王享利

（中南大學湘雅醫(yī)院，湖南 長沙 410008）

論著

白藜蘆醇對人前列腺癌細胞株PC-3增殖及TGF-β1/Smad2信號通路影響研究

王享利

（中南大學湘雅醫(yī)院，湖南 長沙 410008）

目的探討白藜蘆醇對前列腺癌細胞株PC-3增殖及轉化生長因子β1（TGF-β1）/Smad2信號通路的影響。方法不同濃度白藜蘆醇干預體外培養(yǎng)前列腺癌細胞株PC-3白藜蘆醇不同時間。MTT檢測白藜蘆醇對PC-3細胞生長情況的影響，流式細胞術檢測細胞周期的變化情況，逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）和蛋白免疫印跡法（Western blot）分別檢測細胞內TGF-β1和Smad2 mRNA和蛋白表達水平的變化情況。結果MTT結果顯示白藜蘆醇顯著抑制了前列腺癌細胞的生長。流式細胞結果表明白藜蘆醇明顯降低了前列腺癌細胞S期含量而增加了G0/G1期含量。而TGF-β1和其下游因子Smad2的mRNA和蛋白水平的表達也明顯受到白藜蘆醇的抑制，且這種抑制作用呈濃度一時間依賴性。結論白藜蘆醇可能夠通過阻斷TGF-β1/Smad2信號通路抑制前列腺癌細胞生長前列腺癌。

白藜蘆醇；轉化生長因子β1；前列腺癌

前列腺癌是一種常見的老年男性疾病，其發(fā)病率具有地區(qū)差異性，在歐美，前列腺癌在腫瘤中是致男性死亡的第2病因，僅次于肺癌[1]。東亞地區(qū)發(fā)病率較低，但有增高趨勢，我國前列腺癌的發(fā)病率較20世紀60年代前明顯增高[2]。前列腺癌的細胞生物學行為極不確定，疾病自然進展過程存在極大的個體差異性。有的患者短期內迅速死亡，而有的則預后較好，較長時間疾病也不會有太大進展，患者可以存活較長時間[3]。因此尋找前列腺癌治療的新方法具有重要臨床意義。GOTZMANN等研究發(fā)現(xiàn)[3]，轉化生長

因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）在前列腺上皮細胞惡變?yōu)榍傲邢侔┘毎^程中發(fā)揮重要作用。因此，靶向TGF-β1是前列腺癌治療的潛在有效靶點。（無環(huán)）單萜白藜蘆醇是在檸檬、天竺葵及其他從醫(yī)用植物中提取精油中含量極低的天然化合物。白藜蘆醇具有抗氧化、抗微生物和抗炎活性[4]。此外，白藜蘆醇還能通過靶向細胞周期和凋亡過程抑制多種人類腫瘤細胞生長[5-7]。本研究主要探討白藜蘆醇對前列腺癌細胞株生長的影響及其與TGF-β1信號通路的關系。

1 材料與方法

1.1 材料來源

1.1.1 細胞培養(yǎng)前列腺癌細胞株PC-3購自中南大學細胞生物實驗中心，細胞在37℃，含5%二氧化碳CO2的培養(yǎng)箱內，用含10%小牛血清的DMEM高糖培基（美國Hyclone公司）培養(yǎng)，培養(yǎng)基中分別加入終濃度為100 mg/L的鏈霉素與青霉素，細胞貼壁生長24 h。細胞用0.05%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）消化傳代，選取對數(shù)生長期細胞進行后續(xù)實驗。

1.1.2 試劑來源白藜蘆醇購自美國Sigma公司，Trizol、逆轉錄-聚合酶鏈反應（reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR）試劑盒購自大連寶生物公司，偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluo ride，PVDF）膜購自美國Millipore公司，抗體TGF-β1和Smad家族成員2（Smad family member 2，Smad2）購自美國Santacruz公司。

1.2 方法

1.2.1 四甲基噻唑藍（Thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT）法檢測白藜蘆醇對前列腺癌細胞株PC-3生長的影響PC-3細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，消化計數(shù)，以105個/ml接種于96孔板，培養(yǎng)過夜后，分別用1、2、4、6、8、16mmol的白藜蘆醇干預PC-3細胞24、48和72 h，對照組細胞僅加入相應培養(yǎng)基。藥物干預完成后，棄去培養(yǎng)基，加入200 ml 5 mg/ml MTT繼續(xù)培養(yǎng)4 h，最后用50 ml DMSO處理，酶標儀測定OD450 nm時細胞吸光值（optical density，OD），然后計算抑制率。抑制率=（1-藥物干預組OD/對照組OD）×100%。并在倒置顯微鏡下觀察未經(jīng)白藜蘆醇處理及經(jīng)白藜蘆醇處理的PC-3細胞形態(tài)。

1.2.2 流式細胞儀檢測白藜蘆醇對前列腺癌細胞株PC-3細胞周期的影響1、2、4、6、8和16 mmol的白藜蘆醇干預PC-3細胞48 h（根據(jù)MTT結果篩選出的最佳作用時間點）后，棄去培養(yǎng)基，PBS漂洗細胞2次，4%多聚甲醛固定過夜，PI染色后流式細胞儀檢測其細胞周期。

1.2.3 RT-PCR檢測白藜蘆醇對前列腺癌細胞株PC-3細胞TGF-β1和Smad2 mRNA表達的影響采用Oligo 7.0軟件設計TGF-β1、Smad2及β-actin引物，并交由美國Invitrogen公司合成。引物序列如下：TGF-β1，5′-CCTTGCTGGACCGCAACAAC-3′（正向），5′-CAGCAGCCGGTTACCGAC-3′（反向）；Smad2，5′-CAGGTTCCAGCTATGGAGC-3′（正向），5′-TTCATGGCCGAATCCCAT-3′（反向）；β-actin，5′-C AGGTCATACTCCTGCGGCTG-3′（正向），5′-CGGGA CCTCACTGACTACCTC-3′（反向）。Trizol提取細胞tRNA，采用易步發(fā)RT-PCR試劑盒擴增。擴增結束后，PCR產(chǎn)物行1.8%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)下觀察電泳結果，并進行灰度值分析。

1.2.4 蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測白藜蘆醇對前列腺癌細胞株PC-3細胞TGF-β1和Smad2蛋白表達的影響白藜蘆醇作用PC-3細胞48 h后，收集細胞，加入1 ml細胞裂解液，超聲粉碎，離心，取上清液。分別取100μg樣品蛋白/孔上樣，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，濕轉1 h（4℃，100 v），5%脫脂奶粉封閉2 h，然后分別用β-actin（1∶1 000），TGF-β1（1∶500）、Smad2（1∶500）一抗4℃平搖過夜，辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記二抗（1∶1 000）避光孵育2 h，顯色液顯色，顯影，定影，掃描條帶并行分析，以目的條帶與β-actin條帶吸光度的比值作為目的蛋白的相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間均值比較用重復測量設計的方差分析或單因素方差分析，兩兩比較用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 白藜蘆醇對前列腺癌細胞株PC-3生長及形態(tài)的影響

1、2、4、8及16 mmol白藜蘆醇干預組分別與對照組干預后24、48和72 h OD450值比較，采用重復測量數(shù)據(jù)的方差分析，結果：①1、2、4 mmol白藜蘆

醇干預組不同時間點間OD450值差異無統(tǒng)計學意義（F=2.176、1.482及1.153，P=0.284、0.462及0.517），8和16 mmol白藜蘆醇干預組不同時間點間OD450值差異有統(tǒng)計學意義（F=10.873、11.285，P=0.001、0.000）；②8和16 mmol白藜蘆醇干預PC-3細胞72 h，OD450值分別（0.747±0.138）和（0.426± 0.106），低于對照組（1.125±0.589），經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（t=2.694、4.826；P=0.003、0.001）（見圖1和表1）。MTT結果表明，白藜蘆醇以時效性和劑效性抑制PC-3生長。

在不同濃度白藜蘆醇干預的細胞分別于培養(yǎng)24，48和72 h后，于倒置相差顯微鏡下觀察，人前列腺癌PC-3細胞經(jīng)白藜蘆醇處理后出現(xiàn)明顯的形態(tài)學改變。倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，比較白藜蘆醇藥物作用組和對照組，未受到白藜蘆醇干預的細胞均呈單層細胞貼壁生長，細胞間結構緊密，細胞增殖生長（見圖2A）。隨藥物干預的劑量和時間延長，細胞形態(tài)逐漸變圓，細胞間間隙增大，細胞密度逐漸變小，細胞內中毒顆粒增多，折光度下降，部分細胞喪失貼壁能力，懸浮在培養(yǎng)基中生長，隨機視野可見細胞密度明顯減少。在相同的時間內，細胞對不同濃度藥物的反應存在差異。隨白藜蘆醇藥物濃度的增大，前列腺癌PC-3細胞脫落的比例增多，細胞碎裂的比例明顯增多。上述結果提示白藜蘆醇可以抑制PC-3細胞的增殖（見圖2B～D）。

2.2 白藜蘆醇對前列腺癌細胞株PC-3細胞周期的影響

方差分析顯示，各組間G0/G1、S及G2/M其細胞均有差異，與對照組比較，當白藜蘆醇濃度為1、2、4 mmol/L時，處于G0/G1的PC-3細胞的比例差異無統(tǒng)計學意義；當白藜蘆醇濃度為8 mmol/L時，G0/G1期PC-3細胞的比例較對照組增加（P=0.006），而S期和G2/M的比例則下降（P=0.007和0.012）（見表2）。

2.3 白藜蘆醇對前列腺癌細胞株PC-3 TGF-β1和Smad2 mRNA和蛋白表達的影響

RT-PCR和Western blot實驗結果表明，白藜蘆醇以時間劑量效應抑制PC-3 TGF-β1和Smad2 mRNA和蛋白表達（見圖2～4）。

圖1 白藜蘆醇干預對前列腺癌細胞株增殖的影響

表1 白藜蘆醇干預不同時間OD450值比較（mol/L，±s）

表1 白藜蘆醇干預不同時間OD450值比較（mol/L，±s）

干預時間16 24 h1.342±0.8721.185±0.2981.174±0.1761.152±0.2530.947±0.1180.826±0.214 48 h1.175±0.7741.164±0.3891.095±0.2260.896±0.1420.753±0.2270.617±0.118 72 h1.125±0.5891.162±0.2540.935±0.1750.784±0.2160.747±0.1380.426±0.106白藜蘆醇干預濃度0 1 2 4 8

表2 不同濃度白藜蘆醇對PC-3細胞周期的影響（±s）

表2 不同濃度白藜蘆醇對PC-3細胞周期的影響（±s）

注：t值指不同濃度組白藜蘆醇分別與對照組比較；F值指所有處理組不同細胞周期的組內比較

組別細胞周期G0/G1t值P值St值P值G2/Mt值P值對照組60.9±7.224.8±4.714.3±6.1 1 mmol/l62.4±6.30.5440.87224.9±3.80.6150.74612.7±2.80.5320.885 2 mmol/l 4 mmol/l 8 mmol/l 16 mmol/l F值P值63.8±5.2 68.5±7.3 74.3±2.1 81.6±8.2 8.947 0.002 0.627 1.728 6.894 9.172 0.744 0.048 0.006 0.001 23.4±6.8 18.3±2.4 15.2±1.7 11.3±1.6 10.726 0.001 0.789 3.584 6.672 9.384 0.522 0.027 0.007 0.001 12.8±1.4 13.2±2.1 10.5±3.2 7.1±2.6 9.835 0.001 0.872 3.573 4.682 10.465 0.392 0.028 0.012 0.001

圖2 PC-3細胞形態(tài)學觀察（×200）

圖4 白藜蘆醇對PC-3 TGF-β1和Smad2 mRNA表達的影響

3 討論

轉化生長因子β1（TGF-β1）在胚胎形成、細胞生長調控、胞外基質分泌、血管生成及免疫調節(jié)等多種生理過程中發(fā)揮重要作用。動脈粥樣硬化和臟器纖維化與TGF-β1表達異常密切相關，特別是TGF-β1與癌癥的相關性近年來成為學者們關注的焦點[8]。Smads是一類十分重要的轉錄因子調節(jié)信號分子家族，其中Smad2識別和結合上游信號分子，并將其轉運至細胞核內，并激活TGF-β1/Smads信號通路，因此Smad2是TGF-β1/Smads信號通路至關重要的調控分子。Smad2表達沉默會導致TGF-β1/Smads信號通路發(fā)生紊亂[9]。

TGF-β1/Smads信號通路在腫瘤不同階段發(fā)揮不同的作用。腫瘤形成時，TGF-β1/Smads信號通路抑制腫瘤細胞生長。在該階段，一旦參與TGF-β1/ Smads信號通路的信號分子表達異常，腫瘤細胞既能捕捉到該信息，從而“逃避”TGF-β1/Smads信號通路的抑制作用。而當腫瘤處于進展期時，TGF-β1/ Smads信號通路發(fā)揮促進腫瘤細胞生長的作用，并增強腫瘤的侵襲性和惡性程度[10]。

丁國芳等[11]研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1和Smad2在前列腺癌組織中的表達高于正常前列腺組織上皮組織，TGF-β1和Smad2基因過表達可能在HCC的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮作用。李偉等[12]研究表明，TGF-β可以上調PC-3細胞血管內皮生長因子的表達，氯化鋰可以增強TGF-β上調血管內皮生長因子表達的作用，前列腺癌PC-3細胞中Wnt信號通路與TGF-β信號相互激活，對前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展有一定意義。孔麗等[13]則研究證實，TGF-β1/Smads信號轉導通路被抑制，使TGF-β1介導的抗增殖信號不能正常下傳，可能是前列腺癌發(fā)生的機制之一。本研究提示TGF-β1/Smad2信號通路是前列腺癌發(fā)生、發(fā)展的重要參與者，是前列腺癌治療的潛在有效靶點。

白藜蘆醇已被證實能夠抑制多種人類腫瘤的生長，其主要通過抑制多種腫瘤生長因子、腫瘤代謝酶、轉錄調控因子及抗凋亡蛋白表達發(fā)揮腫瘤抑制作用[14]。本研究首先采用MTT實驗檢測白藜蘆醇對前列腺癌細胞PC-3生長的影響，結果證實白藜蘆醇以時間和劑量依賴效應抑制前列腺癌細胞生長，這一結果與以往研究結果一致[15]。此外，本實驗結果還發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇能夠抑制S期腫瘤細胞比例，使多腫瘤細胞發(fā)生G0/G1期阻滯。而Western blot和RT-PCR實驗表明，白藜蘆醇能夠降低前列腺癌細胞中TGF-β1和Smad2蛋白和mRNA表達。本結果提示，白藜蘆醇能夠抑制前列腺癌細胞TGF-β1/Smad2信號通路活性，且該抑制作用有濃度-時間依賴性。

總之，白藜蘆醇能夠抑制前列腺癌細胞生長，是其發(fā)生G0/G1期阻滯。其可能機制是白藜蘆醇通過抑制TGF-β1和Smad2表達而阻斷TGF-β1/Smad2信號通路，本文研究結果為前列腺癌臨床治療提供了新思路。但是，白藜蘆醇抑制TGF-β1/Smad2信號通路具體作用機制仍需進行深入探討，并需進行體

內實驗驗證，以便為將白藜蘆醇作為預防或治療前列腺癌的有效藥物提供最為充分依據(jù)。

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（張蕾 編輯）

Effect of resveratrol on proliferation and TGF-β1signaling pathway on human prostate cancer cell line PC-3

Xiang-li Wang
(Xiangya Hospital,Central South University,Changsha,Hunan 410008,China)

Objective To observe the effect of resveratrol on proliferation and TGF-β1signaling pathway of human prostate cancer cell line PC-3.Methods Human prostate cancer cell line PC-3 was cultured and treated with resveratrol at different concentrations and different time points．The effect of resveratrol on PC-3 cell proliferation was studied by means of MTT.The cell cycle was detected with flow cytometry.RT-PCR and Western blot were used to detect the expressions of TGF-β1and Smad2 at mRNA and protein levels.Results The viability of Huh-7 cells treated with resveratrol was obviously decreased.Analysis of the cell cycle revealed that resveratrol induced a significant decrease in cells in the S phase and increase in cells in the G1phase.Furthermore,the expressions of TGF-β1and its downstream factor-Smad2 were inhibited at mRNA and protein levels by resveratrol in a concentration-and time-dependent manner.Conclusions Resveratrol perhaps plays inhibitory effect on PC-3 cells through inhibiting the activity of TGF-β1signaling pathway.

resveratrol;TGF-β1signaling pathway;prostate cancer

R737.25

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.22.004

1005-8982（2016）22-0018-05

2016-04-05