董愛文，姚姝鳳，許新軍，成 江

（吉首大學 林產(chǎn)化工工程湖南省重點實驗室，湖南 張家界 427000）

虎杖果實中白藜蘆醇與大黃素提取工藝優(yōu)化及其與3 類根莖含量比較

董愛文，姚姝鳳，許新軍，成 江

（吉首大學 林產(chǎn)化工工程湖南省重點實驗室，湖南 張家界 427000）

目的：研究虎杖果實中白藜蘆醇與大黃素提取工藝，比較其果實與雄株、未結(jié)果雌株、結(jié)果雌株3 類根莖中白藜蘆醇與大黃素得率。方法：采用高效液相色譜法測定其果實與3 類根莖中白藜蘆醇與大黃素含量，確定果實中白藜蘆醇與大黃素提取的溶劑與方法，采用正交試驗法考察微波火力檔、溶劑體積分數(shù)、料液比及提取時間對提取工藝的影響，確定微波輔助提取的最佳提取工藝，比較虎杖果實、3 類根莖中二者得率。結(jié)果：正交試驗與方差分析得出果實中白藜蘆醇與大黃素的最佳提取條件為乙醇體積分數(shù)70%、料液比1∶20（g/mL）、額定功率800 W微波爐先40火力處理3 min冷卻后60火力處理3 min、提取時間6 min，高效液相色譜法測得虎杖雄株、未結(jié)果雌株根莖中的白藜蘆醇與大黃素得率均高于結(jié)果雌株根莖及果實，果實及3 類根莖中白藜蘆醇與大黃素得率均超過《中國藥典》（2010）規(guī)定值，提取工藝合理、穩(wěn)定、可行，虎杖果實具備開發(fā)利用的價值。

虎杖；白藜蘆醇；大黃素；提取工藝；高效液相色譜

虎杖（Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.）為蓼科蓼屬的雌雄異株植物，又名酸湯桿[1]，其根莖為傳統(tǒng)中藥，具有活血、定痛、清熱利濕、止咳化痰等作用[2-3]，其活性成分主要有白藜蘆醇為代表的二苯乙烯類與大黃素為代表的蒽醌類。白藜蘆醇具有降血脂、抗腫瘤、促進健康和延長生命等多種生物活性[4-6]，白藜蘆醇是典型的第三代保健食品原料之一[7-8]，此外還主要用作膳食補充劑[9]。日本率先將從植物中提取的白藜蘆醇作為食品添加劑使用，在美國、加拿大和我國都已有與白藜蘆醇相關(guān)的保健品[10]，大黃素具有抗病毒、抑菌、擴張血管及利尿等多種作用[11-13]。目前國內(nèi)外對虎杖中白藜蘆醇與大黃素等活性成分研究主要針對的是其干燥根莖及根[14-17]，甚至是其雄株、未結(jié)果雌株與結(jié)果雌株的混合根莖，鮮見從虎杖果實中提取白藜蘆醇與大黃素，分析檢測虎杖果實、雄株、未結(jié)果雌株與結(jié)果雌株根莖中二者含量的報道。因此本實驗對虎杖果實中白藜蘆醇與大黃素的最佳提取工藝進行研究并比較分類根莖中白藜蘆醇與大黃素含量，旨在為虎杖的合理栽培與采收提供科學依據(jù)，并將虎杖果實開發(fā)成為食品添加劑及保健品原料資源提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

虎杖果實、3 a生的虎杖雄株、未結(jié)果雌株、結(jié)果雌株的根莖均采自吉首大學張家界校區(qū)后山植物園，50 ℃烘干，粉碎過50 目篩，陰涼與干燥處避光保存?zhèn)溆?。白藜蘆醇（自制，純度≥99%） 林產(chǎn)化工工程湖南省重點實驗室；大黃素（純度≥98%）標準品 中國食品藥品檢定研究院；高效液相色譜檢測用甲醇、乙腈均為國產(chǎn)色譜純；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

LC-20A高效液相色譜儀、AEG-200萬分之一天平、DP-41真空干燥干燥箱 日本島津公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇金城國際實驗儀器廠；RE-5205旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上海亞榮生化儀器廠；KQ-250E超聲波清洗儀 昆山市超聲儀器有限公司；D8023CTC-K4家用微波爐（額定功率800 W） 格蘭仕微波電器有限公司；HY-6A空氣浴搖床 江蘇金壇市儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液制備

1.3.1.1 標準溶液的配制

稱取白藜蘆醇標準品0.003 0 g，用無水乙醇溶解后定容于50 mL容量瓶中，制成59.4 μg/mL標準溶液。稱取純度不小于98%大黃素標準品0.003 0 g，用無水乙醇溶解后定容于50 mL容量瓶中，制成58.8 μg/mL標準溶液，兩標準溶液均避光冷藏備用。

1.3.1.2 樣品溶液的制備

取虎杖3 類根莖與果實樣品粉末各約1.500 0 g，3 類根莖樣品制備參照文獻[18-20]，果實按選擇的最佳提取條件提取，經(jīng)處理后各提取液均蒸去溶劑，置于100 mL量瓶中，用適量無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，用 0.45 μm濾膜濾過，即得。

1.3.2 色譜條件

白藜蘆醇：色譜柱Hypersil BDS C18（4.6 mm× 200 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.05%磷酸（30∶70，V/V）；檢測波長306 nm；流速1.0 mL/min；柱溫24 ℃；進樣量20 μL；保留時間5.860 min；柱壓7.0 MPa。

大黃素：色譜柱Hypersil BDS C18（4.6 mm× 200 mm，5 μm）；流動相：甲醇；檢測波長254 nm；流速0.6 mL/min；柱溫26 ℃；進樣量20 μL；保留時間5.211 min；柱壓2.2 MPa。

1.3.3 方法學考察

1.3.3.1 線性關(guān)系

精密量取0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL已配制好的2 種標準溶液分置50 mL容量瓶中，加入無水乙醇定容至刻度，搖勻，用0.45 μm濾膜過濾，分別吸取20 μL，注入高效液相色譜儀（進樣3 次），按1.3.2節(jié)色譜條件測定，記錄色譜圖并以平均峰面積積分值為縱坐標，溶液質(zhì)量濃度為橫坐標，繪制相應標準曲線，并計算其回歸方程與相關(guān)系數(shù)。

1.3.3.2 精密度

精密量取白藜蘆醇與大黃素標準溶液各5 mL，加入無水乙醇定容至50 mL，按1.3.2節(jié)條件分別進樣20 μL測定其峰面積，重復6 次，計算其相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）。

1.3.3.3 穩(wěn)定性

分別在0、2、4、6、8、10、12 h時取1.3.1.2節(jié)實驗溶液，按1.3.2節(jié)條件分別進樣20 μL，測定峰面積，計算其各自的RSD。

1.3.3.4 重復性

精密量取1.3.1.2節(jié)中的果實供試溶液6 份，按1.3.2節(jié)條件分別進樣20 μL，測定峰面積并進行回歸計算，求出平均含量與其RSD。

1.3.3.5 加樣回收率

稱取已處理貯藏的虎杖果粉1.500 0 g共12 份（白藜蘆醇與大黃素各平行6 份），分別加入0.001 0 g的白藜蘆醇與大黃素標準品，按果實供試液制備方法進行制備，按1.3.2節(jié)條件進行測定并回歸計算得出回收率。

1.3.4 正交試驗

根據(jù)前期單因素試驗所選出乙醇體積分數(shù)、料液比（g/mL）、提取時間、火力檔（表示微波爐磁控管間斷工作時間分配）范圍，以白藜蘆醇、大黃素得率為指標，選用L16（44）正交試驗表，試驗因素與水平設計見表1。

表1 正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels used for orthogonal array design

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑的確定

稱取已處理虎杖果粉1.500 0 g（15 份，分成5 組），分置具塞錐形瓶中，按組分別加入水、甲醇、乙醇、乙酸乙脂、氯仿，使料液比為1∶30，于50 ℃條件下恒溫水浴提取60 min，抽濾，濾液經(jīng)處理后蒸去溶劑，置于100 mL量瓶中，用適量無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm濾膜濾過，按1.3.2節(jié)各自色譜條件進樣20 μL測定峰面積并回歸計算，平均得率結(jié)果見表2。

表2 不同溶劑的提取得率(n = 3)Table 2 Extraction effi ciencies of different solvents (n = 3) %

由表2可知，甲醇作為溶媒時白藜蘆醇與大黃素的得率均較大，但乙醇與之相差不大，考慮到甲醇的毒性較大，故選擇乙醇作為白藜蘆醇與大黃素共同的提取溶劑。

2.2 提取方法的確定

稱取已處理虎杖果粉1.500 0 g（12 份，分成4 組），分置具塞錐形瓶中，按料液比1∶30加入乙醇，按組用水浴法、加熱回流法、超聲波輔助法與微波輔助法進行提取，抽濾，濾液經(jīng)處理后蒸去溶劑，置于100 mL量瓶中，用適量無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm濾膜濾過，按1.3.2節(jié)各自色譜條件進樣20 μL測定峰面積并回歸計算，平均得率結(jié)果見表3。

表3 不同提取方法提取得率（= 3)Table 3 Extraction effi ciencies of different methods (n = 3) %

由表3可知，微波輔助提取法較其他3 種方法從虎杖果實中提取白藜蘆醇與大黃素的得率要高，且該方法還能縮短提取時間，因此本研究選擇微波輔助提取法作為虎杖果實中白藜蘆醇與大黃素的提取方法。

2.3 方法學考察結(jié)果

圖1 白藜蘆醇（a）與大黃素（b）標準品高效液相色譜峰Fig. 1 HPLC profi les of resveratrol standard (a) and emodin standard (b)

圖1 為2 種標準品的高效液相色譜，根據(jù)標準曲線計算得白藜蘆醇的回歸方程為Y=144 160X+10076，R=0.999 7；大黃素的回歸方程為Y=98 079X+9 152，R=0.999 6。結(jié)果表明，白藜蘆醇在0～5.940 μg/mL范圍內(nèi)具有良好線性關(guān)系，大黃素在0～5.880 μg/mL范圍內(nèi)具有良好線性關(guān)系。

精密度檢測得白藜蘆醇與大黃素標準品的平均峰面積的RSD分別為0.17%和0.12%，表明儀器檢測的誤差小精度高。穩(wěn)定性檢測得果實中白藜蘆醇與大黃素峰面積的RSD分別為3.68%和0.12%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。重復性實驗得到果實中白藜蘆醇與大黃素的平均含量為0.424%和1.237%，RSD分別為0.64%和0.11%。加樣回收率實驗結(jié)果見表4、5。

表4 白藜蘆醇回收率檢測結(jié)果Table 4 Recovery of resveratrol in spiked samples

表5 大黃素回收率檢測結(jié)果Table 5 Recovery of emodin in spiked samples

2.4 正交試驗設計及結(jié)果

表7 白藜蘆醇得率正交試驗方差分析Table 7 Analysis of variance for resveratrol extraction yield

表8 大黃素得率正交試驗方差分析Table 8 Analysis of variance for emodin extraction yield

由表6可知，微波輔助提取虎杖果實中白藜蘆醇、大黃素的條件一致，各因素中起主導作用的是火力檔，其次是乙醇體積分數(shù)、料液比，提取時間影響最小，最佳工藝條件組合為（A3B1C1D4），即40～60火力（先40火力處理3 min后60火力處理3 min）、乙醇體積分數(shù)70%、料液比1∶20、提取時間6 min。由表8、9可知，火力檔對白藜蘆醇與大黃素的提取效果影響最顯著，乙醇體積分數(shù)影響也較顯著，料液比與提取時間對提取效果影響較小。

2.5 驗證實驗結(jié)果

由于A3B1C1D4條件的實驗未在正交表中，為驗證上述結(jié)果的準確性，保證提取工藝的合理可行，分3 次取已處理虎杖果粉各1.500 0 g，按上述已確定最佳工藝條件，進行驗證實驗并記錄色譜圖（圖2），結(jié)果顯示，白藜蘆醇與大黃素的平均得率為0.432%與1.415%。

圖2 樣品溶液白藜蘆醇（a）和大黃素（b）高效液相圖譜Fig. 2 HPLC profi les of resveratrol and emodin extracted from Polygonum cuspidatum

表9 虎杖3 類根莖與果實中白藜蘆醇與大黃素得率Table 9 Comparison of the contents of of resveratrol and emodin in three types of rhizomes and fruits %

如表9所示，3 類根莖及果實中白藜蘆醇與大黃素得率存在較大差異，且3 a生結(jié)果雌株的根莖中白藜蘆醇與大黃素得率明顯低于其他2 類根莖，3 類根莖及果實均高于《中國藥典》（2010）[2]中規(guī)定含量（0.15%與0.60%），表明該工藝穩(wěn)定、合理、可為果實中白藜蘆醇與大黃素的生產(chǎn)開發(fā)提供理論依據(jù)。

3 討 論

文獻[21-23]表明，虎杖中白藜蘆醇與大黃素的提取都是以虎杖干燥根莖及根作為原料，本實驗以虎杖果實中白藜蘆醇與大黃素的提取溶劑與方法及最佳提取工藝作為考察指標，比較了虎杖果實、3 a生雄株、未結(jié)果雌株、結(jié)果雌株的根莖中白藜蘆醇與大黃素得率差異，結(jié)果3 類根莖及果實中白藜蘆醇與大黃素的得率存在較大差異，且3 a生結(jié)果雌株的根莖中白藜蘆醇與大黃素得率明顯低于其他兩類根莖，但三者均高于《中國藥典》（2010）[2]中規(guī)定值（0.15%與0.60%），這也與藥農(nóng)采收藥用虎杖往往以3 a為一個生產(chǎn)周期相吻合[19]。因此以3 a為采收期藥用虎杖最好能雌雄隔離栽培?；⒄裙麑嵵邪邹继J醇與大黃素得率也明顯高于《中國藥典》（2010）[2]中所規(guī)定值，因此虎杖果實具備開發(fā)利用的潛能。由于白藜蘆醇可以被用作添加劑加到藥品、酒類或化妝品中，作為一種新型美容保健品以延緩人的衰老，保持肌膚水分，祛除瘡類、黃褐斑等[24]，還被運用到某些酒類中，且白藜蘆醇的含量高低也成為許多廠家檢測酒類品質(zhì)的重要標準之一[25]。因此利用虎杖果實中白藜蘆醇與大黃素含量高及其所含的營養(yǎng)成分開發(fā)保健食品及食品添加劑很有開發(fā)前景，也為多年生長虎杖的栽培和開發(fā)利用提供新的思路。

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Optimization of Simultaneous Extraction of Resveratrol and Emodin from Fruits of Polygonum cuspidatum and Comparison of Their Contents with Those of Rhizomes of Male and Female Plants

DONG Aiwen, YAO Shufeng, XU Xinjun, CHENG Jiang
(Key Laboratory of Hunan Forest Products and Chemical Industry Engineering, Jishou University, Zhangjiajie 427000, China)

Objective: To investigate the simultaneous extraction of resveratrol and emodin from the fruits of Polygonum cuspidatum and to compare their contents with those of the rhizomes of male, non-bearing and bearing female plants. Methods: High performance liquid chromatography (HPLC) was used to determine the contents of resveratrol and emodin. The microwave-assisted extraction of resveratrol and emodin was carried out using aqueous ethanol as extraction solvent. Microwave fi repower, ethanol concentration, solid-to-solvent ratio and extraction time, all of which were found to infl uence extraction effi ciency, were optimized by using orthogonal array experiments. Comparison of the contents of resveratrol and emodin in the fruits and rhizomes of Polygonum cuspidatum was performed. Results: The optimal extraction conditions were obtained as follows: ethanol concentration, 70% (V/V); solid-to-solvent ratio, 1:20 (g/mL); microwave power, 800 W; microwave irradiation for 3 min at fi repower 40 and for additional 3 min at fi repower 60 after cooling; and extraction time, 6 min. The contents of resveratrol and emodin in the rhizomes of male and non-bearing female plants were signifi cantly higher than those of the rhizomes of female plants and fruits of Polygonum cuspidatum, and all these values exceeded those specifi ed in the Chinese Pharmacopoeia. The extraction process presented in this study was reasonable, stable and feasible. Differences in the contents of resveratrol and emodin existed among three types of rhizomes and fruits of P. cuspidatum. However, the fruit has the potential for development and utilization.

Polygonum cuspidatum; resveratrol; emodin; extraction process; HPLC

10.7506/spkx1002-6630-201610003

R286.022

A

1002-6630（2016）10-0012-05

董愛文, 姚姝鳳, 許新軍, 等. 虎杖果實中白藜蘆醇與大黃素提取工藝優(yōu)化及其與3 類根莖含量比較[J]. 食品科學, 2016, 37(10): 12-16. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201610003. http://www.spkx.net.cn

DONG Aiwen, YAO Shufeng, XU Xinjun, et al. Optimization of simultaneous extraction of resveratrol and emodin from fruits of Polygonum cuspidatum and comparison of their contents with those of rhizomes of male and female plants[J]. Food Science, 2016, 37(10): 12-16. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201610003. http://www.spkx.net.cn

2015-08-15

國家自然科學基金地區(qū)科學基金項目（31260634）；林產(chǎn)化工工程湖南省重點實驗室開放項目（JDZ201404）；張家界市科技計劃項目（2015FJ1149）；吉首大學校級科研項目（15JDY018）

董愛文（1967—），男，研究員，碩士，研究方向為植物活性成分與食品營養(yǎng)。E-mail：daw1999@163.com