王海軍，陸欣，張彥芬，劉聚良，韓永強(qiáng)

（河北醫(yī)科大學(xué)附屬邢臺(tái)人民醫(yī)院1.胸外科，2.血液科，河北 邢臺(tái) 054001）

論著

MT-3通過(guò)激活NF-κB信號(hào)通路抑制食管癌病理進(jìn)展

王海軍1，陸欣2，張彥芬1，劉聚良1，韓永強(qiáng)1

（河北醫(yī)科大學(xué)附屬邢臺(tái)人民醫(yī)院1.胸外科，2.血液科，河北 邢臺(tái) 054001）

目的食管癌的發(fā)生與多種基因突變相關(guān)，基因的表達(dá)異常產(chǎn)生腫瘤，本文集中探討食管癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制。方法選取河北醫(yī)科大學(xué)附屬邢臺(tái)人民醫(yī)院2009年7月-2011年2月腫瘤科食管癌患者92例。選取其腫瘤組織及其癌旁組織樣本，檢測(cè)金屬硫蛋白3（MT-3）在食管癌組織和其癌旁組織中的表達(dá)，在食管癌細(xì)胞系中構(gòu)建過(guò)表達(dá)MT-3和低表達(dá)MT-3的細(xì)胞系，檢測(cè)這些MT-3表達(dá)不同時(shí)，NF-κB信號(hào)通路在其中是否處于激活狀態(tài)。采用Western blot檢測(cè)P65、pP65蛋白的表達(dá)，免疫熒光檢測(cè)pP65是否在MT-3過(guò)表達(dá)時(shí)有入核表達(dá)。結(jié)果定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）結(jié)果顯示食管癌腫瘤組織中MT-3的表達(dá)高于癌旁組織（P=0.001）。通過(guò)qPCR檢測(cè)構(gòu)建的高表達(dá)和低表達(dá)MT-3的食管癌細(xì)胞系均成功構(gòu)建，進(jìn)而檢測(cè)P65、pP65，顯示在過(guò)表達(dá)MT-3時(shí)，pP65蛋白表達(dá)增多，低表達(dá)MT-3時(shí)pP65蛋白表達(dá)減少，P65則顯現(xiàn)出相反的結(jié)果，且表達(dá)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，所以認(rèn)為MT-3高表達(dá)時(shí)NF-κB信號(hào)激活。免疫熒光檢測(cè)高表達(dá)MT-3的食管癌細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞核入核明顯增多，進(jìn)一步說(shuō)明MT-3激活了NF-κB信號(hào)通路。結(jié)論MT-3在食管癌中通過(guò)激活NF-κB信號(hào)通路進(jìn)而抑制食管癌的病理進(jìn)程。

MT-3；NF-κB；信號(hào)通路；食管癌

食管癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，涉及一系列的生理變化，包括細(xì)胞凋亡、增殖、轉(zhuǎn)移及侵襲的異常。正常生理?xiàng)l件下，細(xì)胞內(nèi)乙酰化與去乙?；教幱趧?dòng)態(tài)平衡，而在多種腫瘤中金屬硫蛋白3（metallothionein 3，MT-3）活性異常，被募集結(jié)合在特定的啟動(dòng)子區(qū)，導(dǎo)致一系列基因的轉(zhuǎn)錄抑制，涉及細(xì)胞增殖、分化、遷移、侵襲轉(zhuǎn)移等相關(guān)基因[1-3]。MT-3是一類調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄因子的酶。MT-3是與腫瘤關(guān)系最為密切的一種基因，可作用于相應(yīng)的組蛋白而調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄[4]。文獻(xiàn)[5-6]證實(shí)腫瘤細(xì)胞中MT-3的缺失能使腫瘤細(xì)胞周期阻滯在G1期或G2/M期，導(dǎo)致有絲分裂細(xì)胞的丟失，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制，及凋亡細(xì)胞比例的增加。充分說(shuō)明了MT-3的表達(dá)與腫瘤細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖及凋亡密切相關(guān)。

其中MT-3基因定位于人6號(hào)染色體，可抑制細(xì)胞Cyclin-CDK復(fù)合物或細(xì)胞增殖抗原的活性，當(dāng)MT-3蛋白表達(dá)的升高，阻止了CyclinD1與CDK4結(jié)合，使細(xì)胞周期阻滯在G1期，抑制細(xì)胞的增殖[7-8]。研究已證實(shí)MT-3作為細(xì)胞周期負(fù)性調(diào)控因子，與食管癌細(xì)胞增生、轉(zhuǎn)移有關(guān)，并且具有良好的預(yù)后價(jià)值。NF-κB是一個(gè)與炎癥相關(guān)的信號(hào)通路，有人報(bào)道腫瘤的發(fā)生發(fā)展是由炎癥慢慢演化而成的，炎癥的發(fā)生導(dǎo)致機(jī)體很多基因表達(dá)異常，進(jìn)而進(jìn)一步激活相關(guān)信號(hào)通路[9-10]。很多腫瘤疾病的發(fā)生都與NF-κB信號(hào)通路密切相關(guān)。主要通過(guò)外源性的因素導(dǎo)致P65入核增多，進(jìn)而發(fā)生細(xì)胞核的磷酸化，激活該信號(hào)通路，促進(jìn)炎癥的發(fā)生，進(jìn)一步影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

但是MT-3在食管癌中的表達(dá)及其發(fā)生機(jī)制還需更進(jìn)一步的研究，本研究擬探討MT-3在食管癌中的發(fā)病機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集河北醫(yī)科大學(xué)附屬邢臺(tái)人民醫(yī)院2009年7月-2011年2月腫瘤科食管癌患者92例作為研究對(duì)象。取患者腫瘤組織和癌旁組織。所有患者臨床資料完整，包括一般情況、病理診斷、腫瘤分期、治療方式和生存狀況等，有較為完整的隨訪資料完整，患者各類臨床資料均保存良好。

1.2 定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）

逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司，等量組織，加入同等比例的Trizol，12 000 r/min，4℃離心10 min；吸取上清液至一新的EP管中，靜置5 min，裂解充分；加入200μl氯仿，振蕩器上震蕩15 s，放置3 min；12 000 r/min，4℃離心15 min，離心完成后分為3層，取最上層（中間一層為蛋白）至一新的EP管中，在吸取的最上層EP管中加入等體積異丙醇，4℃進(jìn)行，來(lái)回顛倒數(shù)次，室溫沉淀10 min；12 000 r/min，4℃離心10 min，棄去上清液；加入75%乙醇（DEPC水溶解），混勻液體；7 500 r/min，4℃5 min，棄上清液，小心吸盡液體（此時(shí)可以看到白色沉淀即為RNA）；RNA略干后加入20μl DEPC水。用核酸染料法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)MT-3在食管癌中的表達(dá)研究。引物序列為：MT-3，正向：GCCGGUCAUGUCCAAAGUATT，反向：UACU UUGGACAUGACCGGCTT；GAPDH，正向：GCCCTGA GGGCCCGAACTGTTACT，反向：CAGACGCACGGCT TTGACCTTCTT。反應(yīng)程序?yàn)椋侯A(yù)變性95℃，10 min；循環(huán)中變性95℃，30 s；退火55℃，30 s延伸72℃，30秒，反應(yīng)40個(gè)循環(huán)，融解曲線分析。

1.3 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)和低表達(dá)的MT-3的食管癌細(xì)胞株

將處于對(duì)數(shù)期的TE-1細(xì)胞（購(gòu)自于ATCC）種于6孔板中，保證每孔細(xì)胞量約為3×105，lipo 2000加入5μl用100μl無(wú)血清培養(yǎng)基混勻，靜置5 min，同時(shí)高表達(dá)和低表達(dá)的MT-3的質(zhì)粒（購(gòu)買自廣州銳博生物有限公司）12μl于100μl無(wú)血清的培養(yǎng)基中混勻，5 min后兩者混勻20 min，然后加入1 800μl的無(wú)血清培養(yǎng)基，48 h后提取RNA進(jìn)行檢測(cè)。過(guò)表達(dá)和低表達(dá)的MT-3的質(zhì)粒MT-3序列合成于廣州銳博生物公司，相應(yīng)的對(duì)照組為該段序列的無(wú)意替換。MT-3和U6的引物序列前面已經(jīng)提及。

1.4 蛋白免疫印跡法（Western blot）

提取血清蛋白，運(yùn)用碧云天蛋白試劑盒提取組織蛋白。用BCA進(jìn)行定量。按照A液∶B液以50∶

1的比例進(jìn)行配置BCA溶液。取收集的細(xì)胞上清2μl，加入18μl PBS，200μl AB混合液。將所有蛋白樣品用補(bǔ)足液調(diào)至等濃度，同時(shí)加入5X的溴酚藍(lán)，占比總體積的1/5。上樣前將膠板下的氣泡趕走，所有蛋白樣品調(diào)至等濃度后上樣，蛋白上樣量保證在一定濃度上進(jìn)行，同時(shí)加入6μl蛋白marker。以初始電壓為80V跑濃縮膠，然后升至120 V跑分離膠。在目的蛋白泳動(dòng)至距膠下緣1 cm以上結(jié)束。浸泡PVDF膜：將PVDF膜泡在甲醇中5 min。恒流250 mA，90 min，然后將膜從電轉(zhuǎn)槽中取出，TBST稍加漂洗，5%脫脂牛奶封閉液中緩慢搖蕩1 h。TBST稍加漂洗，一抗孵育過(guò)夜，第2天將其放在常溫復(fù)溫40 min，然后TBST漂洗膜3次，每次5 min。根據(jù)一抗來(lái)源選擇二抗，室溫輕搖1 h。二抗孵育結(jié)束后，用TBST漂洗膜3次，每次5 min。對(duì)洗后的PVDF膜發(fā)光顯影，用ECL發(fā)光液進(jìn)行發(fā)光顯影，配置方法為A液∶B液1∶1進(jìn)行配置，進(jìn)行發(fā)光顯影。

1.5 免疫熒光檢測(cè)

組織經(jīng)過(guò)固定后，蔗糖梯度脫水，冷凍切片，切片厚度為6μm，高溫修復(fù)5 min，待其冷卻后，PBS洗滌（3次，每次5 min），10%BSA封閉50 min，加入pP65抗兔一抗（美國(guó)CST公司），二抗兔抗鼠（美國(guó)CST公司），然后進(jìn)行DAPI染色，1∶100（美國(guó)Santa公司）。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用t檢驗(yàn)，Pearson相關(guān)分析，χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MT-3在食管癌中的表達(dá)

PCR檢測(cè)食管癌患者組織標(biāo)本92例及癌旁食管癌組織標(biāo)本92例，檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)MT-3在癌組織中高表達(dá)，且與癌旁組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P= 0.001）。如圖1所示，檢測(cè)結(jié)果提示MT-3在食管癌的發(fā)生發(fā)展中可能扮演者重要的角色。

2.2 MT-3激活NF-KB信號(hào)通路

本研究成功構(gòu)建了MT-3過(guò)表達(dá)和MT-3低表達(dá)的2種食管癌TE-1細(xì)胞株，圖2A所示為成功構(gòu)建的MT-3高表達(dá)的TE-1細(xì)胞系，圖2B所示為成功構(gòu)建的低表達(dá)MT-3的TE-1，在2種細(xì)胞株中分別檢測(cè)NF-κB中P65和pP65的蛋白表達(dá)。如圖2C所示為高表達(dá)MT-3的TE-1，相比于對(duì)照組，在P65減少的情況下，pP65表達(dá)量增多，細(xì)胞入核增多，與低表達(dá)MT-3的TE-1比較，當(dāng)轉(zhuǎn)入低表達(dá)的MT-3時(shí)，pP65表達(dá)減少，細(xì)胞入核減少，所以從過(guò)表達(dá)和低表達(dá)兩方面正反驗(yàn)證了NF-κB信號(hào)處于激活狀態(tài)。

2.3 在MT-3高表達(dá)時(shí)pP65入核

檢測(cè)在TE-1細(xì)胞系中加入MT-3重組蛋白后NF-κB信號(hào)變化。分別在TE-1細(xì)胞系中加入DMSO和MT-3重組蛋白，檢測(cè)結(jié)果顯示在加入MT-3后pP65入核明顯增多，即NF-κB信號(hào)被激活，相反在加入DMSO后，TE-1細(xì)胞系中pP65基本沒(méi)有入核，NF-κB信號(hào)未被激活。見(jiàn)圖3。

圖1 MT-3的表達(dá)檢測(cè)

圖2 MT-3激活NF-κB信號(hào)通路

圖3 MT-3激活NF-κB信號(hào)

3 討論

大量的研究證實(shí)了MT-3功能異常與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[9]。有學(xué)者通過(guò)免疫組織化學(xué)檢測(cè)MT-3在170例外科手術(shù)切除的原發(fā)性肝癌組織及癌旁正常組織表達(dá)，發(fā)現(xiàn)較肝癌組織中MT-3的表達(dá)顯著高于癌旁正常組織，并與腫瘤級(jí)別密切相關(guān)。并且有研究[10-12]證實(shí)運(yùn)用MT-3抑制劑可抑制肝癌、肺癌、宮頸癌、前列腺癌及乳腺癌等一系列惡性腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，誘導(dǎo)其分化或凋亡。這些發(fā)現(xiàn)充分說(shuō)明了MT-3的異常與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，但是其在食管癌中的作用還未被研究[13]，因此本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步通過(guò)qPCR檢測(cè)MT-3在食管癌中的表達(dá)，本次研究結(jié)果顯示在腫瘤患者中腫瘤組織部位MT-3的表達(dá)明顯高于其癌旁組織。

NF-κB是一條經(jīng)典的炎癥信號(hào)通路相關(guān)因子，參與細(xì)胞分裂、增殖及凋亡的調(diào)控，對(duì)炎癥或者免疫應(yīng)答等相關(guān)的反應(yīng)進(jìn)行調(diào)節(jié)，NF-κB是一種關(guān)鍵性的轉(zhuǎn)錄因子，也參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)眾多生理活動(dòng)或病理過(guò)程，如神經(jīng)元可塑性、炎癥、突觸傳遞和疼痛。炎癥因子的上調(diào)又可以活化其他炎癥細(xì)胞因子形成正反饋調(diào)節(jié)，最終導(dǎo)致炎癥的泛化[14-15]。NF-κB這個(gè)信號(hào)通路已被較廣泛的研究，NF-κB pP65蛋白由胞漿向胞核轉(zhuǎn)移的核定位信號(hào)是NF-κB信號(hào)通路激活的關(guān)鍵點(diǎn)，該信號(hào)通路可調(diào)控上百個(gè)靶基因的轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生廣泛的生物學(xué)效應(yīng)[16-18]。為了研究NF-κB是否參與了MT-3調(diào)控的食管癌發(fā)病機(jī)制，本研究成功構(gòu)建MT-3高表達(dá)和低表達(dá)的TE-1細(xì)胞系，檢測(cè)pP65在其中的變化，發(fā)現(xiàn)MT-3高表達(dá)時(shí)，pP65明顯增多，初步猜測(cè)NF-κB這個(gè)信號(hào)通路被激活，在TE-1中加入重組蛋白MT-3后發(fā)現(xiàn)pP65細(xì)胞入核明顯，即肯定NF-κB這一信號(hào)通路是由于MT-3高表達(dá)而被激活。有研究顯示，在腫瘤發(fā)生后，如果可以有效地控制炎癥因子的釋放，減輕炎癥反應(yīng)，將有可能阻止脊髓組織的進(jìn)一步損傷，從而改善預(yù)后。筆者猜測(cè)MT-3的低表達(dá)可能會(huì)減輕食管癌患者的病情，當(dāng)然這種猜測(cè)還需更進(jìn)一步的研究證實(shí)。

[1]張思維,張敏,李光琳,等.2003-2007年中國(guó)食管癌發(fā)病與死亡分析[J].中國(guó)腫瘤,2012,21(4):241-247.

[2]SENESE S,ZARAGOZA K,MINARDI S,et al.Role for histone deacetylase 1 in human tumor cell proliferation[J].Mol Cell Biol, 2007,27(13):4784-4795.

[3]曾劍,周星明.食管癌微創(chuàng)外科治療的發(fā)展與現(xiàn)狀[J].中國(guó)腫瘤, 2013,22(9):728-732.

[4]ORTHMANN A,PEIKER L,FICHTNER I,et al.Improved treatment of MT-3 breast cancer and brain metastases in a mouse xenograftby LRP-targetedoxaliplatinliposomes[J].J Biomed Nanotechnol,2016,12(1):56-68.

[5]TIAN Z Q,XU Y Z,ZHANG Y F,et al.Effects of metallothionein-3 and metallothionein-1E gene transfection on proliferation,cell cycle,and apoptosis of esophageal cancer cells[J].Genet Mol Res,2013,12(4):4595-4603.

[6]DUTTA R,SENS DA,SOMJI S,et al.Metallothionein isoform 3

expression inhibits cell growth and increases drug resistance of PC-3 prostate cancer cells[J].Prostate,2002,52(2):89-97.

[7]鄭蕓,張有為,陳龍邦,等.食管鱗癌患者血清RUNX3基因甲基化檢測(cè)及臨床意義[J].癌癥進(jìn)展,2010,8(3):290-294.

[8]黃思語(yǔ),尹東,鄧彥超,等.新疆哈薩克族食管癌患者ALDH1L1基因甲基化及其與預(yù)后的關(guān)系[J].癌變·畸變·突變,2014,26(1): 35-39.

[9]張志勉.食管癌患者PBMCs表面MHC-I類分子表達(dá)改變及其機(jī)制的初步探討[D].山東大學(xué),2011.

[10]李許鋒.食管鱗癌甲基化譜和表達(dá)譜的聯(lián)合分析及早期診斷標(biāo)志物的篩選[D].南方醫(yī)科大學(xué),2014.

[11]于偉娜.MMP-2、TIMP-2、PINCH在食管鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)意義及相關(guān)研究[D].河北醫(yī)科大學(xué),2011.

[12]武志.MMP-2、MMP-9在食管癌中表達(dá)的研究[D].泰山醫(yī)學(xué)院, 2010.

[13]王洪濤,周清華.E-鈣粘蛋白復(fù)合體與肺癌的侵襲轉(zhuǎn)移[J].中國(guó)肺癌雜志,2010,13(3):254-259.

[14]路曉雯,劉林祥,崔新建,等.18F-FDG PET/CT對(duì)結(jié)直腸癌術(shù)后血清CEA升高病例的臨床診斷價(jià)值[J].泰山醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2010, 31(2):83-85.

[15]VON-BURSTIN J,ESER S,PAUL M C,et al.E-cadherin regulates metastasis of esophageal carcinoma in vivo and is suppressed by a NF-κB repressor complex[J].Gastroenterology,2009,137(1): 361-371.

[16]林建清,朱世澤,林若柏,等.基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP-9)及其抑制劑(TIMP-1)在食管鱗癌中表達(dá)的臨床意義[J].中國(guó)腫瘤臨床, 2003,30(10):708-711.

[17]李曼,潘琳娜,張志燕,等.b-FGF在食管癌中的表達(dá)及臨床意義[J].實(shí)用腫瘤學(xué)雜志,2006,20(4):324-325.

[18]BERNARDO M M,MENG Y,LOCKETT J,et al.Maspin reprograms the gene expression profile of prostate carcinoma cells for NF-KB[J].Genes Cancer,2011,2(11):1009-1022.

（張蕾 編輯）

MT-3 aggravates pathological process of esophageal cancer through activation of NF-κB signaling passway

Hai-jun Wang1,Xin Lu2,Yan-fen Zhang1,Ju-liang Liu1,Yong-qiang Han1
(1.Department of Thoracic Surgery;2.Department of Hematology,Xingtai Pepole's Hospital of Hebei Medical University,Xingtai,Hebei 054001,China)

Objective To research the development mechanism of esophageal cancer.Methods Ninety-two cases of esophageal cancer patients treated in Xingtai Pepole's Hospital of Hebei Medical University from July 2009 to February 2011 were selected for the study.MT-3 expression was detected in esophageal cancer tissues and the peri-cancerous tissues.MT-3 overexpression and low-expression cell lines were constructed.The activation state of NF-κB signaling pathway was checked at different levels of MT-3 expression.Then the expressions of P65 and pP65 were tested by Western blot.Immunofluorescence was used to further test whether pP65 was expressed in the nuclei when MT-3 was over-expressed.Results The expression of MT-3 in the tumor tissues was higher than that in the adjacent tissues(P=0.001).A high MT-3 expression esophageal cancer cell line and a low MT-3 expression cell line were successfully constructed.pP65 protein expression was enhanced when MT-3 was over-expressed,but decreased at low MT-3 expression;in contrast,P65 showed the opposite results with significant differences,which

MT-3;NF-κB;esophageal cancer

R735.1

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.22.005

1005-8982（2016）22-0023-05

2016-04-06

suggested NF-κB signal was activated when MT-3 was over expressed.Immunofluorescence revealed that in MT-3 overexpression cells,more pP65 was expressed in the nuclei,which further supported that MT-3 activated NF-κB signaling pathway.Conclusions MT-3 suppresses the pathological process of esophageal cancer through activation of NF-κB signals.