唐雪鵬，李適廷，王崇，管付巖

（1.解放軍大連療養(yǎng)院桃源門診，遼寧 大連 116013；2.解放軍第三軍醫(yī)大學新橋醫(yī)院，重慶 400037；3.解放軍第210醫(yī)院山屏街醫(yī)療區(qū)，遼寧 大連 116013；4.解放軍第210醫(yī)院，遼寧 大連 116021）

論著

牙周膜干細胞膜片構建的生物性牙根生物學活性研究*

唐雪鵬1，李適廷2，王崇3，管付巖4

（1.解放軍大連療養(yǎng)院桃源門診，遼寧 大連 116013；2.解放軍第三軍醫(yī)大學新橋醫(yī)院，重慶 400037；3.解放軍第210醫(yī)院山屏街醫(yī)療區(qū)，遼寧 大連 116013；4.解放軍第210醫(yī)院，遼寧 大連 116021）

目的將經(jīng)過鑒定的人牙周膜干細胞（hPDLSC）膜片分別與支架材料預處理牙本質(zhì)片（TDM）和羥基磷灰石/磷酸三鈣（HA-TCP）進行體外共培養(yǎng)，評價不同支架對干細胞分化的影響。方法將單層牙周膜干細胞膜片與2種不同支架材料TDM和HA-TCP分別共培養(yǎng)1周，植入裸鼠皮下，通過掃描電鏡和組織學動態(tài)觀察復合體顯微結(jié)構變化。結(jié)果細胞膜片與TDM邊界處結(jié)合更為緊密；邊界大量礦物沉積和纖維樣組織生成；而在HA-TCP組只有單一的走形相對規(guī)則的纖維組織生成，未有明顯礦化沉積生成。結(jié)論復合的hPDLSC/ TDM組更適合具有生物學特點的干細胞發(fā)揮其特性，在合適的微環(huán)境下使hPDLSC向成牙周組織方向定向分化。

牙周膜干細胞膜片；支架材料；生物性牙根；組織再生

牙周膜干細胞（human periodontalligamentstem cells，hPDLSC）屬于成體干細胞，SEO等[1]首次利用克隆篩選和磁珠分離的方法證實有一種本身可以自我更新，而且還具備多項分化潛能的干細胞存在于

牙周膜中，它可以產(chǎn)生牙周組織中具有特定功能的細胞。雖然牙周膜干細胞膜片在牙周組織再生中的研究已取得一定的研究結(jié)果，但是如何優(yōu)化干細胞膜片與支架材料構建生物性牙根仍然是影響組織再生的技術難題[2-4]。支架材料與微環(huán)境在牙周再生中起決定性作用[5]。體外成功純化和培養(yǎng)的牙周膜干細胞與何種支架材料復合能夠最大程度模擬出體內(nèi)牙周組織再生微環(huán)境，從而產(chǎn)生最佳的再生效果將對于牙周疾病的治療和牙周再生醫(yī)學具有重要意義[6-8]。本實驗旨在探索牙周膜干細胞膜片與2種支架材料構建不同生物性牙根，通過異位移植技術模擬牙周組織再生微環(huán)境，觀察2種生物性牙根組織再生情況，為下一步牙周缺損修復的生物學治療提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與材料

α-DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司，美國），胎牛血清（Hyclone公司，美國），青霉素（Gibco公司，美國），L-谷氨酰胺（Gibco公司，美國），I型膠原酶（Sigma公司，美國），抗壞血酸（Sigma公司，美國），地塞米松（Sigma公司，美國），0.25%胰蛋白酶（Amresco公司，美國），PBS（磷酸鹽緩沖液），二甲基亞砜（DMSO），β-甘油磷酸鈉（Sigma公司，美國）。

1.2 主要儀器

超凈工作臺（蘇州SW-CJ-1SD），二氧化碳恒溫孵箱（Forma公司，美國），離心機（Kubota公司，日本），倒置相差顯微鏡及照相系統(tǒng)（Olympus公司，日本），酶聯(lián)免疫檢測儀（南京華東公司DG5032），6孔培養(yǎng)板（Nunc公司，美國），Transwell共培養(yǎng)房（Nunc公司，美國）。

1.3 方法

1.3.1 牙周膜干細胞的培養(yǎng)與鑒定于第三軍醫(yī)大學新橋醫(yī)院頜面外科門診，選擇1例無牙周炎癥的智齒拔除。PBS沖洗4遍，用刮刀朝一個方向刮取根中1/3的牙周膜組織，置于6孔板內(nèi)。加入α-MEM培養(yǎng)液（20μg/ml抗壞血酸，10%FBS，0.3 mg/ml谷氨酰胺、100 u/ml青霉素）37℃、40 min、二氧化碳CO2恒溫培養(yǎng)，直至細胞從組織塊邊緣爬出后，繼續(xù)培養(yǎng)細胞直至生長匯合率達到80%時，采用有限稀釋法進行克隆分離、挑選單克隆用于本項實驗。

1.3.2 多向分化能力的檢測第4代的hPDLSC懸液搖勻后，以1×104個/ml的密度接種到6孔板中，直至細胞擴增至60%時，開始替換為礦化誘導液（含40μg/ml的α-MEM培養(yǎng)液、10%FBS、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、0.1μm/L地塞米松），每2天換液一次，誘導14 d后PBS沖洗2遍，4%多聚甲醛固定，茜素紅染色，使用倒置顯微鏡觀察。

第4代的hPDLSC細胞懸液，以1×104個/ml的密度均勻接種到6孔板中，直至細胞擴增到60%左右時，加入成脂肪細胞誘導液（含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液、0.5 mmol/LIBMT、10μmol/L胰島素、200μmol/L地塞米松），每2天換液，誘導14 d后PBS沖洗2遍，再用4%多聚甲醛固定，油紅O染色，倒置顯微鏡下觀察。

1.3.3 流式細胞儀檢測取對數(shù)期生長狀態(tài)良好的4代hPDLSC，先胰酶消化，將2 ml無水乙醇和1 ml PBS充分地吹打均勻，并將細胞密度調(diào)整至1× 105/ml，再用40 g/L的多聚甲醛固定30 min；充分洗滌后分別加一抗：抗-CD105（稀釋濃度1∶100）；抗-CD146（稀釋濃度1∶120）；抗Stro-1（稀釋濃度1∶100）。37℃孵育50 min，加入羊抗兔Ig-FITC，37℃避光50 min，流式細胞儀檢測表達水平。

1.4 單層干細胞膜片的制備

將增殖狀態(tài)良好的經(jīng)鑒定過的第4代hPDLSC以胰蛋白酶消化5 min，制成均勻的細胞懸液，調(diào)整細胞密度1×105個細胞分別均勻接種在培養(yǎng)皿中，加入10 ml誘導培養(yǎng)液（含經(jīng)抗壞血酸、10%FBS的DMEM0），2 d換液一次，孵育10 d。

1.52 種支架材料的制備與檢測

1.5.1 牙本質(zhì)片的處理（treated dentin matrix，TDM）將用于正畸治療需要拔除的上頜第一前磨牙2顆與下頜第一前磨牙2顆分別用外科手術刀將剩余牙周組織完全刮除，切取根中1/3牙體組織，將剩余的牙體組織制備成2 mm×3 mm大小的長方體，去離子水中浸泡；17%EDTA浸泡5 min，保存于無菌PBS溶液中，置于4℃冰箱備用。

1.5.2 羥基磷灰石-磷酸三鈣（hydroxyapite-tricalcium，HA-TCP）的制備將100 ml的氫氧化鈣Ca（OH）2溶液與600 ml磷酸水溶液攪拌均勻直至形成非結(jié)晶羥基磷灰石的溶液。表面進行干燥并預燒結(jié)12 h，最后修整成3 mm×5 mm大小片狀結(jié)構，CO60常規(guī)消毒備用。

1.5.3 牙周膜干細胞膜片與2種支架材料復合培養(yǎng)掃描電鏡觀察將制備好的支架材料置于一次性培養(yǎng)皿上，浸泡于含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中30 min，將膜片分別與支架材料全方位復合，構建生

物性牙根體。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱共孵育7 d，3%戊二醛緩沖液（pH 7.4）固定，PBS沖洗干凈，固定、干燥、噴金。掃描電鏡觀察。

1.5.4 裸鼠皮下異位移植4周齡裸鼠4只購于第三軍醫(yī)大學新橋醫(yī)院動物中心，并經(jīng)第三軍醫(yī)大學倫理委員會許可。將細胞與2種支架材料復合體植入裸鼠皮下：左側(cè)實驗組植入TDM+HPDLSC膜片（經(jīng)體外共培養(yǎng)），右側(cè)對照組植入HA-TCP+ HPDLSC膜片（經(jīng)共培養(yǎng)）。移植6周取材，10%福爾馬林固定1周，沖洗、脫鈣、系列脫水、石蠟包埋、切片，進行HE染色，光鏡下組織學觀察。

2 結(jié)果

2.1 hPDLSC形態(tài)學觀察

鏡下可見，hPDLSCs呈長梭形纖維狀，集落狀生長（見圖1A、B）。經(jīng)成骨誘導后出現(xiàn)明顯礦化結(jié)節(jié)，經(jīng)成脂誘導后出現(xiàn)明顯脂滴，說明細胞具有多向分化能力（見圖1C、D）。流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，細胞表面的干細胞標志性分子CD105、CD146和 STRO-1均成陽性表達（見圖2）。成熟的hPDLSCs細胞單層細胞膜片見圖3。

圖1 牙周膜干細胞的分離與鑒定

圖2 牙周膜干細胞表面特異性CD分子檢測

圖3 成熟的hPDLSCs細胞單層細胞膜片大體觀

2.2 支架材料掃描電鏡觀察

TDM電鏡觀顯示TDM適合作為支架材料誘導細胞和微環(huán)境；HA-TCP掃描電鏡觀可見表面形態(tài)良好，適合細胞黏附和增殖（見圖4）。

圖4 TDM與HA-TCP掃描電鏡觀（×30）

2.3 PDLCS膜片與支架材料共培養(yǎng)掃描電鏡觀察

共培養(yǎng)7 d后，掃描電鏡下可見PDLSC/TDM組界面結(jié)合處細胞排列整齊緊密，細胞的極性化較為明顯，結(jié)合處有明顯的類牙骨質(zhì)的礦化結(jié)節(jié)產(chǎn)生（見圖5A、B）；而在PDLSC/HA-TCP組可見大量的走形不規(guī)則的纖維樣組織生成，細胞與支架材料結(jié)合處有空隙，未見明顯的細胞外礦化基質(zhì)的產(chǎn)生（見圖5C、D）。

2.4 PDLSC膜片與支架材料裸鼠皮下異位移植組織學觀察

組織學結(jié)果發(fā)現(xiàn)，hPDLSC/TDM組細胞極性化趨勢更為明顯，膜片內(nèi)細胞與支架材料結(jié)合處形成大量走形規(guī)則的纖維連接，穿通性明顯，還能夠觀察

到不均量的礦化物沉積和纖維樣組織，似牙周膜/牙骨質(zhì)樣結(jié)構，箭頭處可見交界處明顯的礦化沉積（見圖6A）；PDLSC/HA-TCP組有走形不規(guī)則的穿通纖維形成，形成少量的表面礦化沉積，箭頭處所示（見圖6B）。

圖6 hPDLSC與支架復合物裸鼠體內(nèi)異位移植組織再生結(jié)果（×40）

3 討論

作為理想的組織工程學的支架材料可以從微觀結(jié)構上控制生物材料與細胞間的相互作用，實現(xiàn)細胞的定位黏附、增殖分化及細胞微環(huán)境的重建[9-11]。細胞定植到支架的表面作為組織再生的第一步尤為重要。只有細胞定植到支架上后，細胞才能夠定向增殖并且分泌細胞外基質(zhì)。細胞外基質(zhì)作為細胞與支架材料接觸最重要的結(jié)合位點可以使細胞更好的黏附到支架材料上。目前已有文獻證實，通過細胞的三維培養(yǎng)，促使細胞膜片分泌大量的細胞外基質(zhì)，提高了細胞對材料材料的黏附能力[12-13]。而本實驗所選用的經(jīng)過特殊處理的牙本質(zhì)片通過梯度化表面修飾處理，不僅可以提高支架材料的誘導特性，并且極大地優(yōu)化細胞與支架的特異性作用，從而有利于提高種子細胞的生物學特性。

細胞外基質(zhì)是使用組織工程學原理構建的生物性牙根的重要組成部分，它的構建過程極漫長和復雜，受多方面因素影響[14-16]。但來自于細胞所處的微環(huán)境的動態(tài)變化將直接或間接影響細胞外基質(zhì)的平衡的作用，促進細胞外基質(zhì)的時空變化[17]。當細胞與支架緊密結(jié)合后，細胞膜表面特異性受體會識別支架材料表面相應的配體，并與之相結(jié)合，從而產(chǎn)生特異性結(jié)合，調(diào)節(jié)和促使種子細胞自分泌細胞外基質(zhì)及發(fā)生適應性結(jié)構和功能改建。通過支架材料的誘導，存在于細胞膜片內(nèi)的干細胞和細胞外基質(zhì)將發(fā)生功能性重組，細胞的排列、形態(tài)、細胞內(nèi)微結(jié)構以及細胞外基質(zhì)骨架的三維構象均將發(fā)生轉(zhuǎn)變，該種變化影響著干細胞最終的分化方向[18]。本實驗選用的支架材料TDM與HA-TCP均為具有一定活性的誘導性材料，能夠誘導牙周膜干細胞向成骨方向定性分化。SEM結(jié)果表明，兩種支架材料均能使干細胞膜片內(nèi)細胞分泌細胞外基質(zhì)，但TDM還表現(xiàn)出具有提升礦化基質(zhì)沉積量的作用，更為重要的是在接觸共培養(yǎng)的情況下膜片內(nèi)細胞形態(tài)學發(fā)生明顯改變，表現(xiàn)為細胞更為狹長、細胞突起減少和細胞極性增加，該特征是否與膜片內(nèi)干細胞的分化以及生物學活性的變化有關，是值得進一步探討的內(nèi)容。

本實驗所選用的2種支架材料均有孔隙率高的特點，有利于細胞的黏附。但塊狀的HA-TCP存在材料表面的親和力差、強度不高和表面自由基容易喪失等缺點。而TDM卻具有定向誘導、強度硬度較高，更易于細胞表面黏附分子與自由基的附著與固位，在共培養(yǎng)體系中更易誘導干細胞向成骨方向分化。從本實驗結(jié)果顯示，TDM與干細胞膜片的復合共培養(yǎng)更類似體內(nèi)牙周組織再生的過程，可以為骨組織工程化發(fā)展提供新的思路。

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（張蕾 編輯）

Biological activity of biological roots constructed by periodontal ligament stem cell sheet*

Xue-peng Tang1,Shi-ting Li2,Chong Wang3,Fu-yan Guan4
(1.Taoyuan Clinic of Dalian Sanatorium of Chinese PLA,Dalian,Liaoning 116013,China; 2.Department of Stomatology,Xinqiao Hospital,the Third Military Medical University, Chongqing 400037,China;3.Shanping Medical District of No.210 Hospital of Chinese PLA, Dalian,Liaoning 116013,China;4.The No.210 Hospital of Chinese PLA, Dalian,Liaoning 116021,China)

Objective To co-culture the identified human periodontal ligament stem cell membranes(hPDLSC) respectively with pretreated dentin matrix(TDM)and hydroxyapatite/tricalcium(HA-TCP)in vitro,and evaluate the effects of different scaffolds on stem cell differentiation.Methods Monolayer periodontal ligament stem cell membrane was incubated with two different scaffold materials for 1 week,and implanted into osteoporosis rats.Using scanning electron microscopy and histological section,the microsture changes were dynamically observed.Results A lot of mineral deposition and fibrous tissue were formed in the dentin matrix(TDM)group and there was some irregular fibrous tissue regeneration in the HA-TCP group without obvious mineral material generation.Conclusions hPDLSC/TDM composite is more suitable for the stem cells to fully develope their own biological characteristics.It can be more suitable for hPDLSC to differentiate into periodontium in suitable microenvironment.

periodontal ligament stem cell sheet;scaffold material;biological root;tissue regeneration

R-332

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.22.003

1005-8982（2016）22-0013-05

2016-05-06

國家自然科學基金（No：81300873）

管付巖，E-mail：1291512662@qq.com.