上游5′-UGGAAUGUAAGGAAGUGUGUGG-3′、下游5′-ACACACUUCCUUACAUUCCAUU-3′，模擬物陰性對照上游5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′、下游5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′，miR-206抑制物序列5′-CCACACACUUCCUUACAUUCCA-3′，抑制物陰性對照序列5′-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3′；茜素紅、大鼠α-SMA抗體（Sigma）；細胞縫隙連接蛋白43（Cx-43）抗體、Runx2抗體（Abcam）；堿性磷酸酶（ALP）試劑盒（南京建成生物公司）。

1.2VSMCs培養(yǎng)及鑒定 SD大鼠麻醉后迅速取出胸主動脈移至超凈臺內，無菌條件下縱行剪開血管，用棉簽擦去內膜后剝離血管中膜并剪碎，用組織貼壁法進行原代培養(yǎng)，經(jīng)自然純化后，選取3～8代生長良好的VSMCs進行后續(xù)實驗。取第3代VSMCs以1×105／孔的密度接種于放有滅菌蓋玻片的六孔板內制作細胞爬片，待細胞貼壁生長至60%～70%融合時，去培養(yǎng)基，分別用免疫細胞熒光及化學染色法鑒定VSMCs特異性抗體α-SMA表達。經(jīng)免疫熒光染色，胞質為綠色熒光；經(jīng)免疫細胞化學染色，胞質為棕黃色，均呈陽性表達，具有VSMCs的表型特征。

1.3細胞分組與轉染 將VSMCs隨機分為5組：空白對照組、模擬物陰性對照組、miR-206模擬物組、抑制物陰性對照組、miR-206抑制物組。各組用Lipo2000按以下條件進行轉染：VSMCs以2×105／孔的密度接種于六孔板，加入不含抗生素的DMEM／F12培養(yǎng)基培養(yǎng)至細胞融合度達70%時開始轉染。各取相應引物10 μL（終濃度為100 nmol／L），另取Lipo2000 5 μL分別稀釋于Opti-MEM無血清培養(yǎng)基250 μL中，靜置5 min。將以上兩種液體輕輕混勻，室溫靜置20 min形成復合物。將復合物滴入培養(yǎng)板中并輕輕晃動，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，6 h后換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。同時轉染對照組。轉染48 h后，各組細胞給予β-GP 10 mmol／L誘導VSMCs鈣化，每2天更換1次培養(yǎng)液。經(jīng)誘導4 d，去培養(yǎng)液，D-Hanks液洗3遍，用4%多聚甲醛固定15 min，D-Hanks液再洗3遍，加入1%茜素紅室溫孵育30 min，蒸餾水沖洗、干燥，倒置顯微鏡下觀察到橘紅色結節(jié)即為鈣鹽沉積。

1.4VSMCs內ALP活性測定 經(jīng)β-GP誘導4 d，用微量酶標法檢測VSMCs內ALP活性。按試劑盒說明書進行操作，結果用BCA法測定的細胞蛋白含量予以校正。每組設3個復孔，實驗重復3次取均值。ALP活性計算公式：ALP活性（金氏單位／度（0.1 mg／mL）÷待測樣本蛋白濃度（gprot／mL）。

1.5VSMCs內Cx43表達檢測 采用免疫熒光法。β-GP誘導4 d取各組細胞，去培養(yǎng)液，加PBS洗5 min×3次，加4%多聚甲醛室溫固定30 min，PBS洗滌5 min×3次，加3%H2O2室溫避光封閉20 min，PBS洗滌5 min×3次，加0.25%TritonX-100室溫避光破膜20 min，PBS洗滌5 min×3次，加5%BSA避光封閉30 min，滴加1∶500稀釋的兔抗Cx43（用PBS替代一抗作為空白對照）于濕盒內4℃孵育過夜；取出濕盒復溫30 min，PBS洗滌5 min×3次，滴加熒光標記的二抗室溫避光孵育1 h，加入DAPI染核，用含抗熒光淬滅的封片液封片，在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。使用IPP軟件分析圖像熒光強度。取6次實驗結果平均值，并對結果進行標準化，將空白對照組熒光強度值設定為1，使用IPP軟件直接測量綠色熒光強度值作為Cx43的相對表達量

1.6統(tǒng)計學方法 采用GraphPad Prism5統(tǒng)計軟件。計量資料用±s表示，兩組比較采用t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1miR-206對高磷誘導VSMCs鈣化結節(jié)的影響

VSMCs經(jīng)β-GP誘導4 d，茜素紅染色結果顯示：與陰性對照組比較，miR-206模擬物組鈣化結節(jié)減少，miR-206抑制物組鈣化結節(jié)增多。

2.2miR-206對高磷誘導VSMCs內ALP活性及Cx43表達的影響 與陰性對照組比較，轉染miR-206模擬物組ALP活性及Cx43蛋白表達降低（P均＜0.05），而轉染miR-206抑制物組ALP活性及Cx43蛋白表達升高（P均＜0.05），見表1。

表1　各組ALP活性、Cx43表達比較（±s）

表1　各組ALP活性、Cx43表達比較（±s）

注：與模擬物陰性對照組比較，*P＜0.05；與抑制物陰性對照組比較，＃P＜0.05。

組別ALP活性（U／grot）Cx43（熒光強度）空白對照組257.62±13.051.00±0.13模擬物陰性對照組322.37±16.69169.08±11.72 miR-206模擬物組230.55±14.44*23.25±2.26*抑制物陰性對照組236.41±17.9310.91±1.27 miR-206抑制物組305.25±13.47＃211.73±18.88＃

3　討論

血管鈣化是心血管疾病致死的主要危險因素，特別是對于終末期腎病［5］。近年來，越來越多的證據(jù)表明，血管鈣化是一個類似于骨形成的主動調節(jié)過程［6］，而VSMCs轉化為成骨樣細胞在促進血管鈣化的過程中起關鍵作用［7］。VSMCs具有表型轉換潛能，在一些因子刺激下，促進VSMCs向成骨樣細胞轉化，形成動脈中膜鈣化。ALP是細胞成骨分化的早期檢測指標，通過水解有機磷酸酯，使局部無機磷含量增加，促使磷酸鈣沉積。茜素紅染色是一種經(jīng)典鈣鹽染色法，茜素紅作為一種蒽醌類衍生物，能與鈣鹽結合形成橘紅色復合物，是定性檢測鈣化的方法，可用于細胞成骨分化的晚期檢測。

最近研究發(fā)現(xiàn)，很多miRNAs（miR-125b、miR-204、miR-205、miR-30b／c、miR-133a等）均能負向調控血管平滑肌細胞鈣化過程［8～12］。本研究結果表明，VSMCs轉染miR-206 mimics后48 h，經(jīng)β-GP誘導4 d，與陰性對照組相比，ALP活性和鈣化結節(jié)數(shù)目明顯減少；而轉染miR-206抑制物，與對照組相比，ALP活性和鈣化結節(jié)數(shù)目均增加。表明miR-206可負向調控VSMCs成骨樣分化，與以上文獻報道一致。

縫隙連接是存在于相鄰細胞間的膜通道結構，基本組成單位是Cx［13］。在心血管系統(tǒng)中，心肌細胞及VSMCs間存在著豐富的縫隙連接，主要表達產物為Cx43。Cx43也是成骨細胞中主要連接蛋白，為細胞骨化重要標記物之一。如小鼠基因敲除Cx43后，內皮素不能有效誘導細胞的骨化［11］，說明Cx43在骨基質合成、分泌和礦化中起重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，瞬時轉染miR-206 mimics導致Cx43表達下調，而轉染miR-206 inhibitor可以上調Cx43表達，提示miR-206可以負向調控Cx43表達。這與文獻［15］報道m(xù)iR-206負向調節(jié)Cx43表達，抑制C2C12細胞成骨分化過程相一致。

綜上所述，上調miR-206表達能抑制高磷誘導的大鼠VSMCs鈣化，其作用機制可能與miR-206抑制Cx43表達有關。可為臨床治療血管鈣化提供一個新的靶點。而Cx43具體通過何種途徑調控VSMCs發(fā)生成骨樣分化及miR-206是否通過其他途徑調控VSMCs鈣化尚需更進一步深入研究。

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Effect of miR-206 on high phosphorus-induced calcification in rat vascular smooth muscle cells

SHAO Juan，WU Jiliang，LI Mincai

（Hubei University of Science and Technology，Xianning 437100，China）

Objective To investigate the effect of microRNA-206（miR-206）on β-glycerophosphate（β-GP）-induced calcification in rat vascular smooth muscle cells（VSMCs）.Methods Aortal VSMCs were primarily cultured and identified in vitro.VSMCs were divided into five groups：control group，mimics negative control group，miR-206 mimic group，inhibitor negative control group and miR-206 inhibitor group.Each group was transfected by lipofectamine2000.After 48-hour transfection，each group was stimulated with 10 mmol／Lβ-GP to induce calcification of VSMCs.Observing calcium deposition with Alizarin red staining while detecting the alkaline phosphate（ALP）activity and the expression of connexin 43（Cx-43）respectively by Trace enzyme standard method and immunofluorescence method after induction for 4 days.Results After transfection 48 h，VSMCs were treated with β-GP for 4 days.Compared with the negative control group，the calcium deposition decreased in the miR-206 mimic group and increased in the miR-206 inhibitor group；the ALP activity and the expression of Cx43 decreased in the miR-206 mimic group and increased in the miR-206 inhibitor group（all P＜0.05）.Conclusions miR-206 may inhibit β-GP-induced calcification of VSMCs by regulating Cx43.

microRNA-206：β-glycerophosphate；vascular smooth muscle cells；calcification；rats

10.3969／j.issn.1002-266X.2016.21.004

R543

A

1002-266X（2016）21-0010-03

國家自然科學基金資助項目（81270355）；湖北省自然科學基金資助項目（2014CFB211）。

邵娟（1988-），女，在讀碩士，主要研究方向為動脈粥樣硬化血管鈣化的機制。E-mail：juanshaobhgs＠163.com

簡介：李敏才（1974-），男，副教授，博士，主要研究方向為心血管病理。E-mail：mincaili＠163.com

（2016-02-20）