蓋智星，賀明陽,2,3，曾小峰，黃小蘭，王日葵,2,3,*，周 煉,2,3，韓 冷,2,3

（1.西南大學(xué)柑桔研究所，重慶 400712；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所，重慶 400712；3.國(guó)家柑桔工程技術(shù)研究中心，重慶 400712）

采后柑橘與膠孢炭疽菌互作過程中果皮成分的動(dòng)態(tài)變化

蓋智星1，賀明陽1,2,3，曾小峰1，黃小蘭1，王日葵1,2,3,*，周 煉1,2,3，韓 冷1,2,3

（1.西南大學(xué)柑桔研究所，重慶 400712；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所，重慶 400712；3.國(guó)家柑桔工程技術(shù)研究中心，重慶 400712）

目的：探究柑橘膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）侵染過程中柑橘果皮細(xì)胞壁降解相關(guān)酶（cell wall degrading enzymes，CWDEs）、細(xì)胞壁成分和防御相關(guān)酶活性的動(dòng)態(tài)變化，為進(jìn)一步研究膠孢炭疽菌致病機(jī)理提供理論參考。方法：柑橘果實(shí)接種膠孢炭疽菌后，不同培養(yǎng)時(shí)間取樣測(cè)定，并比較分析果皮成分變化。結(jié)果：膠孢炭疽菌侵染的柑橘組織中均能產(chǎn)生多聚半乳糖醛酸酶（PG）、果膠甲基半乳糖醛酸酶（PMG）、纖維素酶（Cx）、β-葡萄糖苷酶（β-Glu）、角質(zhì)酶，且均在侵染前期（1～3 d）達(dá)到峰值。纖維素、半纖維素、果膠等細(xì)胞壁組分含量隨膠孢炭疽菌的侵染而降低，木質(zhì)素含量隨膠孢炭疽菌的侵染而升高。膠孢炭疽菌侵染后，柑橘組織中的過氧化物酶（POD）活性、過氧化氫酶（CAT）活性、丙二醛（MDA）含量總體呈上升趨勢(shì)。結(jié)論： CWDEs和角質(zhì)酶在炭疽病發(fā)病前期起到重要的致病作用，其對(duì)果皮細(xì)胞壁組分的降解加速了膠孢炭疽菌的侵入；另外膠孢炭疽菌的侵染加速了寄主細(xì)胞質(zhì)膜的過氧化。

柑橘；膠孢炭疽菌；細(xì)胞壁降解酶；細(xì)胞壁成分；防御酶

柑橘是世界第一大水果，年產(chǎn)量高達(dá)1億 t。我國(guó)是世界柑橘生產(chǎn)第一大國(guó)，2013年柑橘產(chǎn)量達(dá)3 276萬 t。柑橘采后易受真菌侵害，造成大量腐爛[1]，導(dǎo)致巨大經(jīng)濟(jì)損失。炭疽病是貯藏期柑橘重要的真菌病害之一，分布廣泛。引起柑橘炭疽病的病原有兩種：膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）和尖孢炭疽菌（Colletotrichum acutatum），柑橘采后炭疽病主要是由膠孢炭疽菌引起[2]，因此以膠孢炭疽菌為研究對(duì)象，探究其與柑橘果實(shí)互作過程中的致病機(jī)制具有重要的理論和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

目前國(guó)內(nèi)對(duì)炭疽病的研究多集中于病原菌的鑒定分類[3-5]與病害防治方面[6-7]，國(guó)外對(duì)炭疽病防治[8-10]及炭疽菌致病機(jī)理[11-12]的報(bào)道較多。細(xì)胞壁降解酶（cell wall degrading enzymes，CWDEs）是植物病原菌的主要致病因子之一，其在不同寄主-病原物互作中所產(chǎn)生的種類、時(shí)期和活性均存在差異[13]。Jorge等[14]報(bào)道尖孢鐮刀菌分泌的細(xì)胞壁降解酶與枯萎病的發(fā)展呈正相關(guān)，分泌的主要細(xì)胞壁降解酶為多聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase，PG）和果膠裂解酶。Jat等[15]對(duì)侵染香蕉的膠孢炭疽菌細(xì)胞壁降解酶的分泌情況進(jìn)行了報(bào)道，研究發(fā)現(xiàn)起主要作用的為多聚半乳糖醛酸反式消除酶和PG。檀根甲[16]初步明確果膠甲基半乳糖醛酸酶（polymethyl galacturonase，PMG）和纖維素酶（carboxymethyl cellulose，Cx）在炭疽菌侵染蘋果過程中起關(guān)鍵作用。寄主抵抗致病菌侵染的過程中分泌的防御酶通過清除活性氧，從而減緩寄主細(xì)胞的過氧化。Cao Shifeng等[17]報(bào)道過氧化氫酶（catalase，CAT）與采后枇杷果實(shí)的的抗病性有重要關(guān)系。Rockenbach等[18]運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法對(duì)蘋果在膠孢炭疽菌侵染過程中的防御應(yīng)答進(jìn)行了研究，其中清除活性氧過程中的相關(guān)蛋白檢出較多。李欣允等[19]報(bào)道炭疽菌的侵染可加速荔枝果實(shí)氧化和過氧化作用進(jìn)程，從而加速衰老和劣變。鑒于細(xì)胞壁降解酶與防御酶在不同寄主-病原物互作中其產(chǎn)生的時(shí)期和活性均存在差異，且柑橘炭疽菌侵染柑橘果實(shí)引起的細(xì)胞壁降解酶和防御相關(guān)酶活變化還不清楚，因此本實(shí)驗(yàn)通過探討柑橘與膠孢炭疽菌互作過程中細(xì)胞壁降解酶、細(xì)胞壁組分及防御酶的變化規(guī)律，明確互作過程中主要細(xì)胞壁降解酶與防御酶的時(shí)空表達(dá)，以更加全面地理解柑橘與膠孢炭疽菌的相互作用，從而為柑橘炭疽病的防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試柑橘：北碚447#錦橙，購買于重慶市北碚區(qū)；供試病原菌：柑橘膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides），由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所綜防課題組提供。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-1F超凈工作臺(tái) 江蘇蘇凈集團(tuán)；BX34光學(xué)顯微鏡 日本Olympus公司；RXZ-260C氣候培養(yǎng)箱寧波東南儀器公司；LDZX-50FBS高壓滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械公司；TU-1901雙管束紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器公司；H1850R高速冷凍離心機(jī)湖南湘儀集團(tuán)。

1.3 方法

1.3.1 材料處理

選擇成熟度相近、外觀整齊、無機(jī)械損傷的錦橙果實(shí)，清洗后晾干備用。膠孢炭疽菌接種于馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)10 d后將孢子刮下，制成濃度為2×106spores/mL孢子懸浮液。使用75%酒精對(duì)接種點(diǎn)處進(jìn)行消毒，晾干。采用長(zhǎng)度為2 mm的12號(hào)針頭針刺接種點(diǎn)，滴加10 μL現(xiàn)配孢子懸浮液，對(duì)照組滴加等量無菌水。所有材料處理后放入托盤內(nèi)，盤底鋪浸潤(rùn)的脫脂棉覆上保鮮膜，擺放好后，托盤口覆上保鮮膜，并置于28 ℃相對(duì)濕度95%的培養(yǎng)箱。接種后分別在不同時(shí)間取接種部位組織，經(jīng)液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱備用。

1.3.2 細(xì)胞壁降解酶活性的測(cè)定

參照曹建康等[20]的方法測(cè)定。PG與PMG活性單位以每小時(shí)每克樣品在37 ℃催化底物水解生成半乳糖醛酸的質(zhì)量表示（mg/（h·g））；Cx與β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase，β-Glu）的酶活單位以每小時(shí)每克樣品在37 ℃催化底物水解生成還原糖的質(zhì)量表示。

1.3.3 角質(zhì)酶活性的測(cè)定

參照孫媛[21]的方法測(cè)定。以每克鮮樣每分鐘產(chǎn)生對(duì)硝基酚的微克數(shù)定義為1 個(gè)酶活力單位U。

1.3.4 過氧化物酶（peroxidase，POD）活性的測(cè)定

采用愈創(chuàng)木酚法[22]。以每克樣品每分鐘吸光度變化（ΔA470nm）0.01為一個(gè)過氧化物酶活力單位。

1.3.5 超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性的測(cè)定

采用對(duì)氮藍(lán)四唑光還原法[22]。以每小時(shí)每克果蔬組

織的反應(yīng)體系對(duì)氮藍(lán)四唑光化還原反應(yīng)的抑制為50%為一個(gè)SOD活性單位（即U/（g·h））。

1.3.6 CAT活性的測(cè)定

采用高錳酸鉀滴定法[22]。CAT活性以每克果蔬組織每分鐘分解H2O2的毫克數(shù)表示。

1.3.7 丙二醛（malonaldehyde，MDA）含量的測(cè)定

參照王學(xué)奎[22]的方法測(cè)定。

1.3.8 纖維素、半纖維素與木質(zhì)素含量的測(cè)定

參照李春光等[23]的方法測(cè)定。

1.3.9 可溶性果膠與原果膠含量的測(cè)定

參照曹建康等[20]的方法并改進(jìn)。準(zhǔn)確稱取烘干樣品0.10 g進(jìn)行測(cè)定，果膠含量以生成半乳糖醛酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 膠孢炭疽菌侵染對(duì)柑橘果實(shí)細(xì)胞壁降解酶的影響

圖1 膠孢炭疽菌侵染后柑橘果皮組織PG（A）、PMG（B）、Cx（C）、β-Glu（D）活性的變化Fig. 1 Changes in the activities of PG (A), PMG (B), Cx (C) and β-Glu (D) in citrus tissue infected with C. gloeosporioides

從圖1A可看出，膠孢炭疽菌侵染柑橘果實(shí)后1～7 d內(nèi)PG活性普遍高于對(duì)照，且整體呈先升后降的趨勢(shì)；在第2天被侵染的柑橘組織PG活性達(dá)到最大值，約為對(duì)照的8.65 倍。在整個(gè)培養(yǎng)過程中，對(duì)照組織PG活性相對(duì)穩(wěn)定。被膠孢炭疽菌侵染的柑橘組織在1～4 d內(nèi)PMG活性明顯高于對(duì)照，且第2天達(dá)到峰值，約為對(duì)照的18.5 倍，3～7 d內(nèi)侵染組織PMG活性波動(dòng)較小。對(duì)照組中PMG活性在第2天出現(xiàn)最低突變點(diǎn)，表明針刺損傷對(duì)果實(shí)PMG活性的影響較大，果實(shí)通過降低分泌PMG從而減少果膠物質(zhì)的水解（圖1B）。

Cx與β-Glu共同作用將纖維素水解為β-葡萄糖。如圖1C所示，發(fā)病組織的Cx活性普遍高于對(duì)照組，且大體呈上升趨勢(shì)，在第1天達(dá)到最大值。由圖1D可知，發(fā)病組織的β-Glu活性普遍高于對(duì)照組。侵染前期β-Glu活性在第2天達(dá)到峰值，3～7 d呈逐步上升趨勢(shì)。2、7 d接種組織β-Glu活性分別高于對(duì)照102.74%、117.78%。β-Glu活性高峰出現(xiàn)時(shí)間晚于Cx，這可能是由于Cx在初期對(duì)纖維素大分子進(jìn)行降解，為β-Glu提供底物[13]。

圖2 膠孢炭疽菌侵染后柑橘果皮組織角質(zhì)酶活性的變化Fig. 2 Changes in cutinase activities of citrus tissue infected with C. gloeosporioides

圖2 表明，膠孢炭疽菌侵染過程中柑橘果皮角質(zhì)酶活性整體高于對(duì)照，并在第3天達(dá)到高峰，在4～7 d呈逐步上升趨勢(shì)。3、7 d接種組織角質(zhì)酶活性分別高于對(duì)照48.55%、50.28%。對(duì)照組角質(zhì)酶活性雖然在第4天略高于實(shí)驗(yàn)組，但總體呈下降趨勢(shì)。實(shí)驗(yàn)表明角質(zhì)酶的活性范圍為15～35 U/（g·min），這與孫媛[21]對(duì)灰葡萄孢角質(zhì)酶的報(bào)道相似。膠孢炭疽菌侵染寄主過程中，角質(zhì)酶活性出現(xiàn)高峰較CWDEs晚，這與病原菌侵入寄主的階段相符合。

圖3 膠孢炭疽菌侵染的柑橘果皮組織中細(xì)胞壁降解酶活性的比較Fig. 3 The activities of cell wall-degrading-enzymes in citrus tissue infected with C. gloeosporioides

如圖3所示，柑橘果皮本身含有少量的細(xì)胞壁降解酶，其中PG與Cx含量稍高。隨著接種時(shí)間的延長(zhǎng)，柑橘果皮產(chǎn)生細(xì)胞壁降解酶的活性從高到低依次為PG、PMG、Cx、β-Glu，其中PG活性明顯高于其余3 種酶，這與Jat等[15]研究膠孢炭疽菌對(duì)香蕉致病作用的結(jié)果一致。趙景楠等[24]研究發(fā)現(xiàn)草莓褐色葉斑病菌產(chǎn)生的CWDEs中PG活性最強(qiáng)，但該菌并不產(chǎn)生Cx。檀根甲[16]研究發(fā)現(xiàn)炭疽菌侵染蘋果過程中，起關(guān)鍵作用的酶為PMG與Cx?？梢姴煌闹虏【?寄主互作過程中起關(guān)鍵作用的CWDEs種類存在差異。寄主-致病菌互作過程中該4種細(xì)胞壁降解酶均呈現(xiàn)先上升后下降，隨后又呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。其中Cx活性在第1天達(dá)到峰值，PG、PMG與β-Glu活性在第2天達(dá)到峰值，表明Cx對(duì)柑橘組織細(xì)胞壁的降解作用要早于其余3 種酶，然而有研究[16]發(fā)現(xiàn)炭疽菌與蘋果互作過程中PMG活性表達(dá)在時(shí)間上早于Cx，這可能與寄主表皮成分的差異有關(guān)。

2.2 膠孢炭疽菌侵染對(duì)柑橘果皮細(xì)胞壁組分的影響

圖4 膠孢炭疽菌侵染后柑橘果皮細(xì)胞壁組分的變化Fig. 4 Changes in cell wall components of citrus pericarp infected with C. gloeosporioides

如圖4A所示，實(shí)驗(yàn)組可溶性果膠的含量呈先升高后降低的趨勢(shì)，并在接種第2天達(dá)到峰值，而對(duì)照組的可溶性果膠含量呈現(xiàn)一直上升的趨勢(shì)。膠孢炭疽菌侵染過程中，原果膠與總果膠的含量均呈下降趨勢(shì)（圖4B、 4C），這可能與Cx與果膠酶的共同作用相關(guān)。原果膠是果膠物質(zhì)與纖維素結(jié)合后的存在狀態(tài)，這種結(jié)合態(tài)在Cx與果膠酶的共同作用下分離，從而使得可溶性果膠的含量在接種1～2 d內(nèi)迅速升高，而后可溶性果膠由果膠酶水解，因此總果膠的含量在第2天有小幅度升高后明顯降低。對(duì)照組原果膠與總果膠的含量均呈先升高后降低的趨勢(shì)，并在培養(yǎng)第4天達(dá)到峰值，這可能與針刺損傷引起的果實(shí)自我修復(fù)有關(guān)。

如圖4D所示，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的纖維素含量呈先升高后降低的趨勢(shì)。膠孢炭疽菌侵染柑橘果實(shí)1～2 d間，纖維素迅速合成，纖維素含量迅速增加，4～7 d纖維素逐漸被降解，含量下降。對(duì)照組纖維素含量在2～4 d有上升趨勢(shì)，4～7 d呈下降趨勢(shì)。膠孢炭疽菌侵染過程中半纖維素含量呈先下降后上升的趨勢(shì)，并且在接種第2天迅速跌入低谷，這可能與Cx活性在第1天達(dá)到峰值有關(guān)（圖4E）。

木質(zhì)素是重要的植物抗病物質(zhì)之一。膠孢炭疽菌侵染過程中柑橘果皮木質(zhì)素含量呈上升趨勢(shì)，而對(duì)照組木質(zhì)素含量變化較為平穩(wěn)。接菌第7天木質(zhì)素含量為7.916%，為對(duì)照組的1.59 倍（圖4F）。在炭疽病發(fā)病初期木質(zhì)素與纖維素的合成增加，病斑硬化；隨著細(xì)胞壁降解酶的作用，纖維素及果膠物質(zhì)等被逐步降解，使得組織軟化，病斑擴(kuò)大。

2.3 膠孢炭疽菌侵染對(duì)柑橘組織膜脂過氧化的影響

圖5 膠孢炭疽菌侵染后柑橘組織POD（A）、SOD（B）、CAT（C）活性與MDA含量（D）的變化Fig. 5 Changes in POD (A), SOD (B) and CAT (C) activities and MDA content (D) of citrus tissue infected with C. gloeosporioides

如圖5A所示，膠孢炭疽菌侵染后柑橘組織POD活性總體呈上升趨勢(shì)，在接種1～2 d上升速度最快。由圖5B可知，膠孢炭疽菌侵染后柑橘組織SOD活性總體呈下降趨勢(shì)，在接種第4天后迅速升高，此處SOD活性為119.221 U/（g·h）。接種第7天柑橘組織SOD活性最高，為172.528U/（g·h）。CAT屬于血紅蛋白酶，可以催化植物體內(nèi)積累的H2O2分解，從而減少H2O2對(duì)果蔬組織的氧化傷害。圖5C表明，膠孢炭疽菌侵染柑橘過程中，CAT活性整體呈上升趨勢(shì)。其中1～2 d上升迅速，由0.043 mg/（g·min）上升為0.142 mg/（g·min），上升了233.33%。2～7 d發(fā)病組織CAT活性變化較為平穩(wěn)。實(shí)驗(yàn)表明膠孢炭疽菌侵染柑橘果實(shí)過程中，果實(shí)中的防御酶活性總體呈上升趨勢(shì)，且防御酶的作用時(shí)期遲于細(xì)胞壁降解酶。

MDA是質(zhì)膜過氧化作用的主要產(chǎn)物之一，它的積累能對(duì)果蔬細(xì)胞質(zhì)膜和細(xì)胞器造成一定的傷害。從圖5D可知，膠孢炭疽菌侵染后柑橘組織的MDA含量在24 h內(nèi)迅速下降63.06%，然后呈緩慢上升趨勢(shì)。對(duì)照組中MDA含量在第2天達(dá)到峰值后降低到平穩(wěn)水平，說明針刺損傷在前期也會(huì)使產(chǎn)生過氧化反應(yīng)。MDA是判斷質(zhì)膜過氧化的重要指標(biāo)之一，其含量在膠孢炭疽菌致病過程中大量增加，這表明膠孢炭疽菌的侵染可以引起寄主的活性氧的爆發(fā)，破壞細(xì)胞膜的完整性。

3 結(jié) 論

膠孢炭疽菌分泌的細(xì)胞壁降解酶在其致病中起到非常重要的作用，其對(duì)果皮細(xì)胞壁組分的降解加速了膠孢炭疽菌的侵入。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：膠孢炭疽菌與柑橘互作過程中，PG活性最高，Cx活性高峰出現(xiàn)最早，因此PG與Cx在炭疽菌侵染柑橘過程中起關(guān)鍵作用，應(yīng)對(duì)其作用機(jī)理進(jìn)行更加深入的研究。炭疽菌侵染初期纖維素迅速合成，侵入后期在Cx作用下被逐步降解，導(dǎo)致病斑組織軟化。木質(zhì)素含量在整個(gè)互作過程中一直呈上升趨勢(shì)，說明植物一直處于防御狀態(tài)。另外質(zhì)膜的過氧化引起的細(xì)胞膜破壞可能是引起發(fā)炭疽病的主要原因。然而，引起質(zhì)膜過氧化反應(yīng)的致病因子還有待深入研究。

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Dynamic Changes in Chemical Components of the Pericarp of Postharvest Citrus Fruit Inoculated with Colletotrichum gloeosporioides

GE Zhixing1, HE Mingyang1,2,3, ZENG Xiaofeng1, HUANG Xiaolan1, WANG Rikui1,2,3,*, ZHOU Lian1,2,3, HAN Leng1,2,3
(1. Citrus Research Institute, Southwest University, Chongqing 400712, China; 2. Citrus Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Chongqing 400712, China; 3. National Citrus Engineering Research Center, Chongqing 400712, China)

Objective: To examine dynamic changes in the activities of various cell wall-degrading enzymes (CWDEs), the contents of cell wall components and the activities of defense-related enzymes in citrus pericarp tissues infected with Colletotrichum gloeosporioides, aiming to gain more knowledge on the interaction between C. gloeosporioides and citrus fruits. Methods: Chemical components of the pericarp of citrus fruit inoculated with C. gloeosporioides were detected and comparatively analyzed during different sampling periods. Results: The activities of CWDEs including polygalacturonase (PG), polymethyl-galacturonase (PMG), carboxymethyl cellulose (Cx) and β-glucosidase (β-Glu) were detected in the infected tissue. The activities of CWDEs and cutinase remained at higher levels during the early infection period (day one to three post infection). The cell wall components including cellulose, hemicellulose and pectin showed a declining trend, but lignin content showed a rising trend during the infection of C. gloeosporioides. The activities of peroxidase (POD) and catalase (CAT) and the content of malonaldehyde (MDA) showed a rising trend in the citrus pericarp tissues infected with C. gloeosporioides. Conclusion: The CWDEs and cutinase play an important pathogenic role during the early stage of anthracnose, which accelerates the infection of pathogenic fungi by degrading the cell wall components. In addition, the infection of C. gloeosporioides accelerates membrane lipid peroxidation in host cells.

citrus; Colletotrichum gloeosporioides; cell wall-degrading enzymes; cell wall components; defense-related enzymes

10.7506/spkx1002-6630-201610045

S609.3；S666.4

A

1002-6630（2016）10-0266-06

蓋智星, 賀明陽, 曾小峰, 等. 采后柑橘與膠孢炭疽菌互作過程中果皮成分的動(dòng)態(tài)變化[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(10): 266-271. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201610045. http://www.spkx.net.cn

GE Zhixing, HE Mingyang, ZENG Xiaofeng, et al. Dynamic changes in chemical components of the pericarp of postharvest citrus fruit inoculated with Colletotrichum gloeosporioides[J]. Food Science, 2016, 37(10): 266-271. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201610045. http://www.spkx.net.cn

2015-07-02

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（201203034）；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)（XDJK2013C014）；

重慶市應(yīng)用開發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（cstc2013yykfA80008）；重慶市科技支撐示范工程項(xiàng)目（cstc2014fazktjcsf80007）

蓋智星（1990—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品貯藏工程。E-mail：gezhixing@sinocitrus.com

*通信作者：王日葵（1962—），男，副研究員，研究方向?yàn)楣卟珊罄碚摷皯?yīng)用技術(shù)。E-mail：ewrk@163.com