王永明， 陳瑜， 胡雨， 謝碧文*， 岳興建， 王芳， 齊澤民， 王淯

(1. 內(nèi)江師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，長(zhǎng)江上游魚(yú)類資源保護(hù)與利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川內(nèi)江641112；2. 西南大學(xué)，淡水魚(yú)類資源與生殖發(fā)育教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶400715)

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寬體沙鰍精子超微結(jié)構(gòu)及Na+、K+、Ca2+對(duì)其精子活力的影響

王永明1， 陳瑜1， 胡雨2， 謝碧文1*， 岳興建1， 王芳1， 齊澤民1， 王淯1

(1. 內(nèi)江師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，長(zhǎng)江上游魚(yú)類資源保護(hù)與利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川內(nèi)江641112；2. 西南大學(xué)，淡水魚(yú)類資源與生殖發(fā)育教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶400715)

選取健康的性成熟雄性寬體沙鰍，運(yùn)用JSM 6510LV型掃描電鏡、H-7500型透射電鏡及Motic-BA210數(shù)碼顯微鏡分別觀察了寬體沙鰍精子的超微結(jié)構(gòu)及不同濃度Na+、K+、Ca2+對(duì)其精子活力的影響。結(jié)果顯示，寬體沙鰍精子頭部圓球形，無(wú)頂體，細(xì)胞核后端有一植入窩凹陷，凹陷深度為細(xì)胞核長(zhǎng)徑的1/6。中片由中心粒復(fù)合體和袖套組成。中心粒復(fù)合體分為近端中心粒和基體，兩者呈“L”型排列；袖套呈兩側(cè)不對(duì)稱分布，一側(cè)狹長(zhǎng)，另一側(cè)肥厚。尾部主要由軸絲組成，為典型的“9+2”型雙聯(lián)微管結(jié)構(gòu)，微管動(dòng)力蛋白臂明顯。以NaCl、KCl和CaCl2濃度分別為75 mmol·L-1、0.5 mmol·L-1和5 mmol·L-1作為寬體沙鰍精子的激活介質(zhì)，效果最佳。建議實(shí)際生產(chǎn)中選取合適的激活介質(zhì)進(jìn)行人工授精。

寬體沙鰍；精子；超微結(jié)構(gòu)；精子活力

魚(yú)類精子的形態(tài)及活力是影響其繁殖效果的重要因素(Gagnon，1990)。魚(yú)類的精子活力是評(píng)價(jià)精子質(zhì)量最重要的指標(biāo)，與受精率成顯著正相關(guān)(Vladic & Jarvi，1997)。而魚(yú)類精子超微結(jié)構(gòu)的研究不僅有助于揭示其受精機(jī)理及系統(tǒng)進(jìn)化，而且在硬骨魚(yú)類分類學(xué)研究中具有重要的實(shí)踐意義(劉雪珠，楊萬(wàn)喜，2002)。

寬體沙鰍Sinibotiareevesae隸屬鯉形目Cypriniformes鰍科Cobitidae沙鰍亞科Botiinae，為長(zhǎng)江上游特有經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(丁瑞華，1994)。近年來(lái)，由于水利工程建設(shè)和采砂作業(yè)對(duì)其產(chǎn)卵場(chǎng)和索餌場(chǎng)的破壞，加之水體污染，其野生資源量急劇下降(岳興建等，2011)。目前，對(duì)寬體沙鰍的研究主要集中在胚胎發(fā)育(岳興建等，2011)、組織學(xué)(王芳等，2011)、個(gè)體生殖力(黃燕等，2011)、親魚(yú)脂肪酸組成(頡江等，2013)、繁殖生物學(xué)(王永明等，2014)及年齡與生長(zhǎng)(王永明等，2015)等方面，尚無(wú)其精子超微結(jié)構(gòu)及精子活力的研究。本文對(duì)寬體沙鰍精子超微結(jié)構(gòu)及不同濃度Na+、K+、Ca2+溶液對(duì)其精子活力的影響進(jìn)行了研究，旨在為該魚(yú)生殖生物學(xué)的研究和深入開(kāi)展人工養(yǎng)殖提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

2014年5月，于沱江(銀山段)收集性成熟寬體沙鰍，選取性腺發(fā)育良好的健康雄魚(yú)進(jìn)行試驗(yàn)，體質(zhì)量12.42 g±0.58 g，體長(zhǎng)88.33 mm±3.92 mm。

1.2 方法

1.2.1 掃描電鏡材料 活體解剖并切取大小為0.1 cm3的成熟精巢，用2.5%戊二醛固定，梯度乙醇脫水，叔丁醇置換，CO2臨界點(diǎn)干燥，JEOL JEC-3000FC噴金，JSM 6510LV掃描電鏡觀察拍照，觀察精子的外部形態(tài)。

1.2.2 透射電鏡材料 活體解剖并切取大小約0.1 cm3的成熟精巢，用2.5%戊二醛固定，24 h后用pH7.4的0.2 mol·L-1磷酸緩沖液沖洗3次，梯度乙醇脫水，丙酮置換，環(huán)氧樹(shù)脂650聚合包埋，LKB-5型超薄切片機(jī)切片，醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙染，H-7500透射電鏡觀察、拍照，觀察精子的超微結(jié)構(gòu)。

1.2.3 活力觀察

精液采集 用吸水紙或干毛巾吸干雄魚(yú)生殖孔表面及周圍的水分并擦凈，由前往后輕壓魚(yú)腹兩側(cè)獲得精液。用干燥潔凈的載玻片接取精液，置于冰浴中備用。要求精液乳白色、粘稠、無(wú)水、無(wú)血、無(wú)尿、無(wú)糞便，遇水后能迅速散開(kāi)。采集的精液樣品應(yīng)至少每10 min更換一次，避免在空氣中長(zhǎng)時(shí)間暴露導(dǎo)致精子失活影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

試驗(yàn)液配制 配置3種不同陽(yáng)離子試驗(yàn)液，每種試驗(yàn)液用曝氣去離子水配制6～7個(gè)濃度梯度：

NaCl溶液：0 mmol·L-1、10 mmol·L-1、25 mmol·L-1、50 mmol·L-1、75 mmol·L-1和100 mmol·L-1。

KCl溶液：0 mmol·L-1、0.1 mmol·L-1、0.3 mmol·L-1、0.5 mmol·L-1、0.7 mmol·L-1、0.9 mmol·L-1和1.0 mmol·L-1。

CaCl2溶液：0 mmol·L-1、1 mmol·L-1、3 mmol·L-1、5 mmol·L-1、10 mmol·L-1、15 mmol·L-1和20 mmol·L-1。

活力觀察 參照魯大椿(1989)的方法將寬體沙鰍精子的運(yùn)動(dòng)分為快速運(yùn)動(dòng)、中速運(yùn)動(dòng)、慢速運(yùn)動(dòng)和原地顫動(dòng)4個(gè)階段。有效運(yùn)動(dòng)時(shí)間(effective movement time，ET)是快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間與中速運(yùn)動(dòng)時(shí)間之和，為精子的有效受精時(shí)間。精子壽命(sperm life time，ST)指精子從激活開(kāi)始,到約90%的精子停止原地顫動(dòng)所需的時(shí)間。

活力測(cè)定 用干凈潤(rùn)洗過(guò)的膠頭滴管滴半滴試驗(yàn)液于干燥潔凈的載玻片上，置于Motic-BA210顯微鏡(40×)上，調(diào)節(jié)顯微鏡至視野清晰。用干凈牙簽蘸取少許新鮮寬體沙鰍精液于視野可見(jiàn)范圍內(nèi)的試驗(yàn)液調(diào)勻，同時(shí)按下秒表計(jì)時(shí)。觀察視野范圍中精子的運(yùn)動(dòng)狀況，記錄快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間、中速運(yùn)動(dòng)時(shí)間、慢速運(yùn)動(dòng)時(shí)間和壽命。每個(gè)濃度連續(xù)觀察30次，結(jié)果用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 19.0和Excel 2003對(duì)實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 寬體沙鰍精子的外部形態(tài)

掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，寬體沙鰍精子充滿了整個(gè)精巢小葉腔(圖版Ⅰ：1)。精子由頭部、中片和尾部組成(圖版Ⅰ：2)。頭部圓球形，長(zhǎng)徑2.525 μm±0.197 μm，短徑2.181 μm±0.148 μm；中片漏斗形，較短，長(zhǎng)0.420 μm±0.033 μm;尾部為一細(xì)長(zhǎng)的鞭毛。

2.2 寬體沙鰍精子的超微結(jié)構(gòu)

頭部 透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，寬體沙鰍精子頭部無(wú)頂體，外被質(zhì)膜，質(zhì)膜表面凹凸不平，呈現(xiàn)微小波浪狀，細(xì)胞質(zhì)甚少(圖版Ⅰ：3，4)。整個(gè)精子頭部幾乎被細(xì)胞核占據(jù)，核內(nèi)染色質(zhì)致密，偶見(jiàn)零星分布的核空泡，核空泡大小0.37 μm，其內(nèi)可見(jiàn)有電子致密狀顆粒分布，核膜緊貼質(zhì)膜(圖版Ⅰ：3)。核后有一凹陷的植入窩且植入窩偏向一側(cè)，植入窩凹陷深度約為細(xì)胞核長(zhǎng)徑的1/6(圖版Ⅰ：4)。

中片 寬體沙鰍精子中片較短，由中心粒復(fù)合體、袖套及少量線粒體組成。中心粒復(fù)合體由近端中心粒和基體組成(圖版Ⅰ：4)。近端中心粒與基體呈“L”形排列，基體起始端橫斷面可見(jiàn)“9+2”型雙聯(lián)微管結(jié)構(gòu)且基體兩側(cè)底部分別有少量線粒體分布(圖版Ⅰ：4)。袖套緊接細(xì)胞核的后端，不對(duì)稱分布于鞭毛兩側(cè)，中央空隙為袖套腔(圖版Ⅰ：4)。袖套一側(cè)狹長(zhǎng)，內(nèi)含線粒體1～2個(gè)(圖版Ⅰ：3)；另一側(cè)肥厚，內(nèi)含數(shù)個(gè)線粒體和多個(gè)囊泡(圖版Ⅰ：3，4)。線粒體橢圓形，其內(nèi)嵴清晰可見(jiàn)(圖版Ⅰ:3)。

圖版Ⅰ 寬體沙鰍精子超微結(jié)構(gòu)

Plate Ⅰ Ultrastructural of the sperm ofSinibotiareevesae

1. 精子(sp)充滿整個(gè)小葉腔; 2. 成熟精子, 示頭部(H), 中片(M)和鞭毛(F); 3. 精子頭部縱切, 示核膜(NM), 核空泡(NV), 精子細(xì)胞質(zhì)膜(PM), 袖套腔(S), 囊泡(V)和鞭毛(F); 4. 精子頭部縱切, 示基體(BB), 線粒體(Mt), 近端中心粒(PC)和細(xì)胞核(N); 5. 鞭毛縱切，示軸絲(A); 6. 鞭毛橫切，示中央微管(CM)，動(dòng)力蛋白臂(DA)和外周二聯(lián)管(PD)。

1. Sperm (sp) in the lobules of the rip testis ofS.reevesae; 2. Mature sperm, showing head (H), mid-piece (M) and flagellum (F); 3. Logitudinal section of a mature sperm, showing nuclear membrance (NM), nuclear vacuole (NV), plasma membrance of the sperm (PM), central space of sleeve (S), vesicle (V) and flagellum (F); 4. Logitudinal section of a mature sperm, showing basal body (BB), mitochondrion (Mt), nucleus (N) and proximal centriole (PC); 5. Logitudinal section of a flagellum, showing axoneme (A); 6. Transverse section of a flagellum, showing central microtube (CM), dynein arm (DA) and peripheral doublet microtube (PD).

尾部 寬體沙鰍精子的尾部起始于袖套腔并由基體長(zhǎng)出的軸絲外延形成，其主要結(jié)構(gòu)為軸絲(圖版Ⅰ：5)。軸絲為典型的“9+2”型雙聯(lián)微管結(jié)構(gòu)，微管膜結(jié)構(gòu)及動(dòng)力蛋白臂清晰可見(jiàn)(圖版 Ⅰ：6)。尾部外表面質(zhì)膜向外突出形成側(cè)鰭，側(cè)鰭呈兩側(cè)對(duì)稱或等比例分為3支，尾部后段側(cè)鰭較前段發(fā)達(dá)(圖版 Ⅰ：3，6)。

2.3 NaCl對(duì)寬體沙鰍精子活力的影響

在Na+濃度0～100 mmol·L-1范圍內(nèi)，精子均可存活，精子活力在75 mmol·L-1時(shí)達(dá)到最高，此時(shí)精子的有效運(yùn)動(dòng)時(shí)間和壽命分別為(37.45±4.43) s和(98.93±8.78) s。對(duì)照組中精子活力最低。單因素方差分析，Duncan多重檢驗(yàn)顯示：精子有效運(yùn)動(dòng)時(shí)間在75 mmol·L-1與50 mmol·L-1之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，在75 mmol·L-1與其余各組之間差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；精子壽命在75 mmol·L-1與其他5種不同濃度的NaCl溶液之間差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(圖1)。

2.4 KCl對(duì)寬體沙鰍精子活力的影響

精子在K+濃度0～1.0 mmol·L-1范圍內(nèi)均具活力，在0.5 mmol·L-1時(shí)達(dá)到最高，此時(shí)精子的有效運(yùn)動(dòng)時(shí)間和壽命分別為(26.05±1.86) s和(52.78±2.96) s。有效運(yùn)動(dòng)時(shí)間和壽命分別在對(duì)照組和K+濃度1.0 mmol·L-1時(shí)最短。單因素方差分析，Duncan多重檢驗(yàn)顯示：精子有效運(yùn)動(dòng)時(shí)間和壽命在0.5 mmol·L-1與在其他6種不同濃度的KCl溶液之間差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(圖2)。

2.5 CaCl2對(duì)精子活力的影響

精子在Ca2+濃度為0～20 mmol·L-1范圍內(nèi)均具活力，在5 mmol·L-1時(shí)有效運(yùn)動(dòng)時(shí)間達(dá)到最高，為(19.61±0.99) s；在10 mmol·L-1時(shí)壽命最高，為(61.30±7.14) s。精子活力的最低有效時(shí)間和最低壽命分別在20 mmol·L-1和0 mmol·L-1時(shí)。單因素方差分析，Duncan多重檢驗(yàn)顯示：精子有效運(yùn)動(dòng)時(shí)間和壽命在5.0 mmol·L-1與其他6組不同濃度的CaCl2溶液之間差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(圖3)。

圖1 不同濃度NaCl對(duì)寬體沙鰍精子活力的影響

Fig. 1 The effect of diverse concentrations of NaCl onSinibotiareevesaesperm

圖2 不同濃度KCl對(duì)寬體沙鰍精子活力的影響

圖3 不同濃度CaCl2對(duì)寬體沙鰍精子活力的影響

3 討論

3.1 寬體沙鰍精子的超微結(jié)構(gòu)

魚(yú)類精子的形態(tài)結(jié)構(gòu)因物種的不同略有差異，其頭部形態(tài)及內(nèi)部構(gòu)造顯示出了種屬的差異及受精方式的相關(guān)性(劉雪珠，楊萬(wàn)喜，2002)。精子按其頭部的形狀大致分為3類：螺旋形、柱塞形和圓形(劉雪珠，楊萬(wàn)喜，2002)。寬體沙鰍精子頭部圓球形，為真骨魚(yú)類所特有(謝從新，2012)。頭部長(zhǎng)徑(2.525±0.197) μm，短徑(2.181±0.148) μm，較泥鰍Misgurnusanguillicaudatus(長(zhǎng)徑2.1 μm，短徑1.6 μm)(高令秋等，1995)、大鱗副泥鰍Paramisgurnusdabryanus(長(zhǎng)度1.79 μm±0.28 μm)(李飛等，2011)和長(zhǎng)薄鰍Leptobotiaelongata(直徑0.9～1.1 μm)(王志堅(jiān)等，2009)精子頭部長(zhǎng)。已有研究表明，絕大多數(shù)硬骨魚(yú)類精子頭部直徑與其卵膜表面的受精孔大小有關(guān)，這是魚(yú)類保證單精受精的重要因素(王永明，2011)。寬體沙鰍精子頭部前端無(wú)頂體，與長(zhǎng)薄鰍和大多數(shù)鯉科魚(yú)類相同，為非頂體型(劉筠，1993)。頭部細(xì)胞核中偶見(jiàn)核空泡分布。透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)核空泡無(wú)生物膜包裹，為一種非泡狀結(jié)構(gòu)，且空泡內(nèi)有電子致密狀顆粒分布。該現(xiàn)象與黃顙魚(yú)Pelteobagrusfulvidraco(尤永隆，林丹軍，1996a)中的觀察結(jié)果一致。大多數(shù)硬骨魚(yú)類精子頭部細(xì)胞核的后端均存在植入窩，如黃顙魚(yú)精子的植入窩呈井狀(尤永隆，林丹軍，1996a)，鯉Cyprinuscarpio精子的植入窩周圍有多余的核膜(尤永隆，林丹軍，1996b)。寬體沙鰍精子的植入窩凹陷,凹陷深度為細(xì)胞核長(zhǎng)徑的1/6，不如長(zhǎng)吻鮠精子植入窩發(fā)達(dá)(凹入深度約為長(zhǎng)徑的5/6)(張耀光等，1993)。寬體沙鰍質(zhì)膜與核膜緊貼，與鯉形目鰍科的長(zhǎng)薄鰍(王志堅(jiān)等，2009)和鯉科的鯉(尤永隆，林丹軍，1996b)結(jié)構(gòu)相同，與鱸形目鮨科的斜帶石斑魚(yú)Epinepheluscoioides(趙會(huì)宏等，2003)質(zhì)膜與核膜之間存在細(xì)胞質(zhì)和少量囊泡不同。這種細(xì)胞質(zhì)的多少及囊泡的存在有何生理意義尚待進(jìn)一步研究。

硬骨魚(yú)類精子中片的有無(wú)尚存爭(zhēng)議，尤永隆和林丹軍(1997)認(rèn)為硬骨魚(yú)類精子頭部與中片連接緊密，中性粒復(fù)合體與細(xì)胞核相并列，不應(yīng)將之排斥在頭部之外。結(jié)合寬體沙鰍的掃描電鏡結(jié)果，寬體沙鰍精子中片是相對(duì)獨(dú)立的，其由中心粒復(fù)合體和袖套組成。中心粒復(fù)合體包含近端中心粒與基體，兩者呈“L”形排列。這與鯉(尤永隆，林丹軍，1996b)的研究結(jié)果相同，與斜帶石斑魚(yú)的“〉”形(趙會(huì)宏等，2003)較為類似，與硬骨魚(yú)類精子常見(jiàn)的“T”形(Billard，1986)不同。袖套大多存在于硬骨魚(yú)類精子中，為精子儲(chǔ)能倉(cāng)庫(kù)，其形態(tài)和結(jié)構(gòu)因硬骨魚(yú)類種屬關(guān)系略有差異(劉雪珠，楊萬(wàn)喜，2002)：西伯利亞鱘Acipenserbaerii精子未見(jiàn)袖套結(jié)構(gòu)(章龍珍等，2003)；尼羅羅非魚(yú)Tilapianilotica精子的袖套分為上段和下段兩部分，上段較厚，含有較多線粒體和囊泡，下段較薄，僅含有多余的核膜(尤永隆，林丹軍，1998)；哲羅魚(yú)Huchotaimen精子的袖套兩側(cè)不對(duì)稱，線粒體不規(guī)則排列且存在部分線粒體融合現(xiàn)象(尹洪濱等，2008)；鯉精子的袖套包括肥厚一側(cè)和狹窄一側(cè)，肥厚一側(cè)含較多的線粒體和囊泡，狹窄一側(cè)線粒體則較少(尤永隆，林丹軍，1996b)。寬體沙鰍的袖套結(jié)構(gòu)與鯉相似。

魚(yú)類精子尾部的主要結(jié)構(gòu)為軸絲，Jamieson等(2009)依據(jù)軸絲的位置，將精子分為Ⅰ型(鞭毛軸絲與細(xì)胞核底部垂直)和Ⅱ型(鞭毛軸絲與細(xì)胞核橫向平行)2種。寬體沙鰍精子屬于Ⅰ型，與鯉形目鰍科的長(zhǎng)薄鰍(王志堅(jiān)等，2009),鯉科的鯉(尤永隆，林丹軍，1996b)、銅魚(yú)Coreiusheterokon(鄭曙明，1997)、稀有鮈鯽Gobiocyprisrarus(王永明，2011)，鲇形目鲿科的黃顙魚(yú)(尤永隆，林丹軍，1996a),鱸形目鮨科的斜帶石斑魚(yú)(趙會(huì)宏等，2003)相同;而與鱸形目石首魚(yú)科的黃姑魚(yú)Nibeaalbiflora和大黃魚(yú)Pseudosciaenacrocea(胡謀等，2014)不同。寬體沙鰍精子尾部軸絲為典型的“9+2”型雙聯(lián)微管結(jié)構(gòu)，與大多數(shù)硬骨魚(yú)類相同(尤永隆，林丹軍，1996b；趙會(huì)宏等，2003；王永明，2011)，與同屬于鰍科的長(zhǎng)薄鰍“9+3”型(王志堅(jiān)等，2009)不同。側(cè)鰭的形態(tài)及存在與否，不同的魚(yú)類表現(xiàn)不一。斜帶石斑魚(yú)尾部無(wú)側(cè)鰭(趙會(huì)宏等，2003)；哲羅魚(yú)精子一側(cè)側(cè)鰭較另一側(cè)發(fā)達(dá)(尹洪濱等，2008)；長(zhǎng)薄鰍兩側(cè)側(cè)鰭均發(fā)達(dá)(王志堅(jiān)等，2009)。與上述魚(yú)類不同，寬體沙鰍精子尾部側(cè)鰭發(fā)達(dá)且呈兩側(cè)對(duì)稱或等比例分為3支。有關(guān)側(cè)鰭的有無(wú)能否影響精子游泳速率，進(jìn)而影響受精率，不同學(xué)者觀點(diǎn)不同。Stoss(1983)認(rèn)為側(cè)鰭對(duì)于改善精子的游泳速率，提高卵子受精率有重要意義。而Afzelius(1978)則認(rèn)為側(cè)鰭與精子游泳速率的提高關(guān)系不大。寬體沙鰍精子側(cè)鰭的特殊形態(tài)可能與其鞭毛的擺動(dòng)方式有關(guān)，具兩側(cè)側(cè)鰭的精子鞭毛可能呈上下或左右擺動(dòng)，具3個(gè)分支側(cè)鰭的精子鞭毛可能呈螺旋形擺動(dòng)，有關(guān)側(cè)鰭是否能提高其精子的游泳速率有待進(jìn)一步研究。

3.2 不同濃度Na+、K+、Ca2+對(duì)寬體沙鰍精子活力的影響

Na+、K+和Ca2+既是魚(yú)類血漿、精漿的重要組分，也是構(gòu)成滲透壓和影響精子活力的主要離子(蘇德學(xué)等，2004)。已有研究表明，適當(dāng)濃度的Na+可通過(guò)誘發(fā)精子細(xì)胞膜去極化產(chǎn)生動(dòng)作電位，間接地激活精子運(yùn)動(dòng)(徐革鋒等，2005)；精漿中高濃度的K+能抑制虹鱒Oncorhynchusmykiss和馬蘇大麻哈魚(yú)Oncorhynchusmasou精子的活動(dòng)(Mosrisawaetal.，1983)；精子細(xì)胞內(nèi)的Ca2+也是激活精子的必需因素(Hadi Alavi，2004)。本實(shí)驗(yàn)測(cè)得，寬體沙鰍精子的最適Na+、K+、Ca2+濃度分別為75 mmol·L-1(0.44% NaCl)、0.5 mmol·L-1(0.0037% KCl)和5 mmol·L-1(0.055% CaCl2)。最適Na+濃度與泥鰍(0.50%)(柴毅等，2009)相當(dāng)，較寬口光唇魚(yú)Acrossocheilusmonticolus(0.51%)(羅芬，何學(xué)福，1999)、稀有鮈鯽(0.55%)(王永明等，2011)低。最適K+、Ca2+濃度均較泥鰍(阮國(guó)良等，2004)低。因此，魚(yú)類精子對(duì)各種激活介質(zhì)的最適濃度因種而異，可能與其生存環(huán)境和精漿組成相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Na+、K+、Ca2+均對(duì)寬體沙鰍精子的激活具有促進(jìn)作用，但較高濃度的Na+、K+、Ca2+皆能抑制寬體沙鰍精子的活力。建議人工授精時(shí)采用適當(dāng)濃度的激活介質(zhì)，對(duì)于硬度較高的水體，應(yīng)適當(dāng)降低硬度。有關(guān)Na+、K+、Ca2+在寬體沙鰍精子激活過(guò)程中的作用機(jī)理還有待進(jìn)一步的研究。

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Ultrastructural Observation of the Sperm ofSinibotiareevesaeand Effect of Na+, K+and Ca2+on its Motility

WANG Yongming1, CHEN Yu1, HU Yu2, XIE Biwen1*, YUE Xingjian1, WANG Fang1, QI Zemin1, WANG Yu1

(1. College of Life Sciences, Neijiang Normal University, Conservation and Utilization of Fishes Resources in the Upper Reaches of the Yangtze River Key Laboratory of Sichuan Province, Neijiang, Sichuan Province 641112, China;2. Southwest University, Key Laboratory of Aquatic Organism Reproduction and Developement, Chongqing 400715, China)

In order to study the ultrastructure of the sperm ofSinibotiareevesaeand the effect of Na+, K+and Ca2+on its motility, JSM 6510LV scanning electron microscope, H-7500 transmission electron microscope and Motic-BA210 digital microscope were used, respectively. The results showed that the head ofS.reevesaesperm was round without acrosome. There was an implantation fossa in the end of the nucleus and about 1/6 of the length of nuclei. The mid-piece consisted of centriolar complex and sleeves. The centriolar complex was divided into proximal centriole and matrix and arranged in an “L” type. Sleeves were found on both sides of axon, and one side was long and narrow, whereas the other side was hypertrophy. The tail was a typical “9+2” type consisting of axoneme. In conclusion, the best activation medium ofS.reevesaesperm should be made by deionized water with NaCl 75 mmol·L-1, KCl 0.5 mmol·L-1and CaCl25 mmol·L-1. It suggested that the optimal activation medium should be selected while using artificial insemination.

Sinibotiareevesae; sperm; ultrastructure; sperm motility

10.11984/j.issn.1000-7083.20150213

2015-06-18 接受日期：2015-10-29

四川省教育廳重大培育項(xiàng)目(09ZZ012); 四川省省屬高?？蒲袆?chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(KYTD201009); 四川省科技支撐項(xiàng)目(2011NZ0075)

王永明(1985—), 男, 講師, 研究方向?yàn)轸~(yú)類形態(tài)及發(fā)育生物學(xué)

*通信作者Corresponding author， 教授, E-mail:xiebw6873@163.com

Q959.4

A

1000-7083(2016)01-0038-06