曾 勇 張亞敏 徐榕青* 林文津 徐小妹 孫鳳靈

1.福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建 福州 350003；2.福建省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院、福建省醫(yī)學(xué)測(cè)試重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350001

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HPLC法測(cè)定山茶油中角鯊烯的含量

曾 勇1張亞敏2徐榕青2*林文津2徐小妹2孫鳳靈1

1.福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建 福州 350003；2.福建省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院、福建省醫(yī)學(xué)測(cè)試重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350001

目的：建立山茶油中角鯊烯含量高效液相色譜法測(cè)定法。方法：采用Inertsil ODS-SP色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)；甲醇/乙腈體積比60/40為流動(dòng)相；流速1.0mL/min；檢測(cè)波長210nm。結(jié)果：在此色譜條件下，角鯊烯峰得到良好分離，在1～200μg/mL濃度范圍內(nèi)，濃度與峰面積呈良好線性，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.9991，精密度RSD為0.39%，重復(fù)性RSD為1.22%，16h內(nèi)測(cè)定穩(wěn)定性RSD為2.75%，角鯊烯平均回收率為98.12%。測(cè)定山茶油原油、粗煉山茶油、精煉山茶油中角鯊烯含量，分別為0.0139%、0.0118%、0.0056%和0.0045%，有較大差異。結(jié)論：本研究建立的方法可用于山茶油中角鯊烯含量的質(zhì)量控制。

山茶油；角鯊烯；高效液相色譜法

山茶油(又名茶籽油、茶油、茶樹油)是從山茶科植物油茶(CamelliaoleiferaAbel)籽中經(jīng)壓榨或浸出法制取的高檔食用油脂，是世界四大木本食用油脂之一，其不飽和脂肪酸含量高達(dá)80%以上，被聯(lián)合國糧農(nóng)組織推薦為健康食品[1]?，F(xiàn)代藥理研究表明，山茶油中的角鯊烯(又稱魚肝油萜或鯊烯)是一種脂質(zhì)不皂化物，具有促進(jìn)機(jī)體新陳代謝，提高機(jī)體的防御機(jī)能及應(yīng)激能力，具有抗衰老、抗腫瘤和提高免疫調(diào)節(jié)作用等多種生理功能[2-5]。目前，山茶油中角鯊烯的檢測(cè)方法主要采用氣相色譜法、氣相質(zhì)譜聯(lián)用法[6～9]。本研究擬采用HPLC測(cè)定山茶油中角鯊烯，為山茶油及相關(guān)保健產(chǎn)品的質(zhì)量控制提供快速簡便的檢測(cè)手段。

1 儀器與材料

1.1 儀器 LC-20AT型高效液相色譜儀(SPD-M20A檢測(cè)器，島津公司)；電子分析天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；RE-200B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)。

1.2 材料 角鯊烯對(duì)照品(批號(hào)：140721-200601，純度99.5%，中國藥品生物制品檢定所)；山茶油(批號(hào)20151001，由福建頤元寶生物技術(shù)有限公司)；柱層析硅膠(230～400目，青島海洋化工有限公司)；石油醚(沸點(diǎn)60～90℃)、甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取10.0mg角鯊烯對(duì)照品于10mL容量瓶中，用正己烷定容至刻度，搖勻，制成1.0mg/mL的角鯊烯對(duì)照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備 取山茶油1.0g，精密稱定，置小燒杯中，加入5mL石油醚，混勻，用玻璃棒引流倒入硅膠柱[15mm(250mm)中(230～400目柱層析硅膠8g，濕法裝柱]，用石油醚潤洗燒杯2次，每次5mL，將2次洗滌液一并倒硅膠柱中，當(dāng)石油醚液面與柱上端無水硫酸鈉層相切時(shí)，加入30mL石油醚，收集45mL全部的洗脫液至茄形瓶中，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋干，隨后用正己烷定容到2ml容量瓶中，充分振搖，0.22μm有機(jī)相濾膜過濾，轉(zhuǎn)移到進(jìn)樣小瓶，作為供試品溶液。

2.3 色譜條件 色譜柱為Inertsil ODS-SP柱(250mm×4.6mm，5μm)，甲醇︰乙腈體積比60︰40作為流動(dòng)相，流速為1.0mL/min，檢測(cè)波長為210nm，柱溫40℃，進(jìn)樣量10μL。在此色譜條件下，角鯊烯對(duì)照品溶液和山茶油供試品溶液色譜圖如圖1、2所示。結(jié)果表明角鯊烯可得到良好的分離，角鯊烯對(duì)照品保留時(shí)間9.375min，供試品溶液中角鯊烯保留時(shí)間為9.537min，兩者基本一致。

2.4 線性關(guān)系 分別精密吸取適量1.0mg/mL的角鯊烯對(duì)照品溶液，用正己烷配制成質(zhì)量濃度分別為1.0、2.0、10.0、25.0、50.0、100.0和200μg/mL的系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“2.3”的色譜條件，取10μL進(jìn)樣，以峰面積(y)對(duì)質(zhì)量濃度(x)進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程為y=36221x+85454，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.9991。結(jié)果表明，角鯊烯在1.0～200.0mg/L濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗(yàn) 取1.0mg/mL角鯊烯對(duì)照品溶液，稀釋成100μg/mL，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣體積為10μL，按“2.3”的色譜條件測(cè)定峰面積，結(jié)果見表1，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.39%(n=6)，精密度良好。

表1 精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批山茶油，分別稱取6份樣品，每份1.0g，精密稱定，按“2.2”供試品溶液制備方法制備6份供試液。取供試品溶液與稀釋成100μg/mL的對(duì)照品溶液各進(jìn)樣10μL，按“2.3”的色譜條件測(cè)定峰面積，計(jì)算角鯊烯含量，結(jié)果見表2，角鯊烯平均含量為0.0120%，RSD為1.22%，試驗(yàn)重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取山茶油1.0g，精密稱定，按“2.2”的方法配制供試品溶液，配制后立即測(cè)定一次，隨后每隔4h進(jìn)樣一次，按“2.3”的色譜條件測(cè)定峰面積，結(jié)果見表3，16h內(nèi)測(cè)定RSD為2.75%(n=6)，樣品溶液穩(wěn)定性良好。

表2 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

表3 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.8 回收率試驗(yàn) 采用加樣回收法，取已知含量(0.012%)的山茶油平行樣品9份，每份0.5g，精密稱定，添加0.05mL、0.06mL、0.07mL角鯊烯對(duì)照品溶液(1.0mg/mL)各3份，按照2.2方法制備供試品溶液，取供試品溶液與對(duì)照品溶液各進(jìn)樣10μL，按2.3的色譜條件測(cè)定峰面積，計(jì)算回收率如表4所示，回收率為95.46%～101.81%間，平均回收率為98.12%，RSD為1.90%(n=9)，該方法回收率良好。

表4 回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.9 樣品測(cè)定 取4批山茶油，分別按照“2.2”項(xiàng)的方法處理，在“2.3”項(xiàng)色譜條件下每批平行測(cè)定三次，計(jì)算各批山茶油中角鯊烯的平均含量。結(jié)果見表5。

表5 不同山茶油中角鯊烯含量

3 討論

3.1 山茶油成分復(fù)雜，本實(shí)驗(yàn)采用過硅膠柱對(duì)山茶油樣品進(jìn)行預(yù)處理，可大幅減少山茶雜質(zhì)對(duì)角鯊烯測(cè)定的干擾，同時(shí)有利于改善角鯊烯峰形，并減少對(duì)色譜柱的污染。

3.2 所測(cè)定的4批山茶油中角鯊烯含量有較大差異，三者間最大差異達(dá)3倍。角鯊烯含量山茶油原油中最高，粗煉山茶油次之，精煉山茶油最低，角鯊烯含量隨著山茶油精制程度的提高而降低，提示研制保健營養(yǎng)品時(shí)，應(yīng)以山茶油原油作為生產(chǎn)原料。

3.3 角鯊烯具有多方面的功效與作用，是一種不可多得的營養(yǎng)保健成分。福建是我國油茶的中心產(chǎn)區(qū)之一，但福建油茶種植產(chǎn)業(yè)面臨制約瓶頸，沒有醫(yī)藥保健品或化工原料深加工項(xiàng)目，因此開發(fā)山茶油功能性保健產(chǎn)品對(duì)我省油茶產(chǎn)業(yè)持續(xù)健康發(fā)展具有重要的現(xiàn)實(shí)意義和廣闊的應(yīng)用前景。本文研究采用高效液相色譜法測(cè)定山茶油中角鯊烯含量，方法快速、簡便、準(zhǔn)確，可為山茶油及相關(guān)保健產(chǎn)品的質(zhì)量控制提供檢測(cè)手段。

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(編輯：梁志慶)

Content determination of squalene in camellia oil by HPLC

ZENG Yong1ZHANG Yamin2XU Rongqing2*LIN Wenjin2XU Xiaomei2SUN Fengling1

1.Fujian University of Traditional Chinese Medicine，F(xiàn)uzhou 350003，China;2.Fujian Academy of Medical Sciences，F(xiàn)ujian Key Laboratory of Medical Testing，F(xiàn)uzhou 350001，China

Objective To establishe a method to determine the content of squalene in camellia oil. Methods HPLC was performed on the column of Inertsil ODS-SP (250mm×4.6mm,5μm) with mobile phase of acetonitrile : methanol (60∶40, v/v), at flow rate of 1mL/min, the detection wavelength was 210nm, column temperature was room temperature, and volumn injection was 10μl. Results On this chromatographic conditions, squalene peaks was well separated and the linear range of squalene was 1～200μg/mL；RSDs of precision，stability and reproduciblity tests were repeatability lower than 3.0%, the average recovery was 98.12%. The content of squalene in camellia oil, camellia oil smelting and refining camellia oil were 0.0139%, 0.0118%, 0.0056% and 0.0045% respectivety. Conclusions The method is simple and reproducible，and can be used for the quality control of camellia oil.

Squalene; Camellia Oil; HPLC

2016-09-06

福建省屬公益類科研院所基本科研專項(xiàng)(2015R1031-6、2014R1031-7)

曾勇(1990-)，碩士研究生在讀，主要從事中藥制劑與質(zhì)量控制研究。E-mail：1328315659@qq.com

徐榕青(1961-)，研究員，主要從事中藥資源開發(fā)與利用研究。E-mail：xrq163@126.com

R917

A

1007-8517(2016)21-0007-03