鄭紅芳，丁厚中，李巧星，曹方

（江蘇大學(xué)附屬昆山醫(yī)院泌尿外科，江蘇 蘇州 215300）

論著

腎癌組織中HMGB1、MMP9的表達與臨床分期、預(yù)后的相關(guān)性研究

鄭紅芳，丁厚中，李巧星，曹方

（江蘇大學(xué)附屬昆山醫(yī)院泌尿外科，江蘇 蘇州 215300）

目的探討高遷移率族蛋白B1（HMGB1）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP9）在腎癌組織中的表達，及與腎癌臨床病理特征、預(yù)后的相關(guān)性。方法采用免疫組織化學(xué)、實時定量聚合酶鏈反應(yīng)法，檢測67例腎透明細胞癌患者癌組織、癌旁組織中HMGB1、MMP9的表達，采用Person法分析其與臨床病理學(xué)特征的相關(guān)性，采用Kaplan-Meier方法進行生存曲線分析，采用Cox比例風(fēng)險模型分析影響患者預(yù)后相關(guān)因素。結(jié)果腎癌組織中HMGB1、MMP9表達高于癌旁腎組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；腎癌腫瘤TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移度、腫瘤直徑與HMGB1、MMP9表達相關(guān)，而不同性別、年齡間HMGB1、MMP9的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義；HMGB1、MMP9低表達腎癌患者的生存期要高于中、高表達患者，HMGB1、MMP9的表達水平與預(yù)后呈負相關(guān)；HMGB1、MMP9、腫瘤TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移度是影響腎癌患者預(yù)后的獨立危險因素。結(jié)論HMGB1、MMP9可能在腎癌的浸潤、轉(zhuǎn)移機制中起著非常重要的作用，聯(lián)合檢測腎癌組織中HMGB1和MMP9的表達水平可能有助于評估腎癌的生物學(xué)特征和患者預(yù)后。

腎癌；HMGB1；MMP9；預(yù)后

大量文獻報道，高遷移率族蛋白B1（high mobility group box 1 protein，HMGB1）在應(yīng)激狀態(tài)下可從真核細胞的核內(nèi)釋放到細胞核外，參與晚期炎癥的病理過程，最終導(dǎo)致炎癥遷延[1-2]。最新研究表明HMGB1在前列腺癌、胰腺癌等實體腫瘤中表達上調(diào)，腫瘤細胞通過分泌HMGB1調(diào)節(jié)細胞間的黏附特性、改變細胞外基質(zhì)組分促進腫瘤轉(zhuǎn)移[3-4]。基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）通過降解細胞外基質(zhì)參與腫瘤的轉(zhuǎn)移，其中MMP9是MMPs家族中研究較多的一個蛋白，MMP9通過水解黏附分子參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程如腫瘤血管生成和免疫逃避等。目前，有關(guān)HMGB1、MMP9在腎癌中的表達及其與預(yù)后相關(guān)性的研究文獻報道較少，本研究采用實時定量聚合酶鏈法檢測腎癌組織、癌旁腎組織中HMGB1、MMP9的表達，分析其與臨床病理特征、預(yù)后的關(guān)系，從而對腎癌的侵襲、轉(zhuǎn)移機制、預(yù)后作初步探討。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2008年9月-2015年9月于江蘇大學(xué)附屬昆山醫(yī)院收治的67例腎癌患者為研究對象。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：①成年原發(fā)性腎癌患者，首次行腎癌根治術(shù)；②術(shù)后病理證實為腎細胞癌；③術(shù)前未行化療或放療治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：轉(zhuǎn)移性腎癌；未行手術(shù)治療或手術(shù)治療前已行化療或放療治療。67例腎癌患者行腎癌根治性切除手術(shù)，術(shù)后病理切片均證實為腎透明細胞癌。其中，男性41例，女性26例，患者平均年齡（53.4±8.7）歲，切取的部分腫瘤組織放入液氮中保存，同時選取距癌灶3 cm處癌旁組織（手術(shù)切緣組織，經(jīng)HE染色未發(fā)現(xiàn)癌細胞）作為配對樣本的對照，行實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測腎癌組織和癌旁組織中HMGB1、MMP9 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平，免疫組織化學(xué)法觀察HMGB1蛋白的定位。

1.2 主要試劑

SYBR Premix Ex Taq（日本TAKARA公司），Taq DNA Polymeras（美國Promega公司），羊抗人HMGB1多克隆抗體（美國Santa Cruz公司），HMGB1（NM_001313893.1）正向引物：5′-GCCTTCTT CCTCTTCTGCTCT-3′，反向引物：5′-TGTTATTCCAC ATCTCTCCCAG-3′，擴增片段長度106 bp；MMP9（NM_004994.2）正向引物：5′-GCTGGCAGAGGAAT ACCTGTAC-3′，反向引物：5′-CAGGGACAGTTGCT TCTGGA-3′，擴增片段長度112bp；β-actin（X00351.1）正向引物：5′-CCAGGTCATCACCATCGG-3′，反向引物：5′-CCGTGTTGGCGTAGAGGT-3′，引物長度158 bp，引物均由上海捷瑞生物有限公司合成。

1.3 實驗方法

1.3.1 實時定量PCR取出保存于液氮中的腎癌與癌旁組織標(biāo)本，切取100 mg組織放入研缽迅速研磨成粉；使用Trizol法提取腎癌與癌旁組織總RNA，加入1 ml Trizol試劑，冰上研磨5 min，加入氯仿0.2 ml后劇烈振蕩，4℃低溫12 000 r/m離心15 min，吸取上層水相（總RNA）至另一離心管中，依次加入異丙醇0.5 ml、75%乙醇并低溫離心后，用20μl的DEPC處理水溶解沉淀，即可得到總RNA。取1μl的總RNA，按照TaKaRa公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒配置反應(yīng)液，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件如下：42℃，15 min（逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)）；95℃，2 min（滅活逆轉(zhuǎn)錄酶的活性），所獲產(chǎn)物即為cDNA，取2μl的cDNA加入EP管中，同時加入15μl的SYBR Green PCR Master Mix，1μl的HMGB1、MMP9正、反向引物以及8.5μl的ddH2O，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性15 s，60℃退火15s，72℃延伸40s，總計40個循環(huán)。根據(jù)公式Folds= 2-△△Ct來計算目的基因的相對表達量，其中△△Ct=（Ct檢測基因-Ctβ-actin）實驗組-（Ct檢測基因-Ctβ-actin）對照組。

1.3.2 免疫組織化學(xué)法石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，蒸餾水沖片3次，磷酸緩沖鹽溶液沖洗5 min，高溫水煮30 min，磷酸緩沖鹽溶液沖洗5 min，滴加羊抗人HMGB1多克隆抗體（抗體稀釋比例為1∶100），37℃溫箱孵育30 min后置于4℃冰箱過夜，擦凈組織標(biāo)本周圍的水分，置濕盒內(nèi)滴加二抗，37℃溫箱孵育1 h，滴加DAB顯色液，顯微鏡下觀察染色效果。本實驗采用陽性細胞百分率結(jié)合染色強度來判斷蛋白免疫組織化學(xué)的結(jié)果，選擇5個高倍鏡視野，對視野下的陽性細胞計數(shù)：＜5%計0分，5%～25%且染色較淺計1分，26%～50%且染色較深計2分，＞50%且染色深計3分，免疫組織化學(xué)染色得分大于1視為陽性，得0、1分視為陰性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間的比較使用t檢驗，兩組以上均數(shù)比較用one-way ANOVA；HMGB1、MMP9之間的相關(guān)分析用Person法；采用Kaplan-Meier方法進行生存曲線分析，并用Log-rank

檢驗不同組間的統(tǒng)計學(xué)意義；采用Cox比例風(fēng)險模型分析影響預(yù)后指標(biāo)的多因素，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HMGB1、MMP9 mRNA在腎癌組織、癌旁腎組織中的表達

HMGB1 mRNA在67例腎癌組織、癌旁腎組織中的相對表達水平分別為（0.79±0.062）、（0.32± 0.026），腎癌組織中HMGB1 mRNA表達明顯高于癌旁腎組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=57.62，P=0.000）；MMP9 mRNA在腎癌組織中的表達（0.52±0.073）也高于癌旁腎組織（0.14±0.029），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，HMGB1主要定位于在腎癌細胞的胞漿中，腎癌細胞內(nèi)出現(xiàn)大量的棕黃色顆粒，部分癌細胞中甚至呈散在片狀分布，癌旁腎組織中大部分細胞陰性表達，少數(shù)細胞HMGB1陽性表達，但表達較為分散，67例腎癌TNM分期Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期HMGB1陽性率分別為20.0%（3/15）、69.6%（16/23）、77.8%（14/18）、81.8%（9/11），癌癥分期越高，腎癌組織HMGB1陽性率越高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=15.62，P=0.001）。見圖1、2。

圖1 HMGB1、MMP9 mRNA在腎癌組織、癌旁腎組織中的表達

圖2 腎癌組織、癌旁腎組織中HMGB1的表達

2.2 HMGB1、MMP9 mRNA與腎癌臨床病理學(xué)特征的關(guān)系

如表1所示，腎癌組織中腫瘤直徑≤5 cm與＞5cm的HMGB1（t=2.252，P=0.028）、MMP9 mRNA（t=8.248，P=0.000）表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義；TNM分期為Ⅳ期的HMGB1（F=223.3，P=0.000）、MMP9 mRNA（F=335.3，P=0.000）的表達高于Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移度（淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)/淋巴結(jié)取材病理數(shù)）≤0.5與＞0.5的HMGB1（t=17.99，P=0.000）、

MMP9 mRNA（t=19.32，P=0.000）的表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義，而不同性別、年齡HMGB1、MMP9 mRNA的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 腎癌臨床病理學(xué)特征與HMGB1、MMP9 mRNA的相關(guān)性（±s）

表1 腎癌臨床病理學(xué)特征與HMGB1、MMP9 mRNA的相關(guān)性（±s）

項目HMGB1 mRNAt/F值P值MMP9 mRNAt/F值P值性別男（n=41）0.81±0.0671.8830.0640.51±0.0391.9670.054女（n=26）0.78±0.0580.53±0.043年齡/歲≤50（n=15）0.77±0.0581.6800.0980.51±0.0431.4500.152＞50（n=52）0.80±0.0620.53±0.048腫瘤直徑/cm≤5（n=47）0.79±0.0642.2520.0280.48±0.0368.2480.000＞5（n=20）0.83±0.0720.57±0.051 TNM分期Ⅰ（n=15）0.34±0.033 0.23±0.031Ⅱ（n=23）0.72±0.0580.37±0.037Ⅲ（n=18）0.84±0.0730.59±0.051Ⅳ（n=11）0.88±0.0850.72±0.064淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移度≤0.50.53±0.04417.990.0000.38±0.04119.320.000＞0.50.86±0.0820.62±0.052 223.30.000335.30.000

2.3 HMGB1、MMP9 mRNA的表達與預(yù)后

Kaplan-Meier生存曲線分析結(jié)果顯示，67例腎癌患者的平均生存時間為53.8個月，中位生存期63.9個月，1、3、5年的生存率分別為89.6%、77.5%、67.6%；對HMGB1和MMP9表達以及與預(yù)后的相關(guān)性采用Person法分析，HMGB1、MMP9兩者在腎癌組織中表達呈正相關(guān)（r=0.562，P＜0.01），HMGB1 mRNA的表達與預(yù)后呈負相關(guān)（r=-0.591，P＜0.01），MMP9 mRNA的表達與預(yù)后呈負相關(guān)（r=-0.486，P＜0.01）；以67例腎癌患者HMGB1 mRNA表達水平的P25（0.32）、P75（0.86）作為高、低表達的分級指標(biāo)，Log-rank檢驗結(jié)果顯示HMGB1 mRNA低表達腎癌患者的生存期要高于中、高表達患者（χ2= 30.518，P＜0.01），以MMP9 mRNA表達水平的P25（0.35）、P75（0.75）作為高、低表達的分級指標(biāo)，Log-rank檢驗結(jié)果顯示MMP9 mRNA低表達腎癌患者的生存期要高于中、高表達患者（χ2=16.432，P＜0.01）；采用Cox多因素比例風(fēng)險模型分析，結(jié)果顯示HMGB1、MMP9、腫瘤TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移度與預(yù)后相關(guān)（P＜0.05），而性別、年齡、腫瘤直徑與預(yù)后無相關(guān)性（P＞0.05）。見圖3～5和表2。

圖367 例腎癌患者的生存曲線

圖467 例腎癌患者預(yù)后與HMGB1、MMP9的相關(guān)性

圖5 HMGB1、MMP9 mRNA表達水平與患者預(yù)后的關(guān)系

表2 Cox多因素比例風(fēng)險模型分析影響腎癌患者預(yù)后的因素

3 討論

腎癌是泌尿系統(tǒng)較為常見的惡性腫瘤之一，文獻報道晚期腎癌中位生存期為67個月，5年生存率波動于50%～60%[5]，本研究中67例腎癌患者的中位生存期為53.8個月，5年生存率為67.6%。目前，有學(xué)者認為腫瘤TNM分期、淋巴結(jié)或遠處轉(zhuǎn)移是影響腎癌患者長期存活的重要危險因素，本研究中67例腎癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移度＜0.5共23例（34.3%），TNM分期Ⅰ+Ⅱ期共38例（56.8%），這可能是67例腎癌患者5年生存率為67.6%的原因，而且Cox多因素比例風(fēng)險模型分析結(jié)果也證實了這一點。

HMGB1是細胞核內(nèi)重要的非組蛋白成分，WANG等[6]首次發(fā)現(xiàn)HMGB1是一種重要的晚期炎癥遞質(zhì)。然而，最新研究結(jié)果表明在喉癌、前列腺癌、胰腺癌等多種惡性腫瘤中高表達，HMGB1的表達水平與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[7-8]。然而，關(guān)于HMGB1在腎癌組織中表達卻鮮有報道，筆者通過實時熒光定量PCR檢測HMGB1在腎癌組織以及癌旁組織中的表達，結(jié)果提示HMGB1在腎癌組織呈高表達狀態(tài)，而且HMGB1的表達水平與腎癌患者的預(yù)后密切相關(guān)（r=-0.591，P＜0.01），HMGB1高表達患者的預(yù)后較差，是影響患者預(yù)后的獨立危險因素。本研究發(fā)現(xiàn)腎癌組織中HMGB1的表達水平與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，且癌組織中HMGB1的表達高于癌旁組織，表明腎組織中HMGB1的表達水平可能與腫瘤良惡性以及病情進展有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，抑制HMGB1或其受體晚期糖基化終產(chǎn)物受體（receptor for advanced glycation end products，RAGE）的表達可以抑制腫瘤增殖[9]。因此，腎癌組織中HMGB1的表達可以作為評估病情、判斷預(yù)后的重要腫瘤標(biāo)志物，抑制HMGB1或RAGE基因的表達可能是治療腎癌的新途徑，以HMGB1、RAGE為靶基因的治療為腎癌的臨床診治提供新的思路和方法。MMPs是依賴金屬離子（鋅、銅等）的內(nèi)肽酶家族，MMP9是該家族重要的成員之一[10-11]。高表達的MMP9通過降解腫瘤細胞外基質(zhì)，降低細胞間的黏附性，促進腫瘤的轉(zhuǎn)移，從而影響患者的預(yù)后。本研究中MMP9在腎癌組織中的表達要高于癌旁組織，MMP9低表達腎癌患者的預(yù)后要好于高表達，是影響腎癌患者預(yù)后的的關(guān)鍵危險因素，MMP9的表達與患者預(yù)后呈負相關(guān)（r= -0.486，P＜0.01）。通過分析HMGB1、MMP9的表達水平與腎癌患者的臨床病理特征間的相關(guān)性，結(jié)果顯示HMGB1、MMP9的表達水平與腫瘤大小、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示監(jiān)測腎癌組織HMGB1、MMP9的表達水平可以作為判斷患者預(yù)后的重要手段之一。

本研究67例腎癌患者的癌組織中HMGB1、MMP9兩者表達水平存在一定的相關(guān)性（r=0.562，P＜0.01），表明兩者之間可能存在相關(guān)的調(diào)控機制。TAGUCHI等[9]報道，HMGB1通過結(jié)合RAGE，進一步激活P38、JNK等絲裂原活化蛋白激酶信號通路，繼而上調(diào)MMP9的表達，從而促進腫瘤的浸潤及轉(zhuǎn)移，這可能是腎癌組織中HMGB1、MMP9兩者之間的表達水平呈正相關(guān)的原因，LIU等[12]在研究HMGB1、MMP9在小細胞肺癌細胞的浸潤和轉(zhuǎn)移中的作用機制時發(fā)現(xiàn)，HMGB1結(jié)合受體RAGE后，通過激活PI3K/Akt、NF-κB信號通路，從而使MMP-9過表達。因此，筆者推測腎癌組織中MMP9的上調(diào)可能繼發(fā)于HMGB1的升高，但對腎癌組織中HMGB1升高的主要原因仍未得知，有關(guān)HMGB1在腎癌中如何調(diào)控MMP9的機制研究較少，本研究的下一步工作方向是研究HMGB1在腎癌中調(diào)控MMP9的分子機制以及調(diào)控HMGB1升高的可能信號通路，筆者將通過生物信息技術(shù)篩選調(diào)控HMGB1的microRNA，并利用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)加以驗證，同時利用siRNA干擾HMGB1在人腎癌細胞GRC-1中的表達，檢測MMP9的變化趨勢，進一步探討HMGB1、MMP9在腎癌發(fā)生、發(fā)展中的可能機制。

綜上所述，HMGB1、MMP9在腎癌組織中高度表達，兩者表達水平有一定的相關(guān)性；腎癌組織中HMGB1、MMP9的表達水平與腫瘤直徑、腫瘤TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，可能在腎癌的浸潤、轉(zhuǎn)移機制中起著非常重要的作用；HMGB1、MMP9表達水平是影響腎癌患者預(yù)后的獨立危險因素，HMGB1、MMP9低表達患者的長期生存要好于高表達患者，聯(lián)合檢測腎癌組織中HMGB1和MMP9的表達水平可能有助于評估腎癌的生物學(xué)特征和患者預(yù)后。

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（張蕾 編輯）

Expressions of HMGB1 and MMP9 and their clinical significance in renal carcinoma

Hong-fang Zheng,Hou-zhong Ding,Qiao-xing Li,Fang Cao
(Department of Urology,Kunshan Hospital Affiliated to Jiangsu University, Suzhou,Jiangsu 215300,China)

Objective To investigate the expressions of high mobility group box 1 protein(HMGB1)and matrix metalloproteinase 9(MMP9)in renal carcinoma tissue and their relationship with clinic pathological characteristics of renal carcinoma.Methods The expressions of HMGB1 and MMP9 in 67 patients with renal carcinoma were determined using real-time PCR and immunohistochemistry.Statistical analysis was then conducted using Person, Kaplan-Meier and Cox proportional hazards analyses.Results The expressions of HMGB1 and MMP9 in the carcinoma tissues were higher than those in the para-carcinoma tissues,and closely related to TNM stage,lymph node ratio and diameter of tumor.The life time of the patients with low expressions of HMGB1 and MMP9 was longer than the patients with high expressions.The expressions of HMGB1 and MMP9 were negatively correlated with the prognosis. HMGB1,MMP9,TNM stage and lymph node metastasis were independent risk factors for the prognosis of renal carcinoma.Conclusions HMGB1 and MMP9 may play crucial roles in the infiltration and metastasis of renal carcinoma. Joint detection of HMGB1 and MMP9 in renal carcinoma tissues may help to evaluate the prognosis of patients.

renal carcinoma;high mobility group box 1 protein;matrix metalloproteinase 9;prognosis

R737.11

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.22.006

1005-8982（2016）22-0028-06

2016-04-13

丁厚中，E-mail：qingxyz139964126@163.com；Tel：13962675759