陜西省第二人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科 (西安 710005) 陳張琴 王 靜 許映龍 費(fèi)春麗 李 瑛 劉小荔 楊 淼

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呼吸道銅綠假單胞菌感染病灶藻酸鹽合成相關(guān)基因的表達(dá)*

陜西省第二人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科 (西安 710005) 陳張琴 王 靜 許映龍?費(fèi)春麗 李 瑛 劉小荔 楊 淼

目的:獲得一種呼吸道銅綠假單胞菌生物膜檢測方法，探討藻酸鹽合成相關(guān)基因的表達(dá)對臨床治療的影響。方法:提取60例呼吸道銅綠假單胞菌感染患者氣管內(nèi)病變組織，實時熒光定量PCR檢測藻酸鹽合成相關(guān)基因algD、algB、algU、mucA的表達(dá)，60例患者根據(jù)是否耐藥分組,分為耐藥組(R組)40例，非耐藥組(NR組)20例，根據(jù)治療的難易程度，將60例患者分為治療困難組(D組)38例，治療容易組(E組)22例。并進(jìn)行基因algD、algB、algU、mucA的表達(dá)與臨床抗生素耐藥及治療難易之間的相關(guān)性分析。結(jié)果:經(jīng)細(xì)菌培養(yǎng)證實的銅綠假單胞菌感染病例60例，呼吸道病變組織均有algD、algB、algU、mucA基因的表達(dá)；耐藥組(R組)和非耐藥組(NR組)對比，algD、algU表達(dá)有統(tǒng)計學(xué)差異，algB、mucA表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)差異；容易組(E組)和困難組(D組)對比，algD、algU、algB、mucA差異無統(tǒng)計學(xué)意義；細(xì)菌耐藥和治療難易的相關(guān)性分析顯示，細(xì)菌耐藥和臨床治療難易相關(guān)。結(jié)論：algD與銅綠假單胞菌藻酸鹽的合成有著直接的正相關(guān)性，可以作為判斷是否有黏液型銅綠假單胞菌生長及生物膜形成的依據(jù)，而algU與algD的表達(dá)有正相關(guān)性。

本實驗選取細(xì)菌培養(yǎng)證實的呼吸道銅綠假單胞菌感染病例，內(nèi)鏡下氣管或支氣管內(nèi)取材，行生物膜形成相關(guān)基因及調(diào)節(jié)基因的檢測。藻酸鹽是銅綠假單胞菌生物膜胞外多聚基質(zhì)的主要成分之一，algD基因?qū)υ逅猁}合成起關(guān)鍵作用，而mucA基因的突變可造成algD的去阻遏表達(dá)，使藻酸鹽大量生成。algB、algU促進(jìn)algD表達(dá)。報道如下。

材料與方法

1 標(biāo) 本 選擇2013年1月至2015年12月我院部分臨床痰液細(xì)菌培養(yǎng)證實為銅綠假單胞菌感染病例，男42例，女18例，年齡37～83歲，平均年齡68歲。氣管內(nèi)鏡下收集標(biāo)本，可為肉芽、病變壞死組織或氣管內(nèi)痂皮等，保存液保存。

2 主要實驗器材和試劑 7300 Real Time PCR System(美國Applied Biosystems公司);臺式高速冷凍離心機(jī)Neofuge 15R(Heal Force);Trizol Reagent(Invitrogen Life Technologies 15596-026)。RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo #K1622)。FastStart Universal SYBR Green Master(Rox)(Roche 04 913 914 001);引物(Invitrogen Biotechnology Co.LTD);三氯甲烷(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司 10006818);異丙醇(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司 80109218);無水乙醇(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司 10009218)。

3 引物序列 見表1。

表1 引物序列

4 實驗步驟 按試劑盒說明書進(jìn)行操作，步驟如下：①Trizol Reagent 抽提總RNA；②以oligo(dT)15反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA；③ 定量PCR：預(yù)變性95℃，10min；循環(huán)(40次)95℃，15s→60℃，60s；末段延伸60℃，5min；溶解曲線 75℃→95℃，每20s升溫1℃;④ 結(jié)果處理：?CT =CT(目的基因，待測樣本)- CT(內(nèi)標(biāo)基因，待測樣本)

結(jié) 果

1 60例患者細(xì)菌培養(yǎng) 60例均證實為銅綠假單胞菌感染病例，氣管內(nèi)肉芽或病變組織取材后PCR實驗結(jié)果，均有algD、algB、algU、mucA基因的表達(dá)。

2 藥物敏感實驗結(jié)果 將60例病例分為耐藥組(R組)和非耐藥組(NR組)，algD、algU在兩組間表達(dá)有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，algB、mucA差異無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，見表2。

3D組和E組△CT=CT目的基因-CTβ-actin比較 以臨床治療后癥狀體征是否容易改善，將60例病例分為容易組(E組)和困難組(D組)，兩組間△CT均值對比的t檢驗提示，algD、algU、algB、mucA差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)

4 耐藥和治療難易相關(guān)性分析 對耐藥和治療難易的相關(guān)性分析顯示(P<0.05)，說明耐藥和臨床難易有關(guān)。

表2 R組和NR組△CT=CT目的基因-CTβ-actin比較

討 論

能形成生物膜的細(xì)菌主要有銅綠假單胞菌、克雷伯氏菌、腸桿菌、沙雷氏菌屬、肺炎鏈球菌、葡萄球菌等, 相關(guān)感染尤以銅綠假單胞菌、金葡球菌多見。

在肺部銅綠假單胞菌感染的抗生素治療方面，抗生素的選擇多是根據(jù)藥物敏感實驗的結(jié)果，該方法不一定奏效，因為臨床細(xì)菌培養(yǎng)多采用浮游模式，而事實上呼吸道銅綠假單胞菌生長多是以細(xì)菌生物膜的方式形成黏液層。即使浮游狀態(tài)細(xì)菌對抗生素敏感，生物膜狀態(tài)的細(xì)菌則仍然能抵抗高濃度的“敏感”抗生素[1]。盡管目前尚無可靠證據(jù)，但理論上基于考慮生物膜形式而選擇的抗生素，應(yīng)該優(yōu)于傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)及藥物敏感試驗而選擇抗生素[2]。

細(xì)菌生物膜感染的概念提出有數(shù)十年，目前尚未開發(fā)出能提供臨床應(yīng)用的生物膜常規(guī)檢查和指導(dǎo)治療的方法[3]?？茖W(xué)家們試圖找到銅綠假單胞菌生長方式和控制機(jī)制，并提出避免生物膜形成或促進(jìn)生物膜瓦解的方法[4]。

藻酸鹽是銅綠假單胞菌生物膜胞外多聚基質(zhì)的主要成分之一，algD基因?qū)υ逅猁}合成起關(guān)鍵作用，而mucA基因的突變可造成algD的去阻遏表達(dá)，使藻酸鹽大量生成。銅綠假單胞菌藻酸鹽形成的調(diào)控主要是轉(zhuǎn)錄水平對algD基因啟動子的調(diào)控，algB屬于NTRC家族，可直接綁定到algD啟動子而促進(jìn)藻酸鈉生產(chǎn)[5]。

mucA-algU是銅綠假單胞菌生物膜合成的主要調(diào)控徑路。mucA突變型菌株,algU不再受到抑制，從而促進(jìn)下游啟動子的活化。algU的過表達(dá)促進(jìn)algD的啟動，在銅綠假單胞菌黏液型菌株mucoidisolates和非黏液型菌株non-mucoidisolates表達(dá)有顯著差異。

本實驗患者均為選取細(xì)菌培養(yǎng)證實為銅綠假單胞菌感染病例，氣管內(nèi)肉芽或病變組織取材后PCR實驗結(jié)果，均有上述相關(guān)基因的表達(dá)，而程度有差異。以藥物敏感實驗結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，將病例分為耐藥組(R組)和非耐藥組(NR組)，algD、algU表達(dá)在兩組間比較有統(tǒng)計學(xué)差異，algB、mucA差異無統(tǒng)計學(xué)意義；說明algD表達(dá)與生物膜合成最為相關(guān)，而直接影響培養(yǎng)細(xì)菌的耐藥性，algU與algD表達(dá)有比較明確的正相關(guān)性。mucA表達(dá)下降可以解除對algU的抑制，從而促進(jìn)algD表達(dá)，algB通過綁定algD啟動子而促進(jìn)藻酸鹽的合成。本實驗兩組mucA、algB表達(dá)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，說明mucA、algB與algD之間可能缺少直接的因果關(guān)系。

至于分為容易組(E組)和困難組(D組)，各種基因表達(dá)的比較均沒有統(tǒng)計學(xué)差異，以及耐藥和臨床難治有關(guān)的結(jié)論，由于分類標(biāo)準(zhǔn)的量化不能精確，并且臨床治療效果影響因素很多，除了性別、年齡、既往病史，甚至呼吸機(jī)的模式和護(hù)理水平均可能為混雜因素，所以不能得出非常可靠的結(jié)論。總之，algD與銅綠假單胞菌生物膜的合成有著直接的正相關(guān)性，可以作為判斷是否有黏液型銅綠假單胞菌生長及生物膜形成的依據(jù)，而algU與algD有正相關(guān)性。

針對生物膜的治療Yamasaki 等發(fā)現(xiàn)羅紅霉素和亞胺硫霉素合用能有效殺滅金黃色葡萄球菌生物膜。羅紅霉素和氟羅沙星對銅綠假單胞菌生物膜有明顯抑制作用,兩者合用可治療由銅綠假單胞菌生物膜引起的難治性感染,其中羅紅霉素通過抑制細(xì)菌多糖蛋白復(fù)合物合成來增強(qiáng)氟羅沙星對生物膜的滲透,對氟羅沙星殺滅生物膜中細(xì)菌起增效作用。體外實驗證明乳鐵蛋白協(xié)同木糖醇對銅綠假單胞菌生物膜有協(xié)同治療作用。麥盧卡蜂蜜和肉桂油等均有此類治療方面的研究。是否能以algU與algD的表達(dá)作為上述治療效果的判斷指標(biāo)有待進(jìn)一步的研究。

[1 ] Lebeaux D, Ghigo JM, Beloin C. Biofilm-related infections: bridging the gap between clinical management and fundamental aspects of recalcitrance toward antibiotics[J]. Microbiol Mol Biol Rev, 2014,78(3):510-543.

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[5] Leech AJ, Sprinkle A, Wood L,etal. The NtrC family regulator AlgB, which controls alginate biosynthesis in mucoid Pseudomonas aeruginosa, binds directly to the algD promoter[J]. J Bacteriol,2008,190(2):581-589.

(收稿：2016-08-09)

Expression of alginate biosynthesis-related genes in respiratory Pseudomonas aeruginosa infection lesions Shaanxi Provincial People's Hospital Respiratory Medicine

(Xi’an 710005)

Chen Zhangqin Wang Jing Xu Yinglong et al

Objective：To obtain a respiratory Pseudomonas aeruginosa biofilm detection methods, explore the affect of the expression of the related alginate synthesis genes to the clinical treatment. Methods：Specimens were taken from the tracheal lesions of Pseudomonas aeruginosa infection cases, real-time quantitative PCR was performed to detect the expression of alginate biosynthesis-related gene algD, algB, algU, mucA. And correlation between gene algD, algB, algU, mucA. Expression and clinical treatment effect and antibiotic resistance was statistically analysed. Results：For all of the bacterial culture confirmed Pseudomonas aeruginosa infection cases, the alginate biosynthesis-related gene Expression was detected; comparison of resistant group (R group) and non-resistant group (NR group), algD, algU expression significantly difference, algB, mucA difference was not significant. Conclusion：Expression of algD and Pseudomonas aeruginosa alginate synthesis has a direct positive correlation. Detect of algD can be used to determine whether there is Pseudomonas aeruginosa biofilm formation. and the expression of algU have a positive correlation with algD.

Pseudomonas aeruginosa @algD @mucA+

*陜西省科學(xué)技術(shù)廳基金(2012k17-03-04)

銅綠假單胞菌 @algD@mucA+

R

Adoi:10.3969/j.issn.1000-7377.2016.12.004

?西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科病院