王立志， 徐誼英

(四川農業(yè)大學動物營養(yǎng)研究所，動物抗病營養(yǎng)教育部重點實驗室，四川雅安625014)

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圈養(yǎng)大熊貓糞便中微生物多樣性的研究

王立志*， 徐誼英

(四川農業(yè)大學動物營養(yǎng)研究所，動物抗病營養(yǎng)教育部重點實驗室，四川雅安625014)

本試驗采集了5只圈養(yǎng)成年大熊貓的新鮮糞便，用高通量測序技術，研究了大熊貓糞便中細菌和古菌的結構和組成。試驗結果表明：圈養(yǎng)成年大熊貓糞便細菌主要由變形菌門Proteobacteria(74.45%)、厚壁菌門Firmicutes(15.66%)、擬桿菌門Bacteroidetes(4.34%)、藍藻門Cyanophyta/色球藻綱Chroococcophyceae(4.01%)等組成，其中變形菌門主要以埃希氏桿菌屬Esherichia/志賀氏菌屬Shigella(49.84%)為主；厚壁菌門主要以梭菌屬Clostridium(4.65%)為主；擬桿菌門主要以穩(wěn)桿菌屬Empedobacter(3.51%)為主；藍藻門全部為未分類的色球藻綱(4.01%)。古菌主要由泉古菌門Crenarchaeota(55.99%)和廣古菌門Euryarchaeota(42.33%)組成，其中優(yōu)勢古菌是熱變形菌綱Thermoprotei(55.99%)中未分類的屬和產甲烷菌屬Methanogenium(24.70%)。

大熊貓；細菌；古菌；高通量測序

大熊貓Ailuropodamelanoleuca是我國特有的珍稀瀕危動物，屬食肉目，其消化器官和消化酶至今仍保留著肉食性動物的特點，但它已高度特化為以竹類植物性食物為生的動物。與其他動物一樣，大熊貓胃腸道內定居著種群龐大的微生物，主要由細菌、真菌、原蟲等構成(費立松等，2005；周杰瓏等，2012)，與其消化生理、健康、疾病的發(fā)生和發(fā)展有著密切的關系。大熊貓經常發(fā)生腸道疾病，尤其在圈養(yǎng)的情況下，腸道疾病是影響大熊貓健康的重要因素，這與大熊貓腸道菌群紊亂可能存在重要關系。但有關大熊貓腸道菌群的研究報道較少。

以往通過傳統培養(yǎng)的方法和小規(guī)模測序技術，大熊貓腸道大量的細菌、少量的真菌和纖毛蟲已被分離鑒定。而有關大熊貓糞便中古菌的研究還未見報道。本實驗采用高通量測序技術對圈養(yǎng)成年大熊貓腸道細菌和古菌多樣性進行分析，旨在了解成年大熊貓腸道正常細菌和古菌的多樣性及其優(yōu)勢菌群，一方面有助于深入了解大熊貓的消化生理，為大熊貓腸道疾病的預防和治療、大熊貓放歸等提供科學的試驗參考；另一方面有助于人們更加科學全面地認識動物胃腸道古菌的多樣性，為研究動物源甲烷減排技術提供參考。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

在中國保護大熊貓研究中心雅安碧峰峽基地采集5只圈養(yǎng)成年雌性大熊貓(1只11歲，3只8歲，1只7歲)的新鮮糞便。所有采樣的大熊貓均以竹子為主食，每天飼喂1.6 kg窩窩頭，并飼喂少量的蘋果、胡蘿卜等，在采樣之前已穩(wěn)定采食該日糧30 d以上。清晨待大熊貓排糞后，立即無菌收集糞便中未污染的100 g左右的樣品，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 糞便微生物總DNA提取

稱取200 mg糞便樣本至2 mL離心管中，向樣本中加入1.4 mL糞便樣品裂解緩沖液(ASL)，混合均勻，用TIANGEN公司糞便DNA提取試劑盒(TIANamp Stool DNA Kit)抽提樣品微生物總DNA。具體步驟參照試劑盒說明書進行。

1.3 PCR擴增

針對樣品中細菌的16S rRNA V3～V4區(qū)，選用細菌特異性引物對515F(5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’)和806R(5’-GGACTACVSGGGTATCTAAT-3’)進行擴增；針對樣品中古菌的16S rRNA V4～V5區(qū)，選用古菌特異性引物對A349F：(5’-GYGCASCAGKCGMGAAW-3’)和A806R：(5’-GGACTACVSGGGTATCTAAT-3’)進行擴增，擴增體系和擴增條件參照文獻進行(Hristovetal.，2012)。

每個樣品做3個重復，將同一樣品的PCR產物混合后,用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，分別使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN公司)、QIAquick Gel Extraction Kit凝膠回收試劑盒(Qiagen公司)切膠回收細菌和古菌PCR產物。細菌的5個擴增樣品編號為C1(11歲)、C2(8歲)、C3(8歲)、C4(8歲)、C5(7歲)；對應的古菌的5個擴增樣品編號為P1(11歲)、P2(8歲)、P3(8歲)、P4(8歲)、P5(7歲)。

1.4 高通量測序

將細菌和古菌的PCR擴增產物送深圳千年盛世基因科技有限公司分別采用Illumina公司的MiSeq 250PE、MiSeq 300PE測序平臺進行高通量測序。

1.5 高通量測序數據的處理及分析

用Mothur軟件(Schlossetal.，2009)將測序所得原始數據去除引物和標簽，并根據序列的重疊關系進行拼接；用QIIME軟件(Caporasoetal.，2010)對拼接的序列進行過濾(去除序列平均堿基質量值小于Q25，未知堿基數大于6，序列長度小于200 bp和大于500 bp，引物信息與合成的引物堿基存在錯配的序列)；將以上過濾得到的序列與數據庫(http://drive5.com/usearch/manual/uchime_algo.html)進行比對，去除其中的嵌合體，得到有效序列；使用UCLUST軟件(Edgar，2010)對有效序列進行聚類，根據97%相似性水平(McKennaetal.，2008)將序列聚類成為聚類分類操作單元(operational taxonomic units, OTU)，并挑選豐度最高的序列作為OTU代表序列；用PyNAST(Caporasoetal.，2010)將OTU代表序列與Greengenes 16S rRNA數據庫(http://greengenes.lbl.gov/)進行比對，用RDP分類器(Coleetal.，2009)對OTU代表序列從門到屬進行物種注釋，然后繪制稀釋曲線；最后，對所有樣品的共享屬進行分析，并用R軟件(http://cran.rstudio.com)繪制共享熱圖。根據各個樣品OTU的種類及其豐度，計算樣品間的Unweighted Unifrac距離，并進行β多樣性分析。

2 試驗結果

2.1 大熊貓糞便中細菌的組成

本試驗共獲得屬于細菌的有效序列84 614條，平均每個樣品16 922條，共獲得848個OTU。根據取樣數量與OTU數目構建的稀釋曲線(圖1)可以看出，當取樣數達到5時，稀釋曲線的上升趨勢明顯變緩，這意味著本次試驗5個樣品數基本可以滿足大熊貓糞便細菌多樣性研究的需要。序列通過物種注釋可分為20門42綱64目123科242屬。在門、綱、目、科、屬水平上平均相對豐度大于4%的分別為：變形菌門(74.46%)、厚壁菌門(15.66%)、擬桿菌門(4.34%)和藍藻門(4.01%)(圖2：A)；γ-變形菌綱(74.02%)、芽孢桿菌綱(8.79%)、梭菌綱(6.52%)、黃桿菌綱(4.13%)、色球藻綱(4.01%)(圖2：B)；腸桿菌目(67.04%)、芽孢桿菌目(7.44%)、梭菌目(6.52%)、假單胞菌目(5.97%)、黃桿菌目(4.13%)(圖2：C)；腸桿菌科(67.04%)、莫拉菌科(4.75%)、梭菌科(4.68%)、黃桿菌科(4.13%)、未分類的色球藻綱(4.01%)(圖2：D)；埃希氏桿菌屬/志賀氏菌屬(49.84%)、不動桿菌屬(4.73%)、梭菌屬(4.65%)、木霉(4.01%)(圖2：E)。

2.2 大熊貓糞便中古菌的組成

本試驗共獲得屬于古菌的有效序列5460條，平

圖1 基于采樣數量的OTU稀疏分析

均每個樣品1092條。序列經物種注釋后得到295個OTU。根據取樣數量與OTU數目構建的稀釋曲線(圖3)可以看出，5個樣品數基本可以滿足大熊貓糞便古菌多樣性研究的需要。序列的物種注釋結果顯示，全部古菌OTU可分為3門8綱11目14科15屬。在門水平上包括泉古菌門(55.99%)、廣古菌門(42.33%)和未鑒定的古菌(1.68%)(表1)。泉古菌門主要由未分類的古菌組成，還包括Fervidicoccus和硫化葉菌屬，但分別只占總序列數的0.03%和0.02%。廣古菌門主要由甲烷短桿菌屬(21.22%)、熱裸單孢菌屬(5.70%)、甲烷微菌屬(2.48%)、甲烷球形菌屬(0.76%)、甲烷微球菌屬(0.21%)、甲烷粒菌屬(0.04%)組成。

2.3 共享屬分析

從屬的水平對樣品間共享的細菌種類和豐度進行了分析，結果發(fā)現，5只大熊貓之間的細菌共享屬共有31個(圖4)。從圖中可以看出，樣品C1中哈夫尼菌屬等12個屬、樣品C2中鞘氨醇單胞菌屬等12個屬、樣品C3中Luteibacter等8個屬、樣品C4中鞘氨醇單胞菌屬等10個屬、樣品C5中假單胞菌屬等12個屬分別高于它們各自在5個樣品中的平均含量(紅色部分，顏色越深，高出平均值越多)。大熊貓腸道古菌的共享屬只有4個(表2)，即甲烷短桿菌屬、甲烷微菌屬、甲烷微球菌屬和熱裸單胞菌屬，且前3個共享屬均屬于產甲烷菌。

圖2 基于各水平上的微生物物種組成

A. 基于門水平的物種組成, B. 基于綱水平的物種組成, C. 基于目水平的物種組成, D. 基于科水平的物種組成, E. 基于屬水平的物種組成; 在不同分類水平上平均相對豐度低于1%的分類統一合并為“other”。

A, B, C, D and E presented the bacterial community composition at phylum, class, order, family and genus level, respectively; The taxa whose abundance were less than 1% at different taxonomic level were merged into “other”.

表1 圈養(yǎng)大熊貓糞便中古菌的組成

圖3 基于采樣數量的古菌OTU稀疏分析

表2 樣品間古菌共享屬

2.4 β多樣性分析

根據大熊貓糞便中細菌、古菌各自OTU的種類及豐度，采用 QIIME軟件，計算得到了樣品兩兩間的Unweighted Unifrac距離。根據細菌的種類和豐度計算出的大熊貓不同個體間Unweighted Unifrac距離最大為0.23(C1與C3之間),最小為0.04(C2與C5之間)，平均值為0.10±0.08，說明大熊貓糞便中細菌的結構與組成相似度很高；基于Unweighted Unifrac距離矩陣，使用非加權組平均法(unweighted pair group method with arithmetic mean, UPGMA)對樣品進行聚類分析(圖5:A),除了1只老年個體(C1)與其他個體間聚集度較低外，其他樣品聚集度都很高。根據古菌計算出的個體間Unweighted Unifrac距離最大為0.56(P1與P4之間),最小為0.20(P3與P5之間)，平均值為0.36±0.12，說明大熊貓糞便中古菌的結構與組成相似度較細菌低，UPGMA聚類結果見圖5B，老年個體(P1)與其他個體間聚集度較低。

3 討論

以大熊貓糞便為研究對象，張志和等(1995)、熊焰等(2000)以傳統的培養(yǎng)法，Wei等(2007)和何廷美等(2012)運用16S rDNA小規(guī)模測序技術都曾研究過大熊貓腸道菌群多樣性。本實驗采用高通量測序技術共獲得了84 614條屬于細菌的有效序列，經物種注釋共得到848個OTU，鑒定出的細菌種類遠多于以往的研究結果。

圖4 樣本間細菌共享屬的聚類熱圖

Fig. 4 The clustering of bacterial genera shared by all samples

圖5 大熊貓樣品的UPGMA聚類圖

本研究發(fā)現，在門水平上，大熊貓糞便中細菌以變形菌門為主，與Fang等(2012)的研究結果基本一致，但與其他動物有很大差異。一般食草動物(牛、梅花鹿)胃腸道微生物都以厚壁菌門和擬桿菌門為主(Jami & Mizrahi，2012；李志鵬，2013)。大熊貓雖然也以植物——竹子為主食，在其腸道內也檢測到了纖維消化菌(Zhuetal.，2011)，但它并不具備一個專門消化植物粗纖維的器官，其腸道也不適宜消化植物纖維的微生物大量定植繁衍，這也許就是大熊貓對竹子消化率非常低，腸道厚壁菌門和擬桿菌門微生物含量低的原因。然而，Zhu等(2011)和Tun等(2014)的研究結果都顯示大熊貓糞便中的微生物以厚壁菌門為主。Zhu等(2011)的研究對象是8只圈養(yǎng)大熊貓和7只野生大熊貓，這15個樣品的總體平均是以厚壁菌門為主，但是如果單看圈養(yǎng)的大熊貓，變形菌門是大熊貓糞便中的優(yōu)勢菌，與本研究的結果相同。Tun等(2014)研究發(fā)現，2只成年和2只老年大熊貓糞便中，豐度最高的是厚壁菌門(42%～79%)，其次是變形菌門(21%～58%)。造成這種差異的原因可能主要在于DNA提取方法的差異。厚壁菌門的細菌DNA在提取時，需要在95 ℃處理10 min，同時需要機械破壁。本實驗在提取DNA時沒有采取這些措施，因此有可能導致厚壁菌門的豐度被低估。

本次試驗在大熊貓糞便中發(fā)現大量藍細菌，以往還未見這類細菌在其他動物胃腸道中被檢測到的報道。藍細菌為原核生物，是一種能產生氧氣的光合細菌，主要分布于河流、湖沼和海洋等水體中(Esquenazietal.，2011)。四川氣候潮濕，這就使得大量的藍細菌可以滋生于竹子莖葉上，當其隨竹子被大熊貓采食進入體內后，由于大熊貓對食物的消化率低，大量未被消化的藍細菌就會隨糞便排出體外。因此，雖然大熊貓糞便菌群中藍細菌的相對豐度較高，也許它并不發(fā)揮與消化吸收有關的任何作用，而僅僅只是作為一種過路菌存在于大熊貓腸道中。這種推測是否正確，還有待進一步的研究確認。

本試驗是首次分析大熊貓糞便中古菌多樣性的研究報道。試驗結果顯示，大熊貓糞便中豐度最高的古菌是泉古菌門的熱變形菌。這一結果與其他動物胃腸道古菌的組成有較顯著的差異。目前的研究結果顯示，動物胃腸道中的古菌絕大部分屬于廣古菌門的產甲烷菌，只有少量研究發(fā)現動物胃腸道中存在熱變形菌。如Kim等(2011)在研究RDP數據庫中來自全球各地瘤胃微生物的序列時發(fā)現，僅有11條序列屬于熱變形菌，比例非常低。本試驗檢測出如此多熱變形菌的原因可能有兩點：第一，動物胃腸道中原本就存在一定量的熱變形菌，以往受研究技術的限制，未能將之檢測出來；第二，大熊貓自身特殊的消化系統與飲食習慣相互作用，導致其消化道內微生物(特別是古菌)有別于其他動物。這種推測是否正確還有待進一步的研究。

本試驗共檢測出5個屬的產甲烷菌，其中大部分的產甲烷菌屬于甲烷短桿菌屬，這與其他動物胃腸道內產甲烷菌的優(yōu)勢菌群基本類似。研究發(fā)現，加拿大安大略地區(qū)及愛德華王子島以玉米為主要飼料的奶牛瘤胃內優(yōu)勢的產甲烷菌是甲烷短桿菌屬(51.97%、50%)，南美地區(qū)麝雉嗉囊中、挪威馴鹿瘤胃內、泌乳期的荷斯坦奶牛及娟珊牛瘤胃內、澳大利亞袋鼠前腸(春季)中甲烷短桿菌屬的數量也相當豐富(Wrightetal.，2007，2009；Evansetal.，2009；Sundsetetal.，2009a，2009b；Kingetal.，2011)。但也有與本實驗結果不一致的報道，Fouts等(2012)發(fā)現甲烷短桿菌屬和甲烷球形菌屬是牛瘤胃內的優(yōu)勢產甲烷菌，但本試驗的樣品P5中并沒有檢測出甲烷球形菌屬，并且其他4個樣品中甲烷球形菌屬的含量也較少；Min等(2014)研究肉山羊瘤胃內產甲烷菌，結果發(fā)現甲烷短桿菌屬、甲烷球形菌屬、Methanobacteriaceae是其瘤胃中的優(yōu)勢產甲烷菌；Huang等(2012)研究顯示，中國青藏高原奶牛和牦牛瘤胃內優(yōu)勢菌群是Methanomassiliicoccus；Chaudhary等(2012)研究發(fā)現，印度地區(qū)飼喂小麥秸稈的莫拉水牛瘤胃主要的產甲烷菌是甲烷粒菌屬。到目前為止，影響動物消化道產甲烷菌多樣性的主要原因仍然不清楚，但是許多因素常常單獨地或者綜合地影響著產甲烷菌的組成和數量，如宿主、日糧和地理環(huán)境等。因此，本試驗的結果與其他動物消化道內產甲烷菌多樣性有一定的差異，這可能是大熊貓與消化道產甲烷菌共同選擇的結果，也可能是大熊貓的生存環(huán)境影響了其消化道產甲烷菌的多樣性，具體原因還不清楚。

本試驗中，不論是細菌還是古菌的β多樣性分析都顯示，11歲的大熊貓個體與其他4只7～8歲的大熊貓個體之間，糞便微生物的結構和組成上差異性較大。Tun等(2014)的研究也表明，Actinobacteria門的某些組分僅出現在成年大熊貓糞便中，在老年大熊貓糞便中檢測不到，且老年大熊貓的微生物多樣性指數較成年個體的低。這是否說明年齡對大熊貓胃腸道微生物的多樣性存在顯著影響，還需要進一步研究。因為所有有關大熊貓胃腸道微生物的研究樣本數都很少，今后的研究應特別注意這一點。

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Diversity of Microorganism in the Feces of Captive Giant Pandas

WANG Lizhi*, XU Yiying

(Animal Nutrition Institute of Sichuan Agricultural University, Key Laboratory for Animal Disease-Resistance Nutrition of Ministry of Education, Ya’an, Sichuan Province 625014, China)

The structures and compositions of bacteria and archaeal in the feces of five adult captive giant pandas were studied using high-throughput sequencing technology. The results showed that the bacteria mainly consisted of Proteobacteria (74.45% of total sequences), Firmicutes (15.66%), Bacteroidetes (4.34%), and Cyanophyta/Chroococcophyceae (4.01%) at the phylum level. Within the phylum Proteobacteria,Escherichia/Shigella(49.84%) was the most abundant genus. Within the phylum Firmicutes,Clostridium(4.65%) was the most abundant genus. Within the phylum Bacteroidetes,Empedobacter(3.51%) was the most abundant genus. Within the phylum Cyanophyta//Chroococcophyceae, only the unclassified Chroococcophyceae (4.01%) was detected. The archaea mainly consisted of Crenarchaeota (55.99%) and Euryarchaeota (42.33%) at the phylum level, and the unclassified Thermoprotei (55.99%) andMethanogenium(24.70%) were the two dominant memberships at the genus level.

giant panda; bacterium; archaea; high-throughput sequencing

10.11984/j.issn.1000-7083.20150140

2015-04-19 接受日期：2015-06-23

四川省科技廳國際合作項目(2013HH0043畜禽溫室氣體排放量檢測及減排技術研究)

王立志(1974—)， 男, 博士, 副教授, 碩士生導師, 主要從事動物營養(yǎng)學研究

*通信作者Corresponding author， E-mail:wanglizhi@aliyun.com

Q959.8

A

1000-7083(2016)01-0017-07