王 蒙，姜 楠，韋迪哲，馮曉元

（北京農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢 測(cè)技術(shù)研究中心，農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室（北京），北京 100097）

自制固相萃取柱-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定果蔬中的8 種真菌毒素

王 蒙，姜 楠，韋迪哲，馮曉元*

（北京農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢 測(cè)技術(shù)研究中心，農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室（北京），北京 100097）

建立基于自制固相萃取柱的樣品凈化-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)測(cè)定果蔬中8 種主要真菌毒素的方法，包括鏈格孢毒素、展青霉素、赭曲霉毒素A及橘青霉素。樣品經(jīng)80%乙腈溶液提取、離心后，通過(guò)自制固相萃取柱（HLB+MCX）排除雜質(zhì)干擾，流出液經(jīng)氮吹至近干后，直接用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行測(cè)定，基質(zhì)外標(biāo)法定量。在較寬的線性范圍內(nèi)，8 種毒素的線性相關(guān)系數(shù)（r2）均不小于0.99，定量限為1～5 μg/kg，在3 個(gè)不同添加水平下的加標(biāo)回收率為76.0%～102.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.8%～4.7%。該法靈敏度高，操作簡(jiǎn)單、快速，適用于蘋果、櫻桃和番茄等果蔬中痕量真菌毒素的測(cè)定。

真菌毒素；自制固相萃取柱；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；果蔬

果蔬在生長(zhǎng)、采收、貯藏、運(yùn)輸、銷售等各個(gè)過(guò)程，易受到病原微生物污染，特別是在貯藏期間，由病原菌侵染引起的果蔬采后腐爛較重，產(chǎn)生并積累各種真菌毒素，對(duì)人和動(dòng)物的健康造成了極大的危害。其中，最主要的污染果蔬的真菌毒素包括鏈格孢毒素（Alternaria toxin）、展青霉素（patulin，PAT）、赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA）及橘青霉素（citrinin，CIT）[1-2]。鏈格孢毒素是由鏈格孢霉產(chǎn)生的一系列代謝產(chǎn)物，主要包括5 種：交鏈孢酚（alternariol，AOH）、交鏈孢酚單甲醚（alternariol monamethyl ether，AME）、細(xì)交鏈格孢酮酸（tenuazonic acid，TeA）、交鏈孢烯（altenuene，ALT）、騰毒素（tentoxin，TEN）。已有研究[3]表明：進(jìn)食受鏈格孢毒素污染的糧食與人類食管癌高發(fā)病率密切相關(guān)。最近歐洲食品安全局對(duì)食品中鏈格孢毒素的潛在風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評(píng)估[4]，研究結(jié)果表明，隨膳食攝入的鏈格孢毒素對(duì)公眾健康存在潛在風(fēng)險(xiǎn)，目前已開(kāi)始著手制定鏈格孢毒素的最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)。OTA是由曲霉菌屬和青霉菌屬等產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，廣泛地分布于農(nóng)產(chǎn)品及飼料中。OTA被證明具有較強(qiáng)的肝毒性和腎毒性，并有致畸、致癌和致突變作用[5]。PAT是由曲霉菌、青霉菌和絲衣霉產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，是水果中常見(jiàn)真菌毒素。PAT具有急性毒性，包括對(duì)動(dòng)物的肺、腦水腫、肝臟、脾臟、腎的損害和免疫系統(tǒng)的毒害作用；也具有慢性毒性，表現(xiàn)在對(duì)動(dòng)物的細(xì)胞毒性，基因毒性和免疫毒性[6]。CIT是一類醌甲基化合物，它對(duì)動(dòng)物和人類具有腎毒性、基因毒性、致癌性、胚胎毒性，它是一種腎毒素，會(huì)破壞動(dòng)物腎小管，毒害胚胎期動(dòng)物的腎臟，是巴爾干腎病的潛在的病原體[7]。

長(zhǎng)期以來(lái)，由于鮮食的果蔬在食用過(guò)程中會(huì)去除腐爛部位，果蔬中的真菌毒素污染未引起足夠的重視。但已有研究結(jié)果表明，未腐爛部位也有不同程度的真菌毒素檢出[8]。此外，在果汁、果醬、果酒等工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中，主要是通過(guò)剔除腐爛部分降低毒素及病菌污染的風(fēng)險(xiǎn)，但是這并不能完全消除風(fēng)險(xiǎn)。特別是有的病原菌，如鏈格孢菌屬（Alternaria spp.）可使果實(shí)內(nèi)部腐爛而表皮無(wú)明顯變化，不能通過(guò)沖洗，分揀操作去除毒素，進(jìn)而增加了果汁類產(chǎn)品的安全隱患。近年來(lái)，皮渣的回收利用成為果蔬加工和副產(chǎn)品綜合利用的一大重點(diǎn)，特別是作為新型動(dòng)物飼料應(yīng)用廣泛。這些產(chǎn)品極大增加了毒素污染食品和通過(guò)污染飼料繼而污染畜禽等動(dòng)物源性食品的風(fēng)險(xiǎn)，間接威脅人類飲食安全[9]。因此，建立果蔬中真菌毒素的檢測(cè)技術(shù)研究已勢(shì)在必行。

目前果蔬中真菌毒素的檢測(cè)方法主要有薄層色譜法[10]、高效液相色譜法[11]、液相色譜-質(zhì)譜法[12-15]、毛細(xì)管電泳[16]和免疫學(xué)檢測(cè)方法[17-18]等，液相色譜-質(zhì)譜法是應(yīng)用最廣泛的方法，也是我國(guó)果品中真菌毒素檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)方法之一。然而，上述方法前處理操作繁瑣，如利用常規(guī)的固相萃取柱需經(jīng)過(guò)淋洗、洗脫等步驟，難以滿足大批量樣品的快速檢測(cè)；免疫親和柱有較強(qiáng)的特異性，具有準(zhǔn)確度高、靈敏度好等有點(diǎn)[19]，但其檢測(cè)成本高，仍未能滿足同時(shí)測(cè)定果蔬中的主要真菌毒素。QuEChERS（quick, easy, cheap, effective, rugged, safe）技術(shù)作為一項(xiàng)新興的前處理技術(shù)，已廣泛用于真菌毒素的分析檢測(cè)中[14,20-21]。但QuEChERS法凈化樣品需精確稱量不同分散固相萃取劑的含量，如硫酸鎂、N-丙基乙二胺（N-propyl ethylenediamine，PSA）、C18等，進(jìn)而增加了前處理時(shí)間，不適于大批量樣品同時(shí)操作。而利用本研究自制的固相萃取柱，直接將樣品提取液自然通過(guò)固相萃取柱，并收集、濃縮，實(shí)現(xiàn)了一步凈化，且批處理樣品間重復(fù)性好，操作簡(jiǎn)便。因此，利用本實(shí)驗(yàn)自制的固相萃取柱，結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，可適用于同時(shí)檢測(cè)果蔬中8 種真菌毒素的定量分析。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

本實(shí)驗(yàn)所用的蘋果、櫻桃和番茄果實(shí)都購(gòu)買于水果超市。挑選大小適中、色澤均勻、無(wú)病蟲害、無(wú)機(jī)械損傷的果實(shí)。

鏈格孢毒素（AOH、AME、TeA、ALT、TEN）標(biāo)準(zhǔn)品 美國(guó)Sigma公司；OTA和PAT 美國(guó)Romer公司；CIT 以色列Fermenteck公司；乙腈、甲酸、乙酸銨（均為色譜純） 美國(guó)Fisher公司。

固相萃取空柱管、親水親脂固相萃取填料（hydrophilic-lipophilic balanced，HLB，粒度40～60 μm）、陽(yáng)離子交換色譜填料（mixed-mode cationic exchange，MCX，粒度40～60 μm） 北京廣普達(dá)公司；AcquityTM超高效液相色譜儀-TQS串聯(lián)質(zhì)譜儀、電噴霧電離（electron spray ionization，ESI）接口 美國(guó)Waters公司；臺(tái)式高速離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司；氮吹儀美國(guó)Organomation公司；渦旋混合器 德國(guó)IKA公司；Milli-Q A10超純水器 美國(guó)Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)貯備液：用乙腈準(zhǔn)確定容1 mg標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL容量瓶，配成100 μg/mL質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，密封冷凍儲(chǔ)存于-20 ℃冰箱中。

標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別配制1、2、5、10、50、100、200 μg/L的8 種真菌毒素的混合溶液，密封保存于-20 ℃冰箱中。

基質(zhì)空白標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：以不含真菌毒素的蘋果、櫻桃和番茄果實(shí)為材料，利用本實(shí)驗(yàn)前處理方法分別制

備蘋果、櫻桃和番茄的基質(zhì)空白溶液。用基質(zhì)空白溶液將標(biāo)準(zhǔn)工作液按相同比例稀釋至1、2、5、10、50、100、200 μg/L，分別得到蘋果、櫻桃和番茄基質(zhì)空白標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2.2 樣品處理

1.2.2.1 裝柱及活化

取6 mL固相萃取空柱管，在底部鋪上篩板，裝入200 mg MCX填料，輕輕敲打使填料均勻填充，用篩板壓平，再加入200 mg HLB填料，輕輕敲打，壓好篩板，即得自制固相萃取柱。使用前用10 mL乙腈活化。

1.2.2.2 樣品提取

稱取水果樣品5 g（精確至0.01 g），置于50 mL具塞離心管中；加入含1%乙酸的乙腈-水（80∶20，V/V）提取液25 mL，渦旋混勻，150 r/min常溫振蕩提取30 min后，以10 000 r/min離心10 min，吸取5 mL上清液轉(zhuǎn)移至固相萃取柱，自然通過(guò)固相萃取柱，流出液于60 ℃條件下氮吹至近干，殘?jiān)靡译?5mmol/L的醋酸銨溶液（40∶60，V/V）溶解，混勻后過(guò)0.22 μm微孔濾膜，供超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。

按照1.2.2.2節(jié)方法測(cè)試后的樣品，如果未檢測(cè)到8 種真菌毒素將作為空白樣品用于回收率實(shí)驗(yàn)和制備基質(zhì)校正溶液。在進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)時(shí)，取適量稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)溶液加入到空白樣品中，充分混合后進(jìn)行后續(xù)處理。

1.2.3 儀器條件

色譜柱為Acquity CORTECS UPLC C18（100 mm×2.1 mm，1.6 μm）；柱溫為40 ℃；進(jìn)樣體積為5 μL；流動(dòng)相A為5 mmol/L乙酸銨，流動(dòng)相B為乙腈；梯度洗脫條件為A在100%保持1 min后，3 min內(nèi)降至5%，保持0.5 min后在0.1 min 內(nèi)升至100%，保持1.4 min；流速0.3 mL/min；總運(yùn)行時(shí)間6 min。

質(zhì)譜條件：離子源模式：正負(fù)離子模式（ESI+和ESI-）；毛細(xì)管電壓：2.5 kV（ESI+）和-1.5 kV（ESI-）；氣化溫度：400 ℃；去溶劑氣流速：700 L/h；其余參數(shù)通過(guò)儀器自動(dòng)調(diào)諧至最優(yōu)。多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multi reaction monitor，MRM）；8 種真菌毒素的MRM參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 8 種真菌毒素的串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)Table 1 Optimized MRM parameters for 8 mycotoxins

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件

本實(shí)驗(yàn)比較了水-甲醇、水-乙腈、乙酸銨溶液-甲醇、乙酸銨溶液-乙腈4 種流動(dòng)相體系，結(jié)果表明以乙酸銨溶液-乙腈作為流動(dòng)相體系，8 種真菌毒素的離子信號(hào)值增強(qiáng)，且峰形得到明顯改善。確定流動(dòng)相體系為乙酸銨溶液-乙腈后，進(jìn)一步優(yōu)化了乙酸銨的用量，結(jié)果表明水相加入5 mmol/L的乙酸銨時(shí)，8 種真菌毒素的出峰效果最佳。

采用流動(dòng)注射泵連續(xù)進(jìn)樣方式進(jìn)行質(zhì)譜條件的優(yōu)化，分別在ESI+模式和ESI-模式下進(jìn)行全掃描，確定AME和PAT在負(fù)離子模式下的響應(yīng)值高，ALT、TeA、OTA和CIT在正離子模式下的響應(yīng)值顯著高于負(fù)離子模式。而TEN和AOH在正離子模式下的靈敏度略高于負(fù)離子模式，考慮到負(fù)離子模式有利于降低基質(zhì)效應(yīng)[22]，確定TEN和AOH的母離子分別是m/z 413.2，m/z 257.0。并通過(guò)對(duì)氣化溫度、錐孔電壓、碰撞電壓等質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化，最終確定8種真菌毒素的MRM參數(shù)（表1），圖1為10 μg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液中8 種真菌毒素的定量離子質(zhì)譜圖。在色譜柱的選擇上，通過(guò)比較BEH C18Column（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）和CORTECS C18（100 mm×2.1 mm，1.6 μm）色譜柱的分離效果，發(fā)現(xiàn)兩種色譜柱都能使8 種真菌毒素得到很好地分離。但從色譜行為看，CORTECS C18更加適合于分析這8 種真菌毒素，該柱內(nèi)徑和填料粒徑均較小，能夠獲得良好的分離度。

圖1 8 種真菌毒素的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 μgg/L）定量離子質(zhì)譜圖Fig. 1 Mass spectra of 8 mycotoxins (10 μg/L)

2.2 樣品凈化條件的優(yōu)化

2.2.1 固相萃取柱的選擇

樣品中含有蛋白質(zhì)、色素、糖和有機(jī)酸等組分，這些雜質(zhì)會(huì)嚴(yán)重干擾目標(biāo)分析物的測(cè)定，同時(shí)也會(huì)大大縮短色譜柱的使用壽命，因此需要對(duì)樣品進(jìn)行凈化前處理。而常規(guī)的固相萃取柱需經(jīng)過(guò)淋洗、洗脫等步驟，處理操作繁瑣，難以滿足大批量樣品的快速檢測(cè)。因此開(kāi)發(fā)了一種適用于快速前處理的固相萃取柱，即將含毒素的提取液直接加入固相萃取柱，收集過(guò)柱后的提取液，同時(shí)提取液中的雜質(zhì)被固相萃取柱吸附（穿漏法）。

本實(shí)驗(yàn)考察了4 種常用固相萃取柱填料（PSA、C18、HLB、MCX）對(duì)凈化效果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，自制C18柱顯著降低TeA的回收率；PSA柱可顯著降低基質(zhì)效應(yīng)，但CIT添加回收率低，這可能是由于PSA含有2 個(gè)氨基，與CIT中的羧基發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，進(jìn)而降低了CIT的回收率。自制HLB柱和MCX柱對(duì)8 種真菌毒素的回收率無(wú)顯著影響，但由于HLB柱是通用型吸附劑，選擇性較低，對(duì)樣品的凈化不夠理想。但使用自制混合型固相萃取柱（HLB+MCX）進(jìn)行前處理后，由于該柱使用了可在廣泛的pH值范圍內(nèi)保持穩(wěn)定的反相和離子交換吸附劑，其中MCX為混合型陽(yáng)離子固相萃取柱，具有反相分離和離子交換雙重作用，可有效去除樣品中色素等堿性雜質(zhì)和蛋白質(zhì)等兩性雜質(zhì)[23]，而HLB是親水-親脂平衡的吸附劑，其保留機(jī)理為反相，可有效去除脂肪等非極性雜質(zhì)；從而能夠保證方法的最優(yōu)化和高選擇性，獲得很好的凈化效果，因此確定采用HLB+MCX作為固相萃取柱的吸附填料。

2.2.2 自制固相萃取柱凈化效果

已發(fā)表研究[11-13,15,24]中果蔬真菌毒素的凈化多采用Waters HLB柱進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)分別考察了自制固相萃取柱與Waters Oasis HLB 固相萃取的凈化效果，通過(guò)加標(biāo)回收來(lái)考察兩種固相萃取柱的凈化效果。其中采用HLB柱凈化需將含毒素的提取液轉(zhuǎn)換成水相溶液，加入HLB柱，真菌毒素被吸附，采用10%甲醇溶液淋洗，最后通過(guò)甲醇-乙腈（含1%甲酸）洗脫（吸附法）。

如表2所示，自制固相萃取柱的凈化效果要好于Waters Oasis HLB固相萃取柱。HLB固相萃取柱是通過(guò)一個(gè)“特殊的極性捕獲基團(tuán)”提供很好的水浸潤(rùn)性來(lái)增加對(duì)極性物質(zhì)的保留[25]，能對(duì)8 種毒素有效吸附，但HLB柱吸附法不利于3 種真菌毒素（AOH、AME和CIT）的回收，加標(biāo)回收率僅為70.6%～74.3%（表2），而為了提高樣品的凈化效果，利用本實(shí)驗(yàn)自制復(fù)合體系對(duì)樣品進(jìn)行處理。經(jīng)自制固相萃取柱凈化后的8 種真菌毒素的回收率均在83.5%以上。此外，還對(duì)自制固相萃取的使用方式進(jìn)行優(yōu)化，通過(guò)對(duì)比穿漏法和吸附法對(duì)8 種真菌毒素的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大部分真菌毒素采用2 種方式的回收率無(wú)顯著差異，而PAT僅適用于穿漏法，吸附法的回收率低于30%；最終確定簡(jiǎn)便、快速的前處理方式（穿漏法）為果蔬真菌毒素的最適凈化方式。

表2 2 種不同固相萃取凈化過(guò)程對(duì)8 種真菌毒素回收率的影響Table 2 Effects of 2 different SPEs on the recoveries of 8 mycotoxins

圖2 2 種不同固相萃取柱凈化效果圖Fig. 2 The purifi cation effi ciency by 2 different SPEs

2.3 一次性濾膜的選擇

本實(shí)驗(yàn)研究了不同濾膜對(duì)真菌毒素的影響，通過(guò)使用尼龍膜、聚醚砜膜、聚偏二氟乙烯膜和聚四氟乙烯膜，分別對(duì)同一質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行過(guò)濾，經(jīng)儀器測(cè)定發(fā)現(xiàn)尼龍膜和聚醚砜膜會(huì)對(duì)待測(cè)組分產(chǎn)生明顯吸附作用，使得測(cè)定結(jié)果明顯偏低，而聚四氟乙烯膜的回收率略高于聚偏二氟乙烯膜的，故本實(shí)驗(yàn)采用聚四氟乙烯膜進(jìn)行過(guò)濾。

2.4 方法的線性方程與定量限（limit of quantity，LOQ）

表3 蘋果、櫻桃和番茄中8 種真菌毒素的線性范圍、相關(guān)系數(shù)（r2）和LLOOQQTable 3 Linear ranges, correlation coeffi cients (r2) and limits off quantitation (LOQs) for 8 mycotoxins

據(jù)調(diào)研，蘋果、櫻桃和番茄是最易感染上述8 種真菌毒素；用乙腈配制質(zhì)量濃度均為1、2、5、10、50、100、200 μg/L的8 種真菌毒素不同基質(zhì)的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。在優(yōu)化條件下進(jìn)行測(cè)定，分別以峰面積（Y）對(duì)質(zhì)量濃度（X）作工作曲線，結(jié)果顯示，真菌毒素在1～200 μg/L（7 種）和5～200 μg/L PAT范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.992 1～0.999 8。以10 倍信噪比計(jì)，8 種真菌毒素的LOQ為1～5 μg/kg（表3）。方法的精密度良好、定量限低，能滿足樣品中真菌毒素檢測(cè)的需要。

2.5 加標(biāo)回收率和精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

取空白蘋果、櫻桃和番茄樣品，添加LOQ、10、50 μg/kg 3 個(gè)水平的8 種真菌毒素，每個(gè)添加水平重復(fù)測(cè)定5 次。8 種目標(biāo)物質(zhì)在3 個(gè)加標(biāo)水平的平均回收率為76.0%～102.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.8%～4.7%（表4），具有較高的回收率和精密度。

表4 蘋果、櫻桃和番茄中8 種真菌毒素的添加回收率和精密度（n==55）Table 4 Recovery rates and precision for 8 mycotoxins spiked in apples, sweet cherries and tomatoes (n == 55))

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用自制混合型固相萃取柱結(jié)合超高效液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)，建立了測(cè)定蘋果、櫻桃和番茄等果蔬樣品中8 種主要真菌毒素的分析方法。方法的加標(biāo)回收率為76.0%～102.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.8%～4.7%，LOQ為1～5 μg/kg，能滿足果蔬樣品中真菌毒素痕量分析的要

求。與目前測(cè)定真菌毒素使用最為普遍的固相萃取柱相比，在保持分析準(zhǔn)確度、靈敏度的前提下，使用自制混合固相萃取柱，大幅度地降低了使用成本，方法值得推廣應(yīng)用于果蔬及其制品中真菌毒素的檢測(cè)分析。

[1] DRUSH S, RAGAB W. Mycotoxins in fruits, fruit juice, and dried fruits[J]. Journal of Food Protection, 2003, 66: 1514-1527.

[2] BARKAI GOLAN R, PASTER N. Mouldy fruits and vegetables as a source of mycotoxins: part 1[J]. World Mycotoxin Journal, 2008, 1: 147-159. DOI:10.3920/WMJ2008.x018.

[3] 安玉會(huì), 盧榮華, 馮文舟, 等. 林縣交鏈孢霉毒素-交鏈孢醇單甲醚和交鏈孢烯的協(xié)同毒性和致畸作用研究[J]. 癌癥, 1988(7)： 54-55.

[4] EFSA on Contaminants in the Food Chain (CONTAM). Scientific opinion on the risks for animal and public health related to the presence of Alternaria toxins in feed and food[J]. EFSA Journal, 2011, 9(10): 2407.

[5] 趙志輝. 農(nóng)產(chǎn)品和飼料中常見(jiàn)真菌毒素的種類和危害[J]. 北京工商大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2012, 30(4)： 8-11.

[6] de MELO F T, de OLIVEIRA I M, GREGGIO S, et al. DNA damage in organs of mice treated acutely with patulin, a known mycotoxin[J]. Food and Chemical Toxicology, 2012, 50(10)： 3548-3555. DOI：10.1016/j.fct.2011.12.022.

[7] WU T S, YANG J J, YU F Y, et al. Evaluation of nephrotoxic effects of mycotoxins, citrinin and patulin, on zebrafish (Danio rerio) embryos[J]. Food and Chemical Toxicology, 2012, 50(12): 4398-4404. DOI:10.1016/j.fct.2012.07.040.

[8] ROBIGLIO A L, LOPEZ S E. Mycotoxin production by Alternaria alternata strains isolated from red delicious apples in Argentina[J]. International Journal of Food Microbiology, 1995, 24: 413-417. DOI:10.1016/0168-1605(94)00035-5.

[9] 胡媛媛, 馬良, 張宇昊. 柑橘果實(shí)中主要的真菌毒素及其檢測(cè)技術(shù)[J].食品工業(yè)科技, 2013, 34(24)： 385-391.

[10] 江濤, 張靖, 劉紅蕾, 等. 大米中桔青霉素的薄層色譜分析[J]. 衛(wèi)生研究, 2002, 31(6)： 470-472.

[11] 陳月萌, 李建華, 張靜, 等. 高效液相色譜-熒光檢測(cè)法同時(shí)測(cè)定水果中的3 種鏈格孢霉毒素[J]. 分析試驗(yàn)室, 2012, 31(6)： 70-73.

[12] 何強(qiáng), 李建華, 孔祥虹, 等. 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定濃縮蘋果汁中的4 種鏈格孢霉毒素[J]. 色譜, 2010, 28(12)： 1128-1131.

[13] 李建華, 何強(qiáng), 孔祥虹, 等. 凝膠滲透凈化-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定橙汁中鏈格孢霉毒素[J]. 化學(xué)計(jì)量分析, 2012, 21(3)：20-23.

[14] 史文景, 趙其陽(yáng), 焦必寧. UPLC-ESI-MS-MS結(jié)合QuEChERS同時(shí)測(cè)定柑橘中的4 種真菌毒素[J]. 食品科學(xué), 2014, 35(20)： 170-174. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201420034.

[15] JURG N, PATRICK S, MARTIN R, et al. Determination of six Alternaria toxins with UPLC-MS/MS and their occurrence in tomatoes and tomato products from the Swiss market[J]. Mycotoxin Research, 2011, 27(5): 265-271. DOI:10.1007/s12550-011-0103-x.

[16] 杜建中, 陳海莉, 吳金媚, 等. 毛細(xì)管電泳分析測(cè)定霉變食品中桔青霉素的研究[J]. 食品科學(xué), 2009, 30(6)： 203-206.

[17] DUAN Zhaohui, LIN Zhuangsen, YAO Herui, et al. Preparation of artificial antigen and egg yolk-derived immunoglobulin (IgY) of citrinin for enzyme-linked immunosorbent assay[J]. Biomedical and Environmental Sciences, 2009, 22(3)： 237-243.

[18] ACKERMANN Y, CURTUI V, DIETRICH R, et al. Widespread occurrence of low levels of alternariol in apple and tomato products, as determined by comparative immunochemical assessment using monoclonal and polyclonal antibodies[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2011, 59： 6360-6368. DOI：10.1021/jf201516f.

[19] 范素芳, 李培武, 王秀嬪, 等. 高效液相色譜和高效液相色譜-離子阱質(zhì)譜測(cè)定花生、玉米和大米中黃曲霉毒素方法比較[J]. 食品科學(xué), 2011, 32(12)： 254-258.

[20] MYRESIOTIS C K, TESTEMPASIS S, VRYZAS Z, et al. Determination of mycotoxins in pomegranate fruits and juices using a QuEChERS-based method[J]. Food Chemistry, 2015, 182： 81-88. DOI：10.1016/j.foodchem.2015.02.141.

[21] HAJNAL-JANIC E P, ORCIC D Z, MASTILOVIC J S, et al. The choice of preparation method for the determination of Alternaria toxins from wheat samples by LC-MS/MS[J]. Food and Feed Research, 2014, 41(2)： 131-138.

[22] WALRAVENSA J, MIKULA H, RYCHLIK M, et al. Development and validation of an ultra-high-performance liquid chromatography tandem mass spectrometric method for the simultaneous determination of free and conjugated Alternaria toxins in cereal-based foodstuffs[J]. Journal of Chromatography A, 2014, 1372： 91-101. DOI：10.1016/ j.chroma.2014.10.083.

[23] PARK Y, CHOE S, LEE H, et al. Advanced analytical method of nereistoxin using mixed-mode cationic exchange solid-phase extraction and GC/MS[J]. Forensic Science International, 2015, 252：143-149. DOI：10.1016/j.forsciint.2015.04.01.

[24] ZHAO K, SHAO B, YANG D J, et al. Natural occurrence of four Alternaria mycotoxins in tomato- and citrus-based foods in China[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2015, 63: 343-348. DOI:10.1021/jf5052738.

[25] CAPRIOTTI A L, CAVALIERE C, FOGLIA P, et al. Multiclass analysis of mycotoxins in biscuits by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. comparison of different extraction procedures[J]. Journal of Chromatography A, 2014, 1343: 69-78. DOI:10.1016/j.chroma.2014.04.009.

A Solid Phase Extraction-Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Method for the Determination of 8 Mycotoxins in Fruits and Vegetables

WANG Meng, JIANG Nan, WEI Dizhe, FENG Xiaoyuan*
(Risk Assessment Laboratory for Agro-Products (Beijing), Ministry of Agriculture, Beijing Research Center for Agricultural Standards and Testing, Beijing 100097, China)

A novel method for the determination of 8 mycotoxins, including alternariol (AOH), alternariol monamethyl ether (AME), tenuazonic acid (TeA), alte nuene (ALT), tentoxin (TEN), patulin (PAT), ochratoxin A (OTA) and citrinin (CIT) in fruits and vegetables was developed using a laboratory-prepared solid phase extraction (SPE) column coupled with ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS). The sample was extracted with 80% acetonitrile solution, and cleaned up on the SPE column. The separation of the analytes was carried out on an Acquity CORTECS UPLC C18column (100 mm × 2.1 mm, 1.6 μm) using a mobile phase composed of a mixture of acetonitrile and 5 mmol/L ammonium acetate aqueous solution with gradient elution. The extract was determined by UPLC-MS/MS. Matrixmatched calibration was used for the quantifi cation. The proposed method showed a good linear correlation with correlation coeffi cients all above 0.99. The recoveries for blank samples fortifi ed at three levels ranged from 76.0% to 102.7% with RSDs from 0.8% to 4.7%. The limits of detection (LODs) ranged from 1 to 5 μg/kg. The method possessed the advantages of sensitivity, simplicity and fastness, and was successfully applied in the determination of low levels of mycotoxins residues in apple, sweet cherry and tomato samples.

mycotoxins; laboratory-prepared solid phase extraction column; ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS); fruits and vegetables

10.7506/spkx1002-6630-201610037

TS207.3

A

1002-6630（2016）10-0213-06

王蒙, 姜楠, 韋迪哲, 等. 自制固相萃取柱-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定果蔬中的8 種真菌毒素[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(10): 213-218. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201610037. http://www.spkx.net.cn

WANG Meng, JIANG Nan, WEI Dizhe, et al. A solid phase extraction ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for the determination of 8 mycotoxins in fruits and vegetables[J]. Food Science, 2016, 37(10): 213-218. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201610037. http://www.spkx.net.cn

2015-11-10

北京市自然科學(xué)基金項(xiàng)目（6154023）；北京市農(nóng)林科學(xué)院青年基金 項(xiàng)目（QNJJ201518）

王蒙（1980—），女，副研究員，博士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與標(biāo)準(zhǔn)。E-mail：ameng-001@163.com

*通信作者：馮曉元（1965—），女，研究員，博士，研究方向?yàn)楣焚|(zhì)量與安全。E-mail：fengxiaoyuan2014@126.com