任建枝，蔡嘉力，韓冬梅，李 萍，耿 潔，馬彩輝，韓 艷

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·論 著·

胚胎培養(yǎng)液中血管內(nèi)皮生長因子的水平及其與IVF-ET結(jié)局的關(guān)系

任建枝，蔡嘉力，韓冬梅，李 萍，耿 潔，馬彩輝，韓 艷

目的 探討體外受精-胚胎移植(IVF-ET)治療患者胚胎培養(yǎng)液中血管內(nèi)皮生長因子水平與早期胚胎質(zhì)量及胚胎移植后臨床結(jié)局的關(guān)系。方法 留取第3天胚胎培養(yǎng)液，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測培養(yǎng)液中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的水平。結(jié)果 ①兩組患者的平均年齡、獲卵數(shù)、胚胎數(shù)、優(yōu)胚數(shù)及移植胚胎的累積胚胎評分均無明顯差異(P>0.05)，妊娠組卵泡液內(nèi)VEGF 水平顯著低于非妊娠組(P<0.05)。②Ⅰ級胚胎培養(yǎng)液中VEGF水平明顯低于Ⅱ級胚胎培養(yǎng)液中VEGF水平(P<0.01)。結(jié)論 胚胎培養(yǎng)液中VEGF的水平可以作為預(yù)測胚胎質(zhì)量及妊娠結(jié)局的參考指標(biāo)之一。

血管內(nèi)皮生長因子；胚胎質(zhì)量；改良長方案

血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是一種多功能生長因子和特異性血管生長因子，具有特異性促血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂，強烈誘發(fā)活體內(nèi)新血管形成。參與多種生理活動，并在一些疾病的發(fā)病機制中起重要作用[1]。我們的既往研究表明，在排卵周期中，隨著卵泡的增大成熟，血清及卵泡液中VEGF水平也明顯增高，提示VEGF可能參與卵泡的發(fā)育[2]。然而對于VEGF在人的胚胎發(fā)育過程中的相關(guān)研究尚鮮有報道，我們試圖通過測定接受體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET)治療患者的卵裂期單胚胎培養(yǎng)液中VEGF水平, 并分析胚胎培養(yǎng)液中VEGF水平及胚胎移植后臨床結(jié)局的關(guān)系,為今后選擇移植胚胎時提供有價值的參考指標(biāo)。

1 對象與方法

1.1 對象 2014年10-12月在解放軍174醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心接受IVF-ET治療的80例患者，其中原發(fā)性不孕39例、繼發(fā)性不孕41例，年齡(30.95±4.23)歲,體重指數(shù)(BMI)為(21.16±2.14)，所有患者均符合IVF-ET適應(yīng)證。

1.2 樣本收集及處理 均采用本中心的常規(guī)促排卵方案-改良方案促排卵[3]，經(jīng)陰道B超引導(dǎo)下穿刺取卵，精液處理后選擇常規(guī)體外受精，加精后19 h觀察受精。受精后，將受精卵轉(zhuǎn)移到胚胎培養(yǎng)微滴，采用一個胚胎一個培養(yǎng)滴的微滴培養(yǎng)，胚胎培養(yǎng)置37 ℃、6%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。48 h觀察胚胎進行胚胎評分。選擇最好的2個胚胎進行移植。轉(zhuǎn)移胚胎后將胚胎培養(yǎng)液，2030 μL/滴分裝，-80 ℃超低溫冰箱保存待檢測。

1.3 移植胚胎累積胚胎評分 培養(yǎng)第3 天行胚胎評分，根據(jù)卵裂球的細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞是否均勻及是否有碎片，按Wetzels胚胎評分法[4]:①Ⅰ級胚胎(4分):細(xì)胞均勻,形狀規(guī)則,透明帶完整，胞質(zhì)均勻清晰，細(xì)胞碎片在5%；②Ⅱ級胚胎(3分):細(xì)胞大小不均勻,形狀略不規(guī)則，胞質(zhì)可有顆?，F(xiàn)象，細(xì)胞碎片在10%～20%;③Ⅲ級胚胎(2分):細(xì)胞大小明顯不均勻, 形狀明顯不規(guī)則，胞質(zhì)可有顆粒現(xiàn)象，細(xì)胞碎片在21%～50%;④Ⅳ級胚胎(1分):細(xì)胞極不均勻,胞質(zhì)可有嚴(yán)重顆?，F(xiàn)象,碎片在50%上;⑤Ⅴ級胚胎(0分)：退化、死亡胚胎。胚胎的形態(tài)評分乘以胚胎細(xì)胞數(shù),得到每個胚胎的分?jǐn)?shù)，移植周期移植胚胎分?jǐn)?shù)的總和得到每個患者移植周期的累積胚胎評分(cumulative embryo score，CES)。

1.4 分組 根據(jù)臨床結(jié)局分為臨床妊娠組與非妊娠組。臨床妊娠的診斷方法是胚胎移植后4 周行超聲檢查見妊娠囊及胎芽、原始心管搏動或刮宮見到絨毛者。

1.5 培養(yǎng)液中VEGF的檢測 培養(yǎng)液液中VEGF濃度采用ELISA法測定，測定所用試劑為VEGF試劑盒(武漢博士德生物技術(shù)有限公司),并做預(yù)試驗以調(diào)整稀釋比例。

2 結(jié) 果

2.1 不同臨床結(jié)局患者間相關(guān)指標(biāo)的比較 80例行胚胎移植者獲妊娠48 例，妊娠率為60.00%。妊娠組為48 例，非妊娠組為32 例。兩組患者的平均年齡、不孕年限、既往移植次數(shù)、基礎(chǔ)的促卵泡成熟激素(follicle stimulating hormone,FSH)水平、黃體生長素(luteinizing hormone，LH)水平、絨毛膜促性激素(human chorionic gomadotropin,HCG) 日內(nèi)膜厚度、雌激素(estradiol,E2)水平、孕激素(progesterone,P)水平、獲卵數(shù)、胚胎數(shù)、優(yōu)胚數(shù)、優(yōu)質(zhì)胚胎率及移植胚胎的累積胚胎評分均無明顯差異(P>0.05)，妊娠組胚胎培養(yǎng)液內(nèi)VEGF 水平明顯低于非妊娠組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 不同臨床結(jié)局患者間相關(guān)指標(biāo)的比較(±s)

2.2 不同質(zhì)量胚胎的胚胎培養(yǎng)液中VEGF水平 Ⅰ級胚胎(4分) 培養(yǎng)液中VEGF水平為(7.65±3.92)pg/mL，Ⅱ級胚胎(3分) 培養(yǎng)液中VEGF水平為(16.46±3.34) pg/mL。具有更良好著床潛能的Ⅰ級胚胎對應(yīng)的卵胚胎培養(yǎng)液中VEGF水平比胚胎質(zhì)量稍差的Ⅱ級對應(yīng)的卵胚胎培養(yǎng)液中VEGF水平明顯低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

3 討 論

3.1 胚胎質(zhì)量評判的方法及局限性 胚胎質(zhì)量是妊娠成功的關(guān)鍵因素之一，在目前的人類輔助生殖技術(shù)中，胚胎的形態(tài)學(xué)參數(shù)仍作為挑選胚胎的主要非侵入性指標(biāo)。形態(tài)學(xué)的評估雖然對于挑選胚胎進行移植提供了簡便有效的方法，然而，不少通過形態(tài)學(xué)方法評估為優(yōu)質(zhì)胚胎移植后卻未能著床。目前胚胎形態(tài)學(xué)評估存在諸多問題，如缺少可量化的指標(biāo)、受到實驗室技術(shù)人員主觀因素的影響。因此如何增加預(yù)測方法、提高預(yù)測早期胚胎發(fā)育潛能的能力成為當(dāng)務(wù)之急。測量胚胎代謝產(chǎn)物中胚胎內(nèi)源性因子來評估胚胎發(fā)育潛能因其非侵入性、風(fēng)險低等優(yōu)點而可能成為評估胚胎質(zhì)量的有效方法。早年，Risau[5]在動物實驗中發(fā)現(xiàn)VEGF作為血管形成關(guān)鍵的始動因子作用于早期的誘生階段，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂增生，形成原始血管，再通過血管生成素1和酪氨酸蛋白激酶B2的協(xié)同作用使該血管重塑而成熟, 從空間、時間、數(shù)量的不同角度敏感地調(diào)節(jié)血管生長。在小鼠體外胚胎培養(yǎng)過程中去除VEGF，胚胎發(fā)育遲緩甚至停止，再加入VEGF后，胚胎發(fā)育恢復(fù)正常并可見心血管形成[6]。近年來在豬的未成熟卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)及體外受精的研究中發(fā)現(xiàn)[7]，培養(yǎng)液中加入VEGF組的卵母細(xì)胞體外成熟率、受精率及囊胚形成率均高于未加入組。而對于VEGF在人的胚胎發(fā)育過程中的相關(guān)研究尚鮮有報道。

3.2 不同臨床結(jié)局組的胚胎培養(yǎng)液中VEGF水平 既往的研究認(rèn)為IVF的臨床妊娠與患者的年齡、胚胎質(zhì)量、子宮內(nèi)膜的容受性有關(guān)[8]。但本研究結(jié)果顯示: 在妊娠組與非妊娠組患者的臨床特征(平均年齡、不孕年限、促性腺激素的用量、促性腺激素的天數(shù)及HCG 日內(nèi)膜厚度) 和胚胎發(fā)育情況(獲卵數(shù)、胚胎數(shù)、優(yōu)胚數(shù)、移植胚胎的累積胚胎評分) 無差異的情況下，初步對比了妊娠組和未妊娠組胚胎培養(yǎng)液中VEGF的表達(dá)含量，結(jié)果表明，妊娠組胚胎培養(yǎng)液中VEGF的水平明顯低于非妊娠組，提示: 低水平的VEGF的優(yōu)質(zhì)胚胎具有高的種植能力。同時我們也發(fā)現(xiàn)具有更良好著床潛能的Ⅰ級胚胎對應(yīng)的胚胎培養(yǎng)液中VEGF水平比胚胎質(zhì)量稍差的Ⅱ級對應(yīng)的卵胚胎培養(yǎng)液中VEGF水平明顯低，差異有統(tǒng)計意義。這些均提示胚胎培養(yǎng)液中的VEGF 水平可能比胚胎形態(tài)學(xué)更早更靈敏地預(yù)測胚胎移植后的臨床結(jié)局，可作為預(yù)測妊娠結(jié)局的一個參考指標(biāo)。

3.3 卵泡液中VEGF的水平與胚胎質(zhì)量的關(guān)系 盡管早年， Barroso等[9]研究發(fā)現(xiàn)，卵泡液中VEGF的含量與胚胎形態(tài)呈負(fù)相關(guān)，顯示卵泡液中高VEGF含量為胚胎發(fā)育不良的標(biāo)志。Friedman等[10]的研究也發(fā)現(xiàn)患者卵泡液中VEGF的含量與獲卵數(shù)及妊娠率呈負(fù)相關(guān)。張四林等[11]通過測定卵泡液中VEGF濃度發(fā)現(xiàn)，優(yōu)質(zhì)胚胎(6細(xì)胞B級以上胚胎)組對應(yīng)的卵泡液VEGF水平比非優(yōu)質(zhì)胚胎組水平低(P<0.05)。但是，有關(guān)胚胎培養(yǎng)液中VEGF水平在人的胚胎發(fā)育過程中的相關(guān)研究尚鮮有報道，培養(yǎng)液中VEGF的出現(xiàn)及水平對胚胎發(fā)育的具體作用機制還有待于進一步研究[12]。

多胎妊娠帶來的母嬰危害是有目共睹的，有數(shù)據(jù)顯示輔助生育技術(shù)多胎妊娠率升高明顯, 故輔助生殖領(lǐng)域都提倡單胚胎移植[13-15]。若胚胎培養(yǎng)液中VEGF的低濃度水平能表明胚胎的發(fā)育代謝能力，應(yīng)用VEGF水平和胚胎形態(tài)學(xué)參數(shù)聯(lián)合選擇胚胎,將有可能得到發(fā)育潛能最優(yōu)的胚胎用于移植，對于年輕者進行單胚胎移植，切實降低多胎妊娠的發(fā)生率，提高妊娠成功率。

[1] 李晶晶,李國利.VEGF、P53在精原細(xì)胞瘤中的表達(dá)及相關(guān)性分析[J].東南國防醫(yī)藥,2013，15(3):262-264.

[2] 任建枝,沙愛國,王厚照,等.血清與卵泡液中血管內(nèi)皮生長因子在控制性超排卵周期中的變化[J].臨床軍醫(yī)雜志,2003，31(5):44-46.

[3] 任建枝,沙愛國,韓冬梅,等.改良長方案的控制性超促排卵方案在體外受精-胚胎移植中的應(yīng)用[J].生殖醫(yī)學(xué)雜志,2013,22(11):846-850.

[4] Wetzels AM, Bastiaans BA, Hendriks JC, et al. The effects of co-culture with human fibroblasts on human embryo development in vitro and implantation[J]. Hum Reprod, 1998,13(5): 1325-1330.

[5] Risau W. Mechanisms of angiongenesis[J]. Nacture,1997,386(6626):671-674.

[6] Uiger H,Karabulut AK,Pratten MK.The growth promoting effects ofbFGF,PD-ECGF and VEGF on cultured postimplantation rat embryo deprived of serum fractions[J].J Anat,2000,197(2):207-219.

[7] Biswas D,Hyun SH.Supplementation with vascular endothelial growth factor during in vitro maturation of porcine cumulus oocyte complexes and subsequent developmental competence after in vitro fertilization[J]. Theriogenology, 2011, 76(1):153-160.

[8] 鄧曉惠.生殖醫(yī)學(xué)技術(shù)及其彩色圖譜[M].濟南:山東科學(xué)技術(shù)出版社,2004:39.

[9] Barroso G，Barrionuevo M,Rao P,et al. Vascular endothelial growth factor,nitrc oxide,and leptin follicular fluid levels correlate negatively with embryo quality in IVF patients[J]. Fertil Steril,1999,72(6):1024-1026.

[10]Friedman CI,Seifer DB,Kennard EA,et al.Elevated level of follicular fluidvascular endothelial growth factor is a marker of diminished pregnancy[J].Fertil Steril,1998,70(5):836-839.

[11]張四林,楊 菁,尹太郎,等.卵泡液中VEGF水平對卵母細(xì)胞成熟及早期胚胎發(fā)育的影響[J]. 武漢大學(xué)學(xué)報，2008，29(1)：59-62.

[12]周經(jīng)委,吳蓉花,郭 里,等.玻璃化冷凍胚胎與新鮮胚胎移植對子代小鼠生長發(fā)育的影響[J].醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報,2015,28(6):569-573.

[13]Bromer JG, Seli E. Assessment of embryo viability in assisted reproductive technology:short comings of current approaches and the emerging role of metabolomics[J]. Curr Opin Obstet Gynecol,2008,20(3):234-241.

[14]邵一丹，梁元姣，陳 莉，等.抗菌勒氏營激素下降率對多囊卵巢患者促排卵療效的預(yù)測價值[J].醫(yī)學(xué)研究醫(yī)學(xué)報，2016，29(6)：616-620.

[15]Van AM, Peperstraten WL, Nelen DM, et al. Why don’t we perform elective single embryo transfer? A qualitative study among IVF patients and professionals[J]. Hum Reprod, 2008,23(9):2036-2042.

(本文編輯:黃攸生; 英文編輯:王建東)

Vascularendothelial growth factor level in embryo culture medium and its impact on clinical outcome of IVF-ET

REN Jian-zhi, CAI Jia-li, HAN Dong-mei,LIPing,GENGJie,MACai-hui,HANYan.

ReproductiveMedicineCenter, 174HospitalofPLA,Xiamen,Fujian361002,China

Objective To explore vascular endothelial growth factor (VEGF) level in embryo culture medium and the impact on early Embryo quality and clinic outcome in vitro fertilization and embryo transfer (IVF-ET). Methods Embryo culture mediums were obtained on the third day. ELISA was used to detect the level of VEGF in embryo culture mediums. Results ①There were no significant difference in female age, the numbers of oocytes and embryos, the number of high-quality embryos, cumulative embryo score (CES) of embryo transfer in two groups (P>0.05).The level of VEGF in embryo culture medium in pregnancy group was significant lower than in no pregnancy group (P<0.05). ②The level of VEGF in embryo culture medium was statistically significant lower in gradeⅠ embryo than grade Ⅱ embryo (P<0.01). Conclusion The level of VEGF in embryo culture medium can be used as one of predictors of embryo quality and pregnancy outcome.

vascular endothelial growth factor (VEGF); embryo quality; modified long protocol

南京軍區(qū)醫(yī)學(xué)科技創(chuàng)新課題項目(10MB015)

361002福建廈門，解放軍174醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心

任建枝，蔡嘉力，韓冬梅，等.胚胎培養(yǎng)液中血管內(nèi)皮生長因子的水平及其與IVF-ET結(jié)局的關(guān)系[J].東南國防醫(yī)藥，2016,18(5):472-474.

R711.6

A

10.3969/j.issn.1672-271X.2016.05.007

2016-04-26;

2016-07-19)