賈 垚， 王 鵬,2， 陳曦航,2， 武承興

(1山西醫(yī)科大學第一醫(yī)院整形科，太原 030001； 2山西醫(yī)科大學第一臨床醫(yī)學院； 3山西大醫(yī)院整形科；*通訊作者，E-mail: 591292983@qq.com)

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丹紅注射液對自體脂肪顆粒移植存活率的影響

賈 垚1， 王 鵬1,2， 陳曦航1,2， 武承興3*

(1山西醫(yī)科大學第一醫(yī)院整形科，太原 030001；2山西醫(yī)科大學第一臨床醫(yī)學院；3山西大醫(yī)院整形科；*通訊作者，E-mail: 591292983@qq.com)

目的 觀察中藥制劑丹紅注射液對自體脂肪顆粒移植成活率的影響。 方法 建立SD大鼠自體脂肪顆粒移植動物模型，分為低劑量組，高劑量組和模型組。實驗組分別持續(xù)肌肉注射不同劑量的丹紅注射液，模型組不做處理，術后不同時間檢測血液中VEGF含量。術后90 d采集脂肪移植體樣本，與術前記錄數(shù)據(jù)進行對比得到移植存活率；HE染色后鏡下觀察脂肪移植組織細胞形態(tài)和血管密度；血管內皮細胞Ⅷ因子免疫組化法觀察新生血管生長情況及密度。 結果 自體脂肪顆粒移植術后90 d，實驗組脂肪存活率均明顯高于模型組(P<0.05)。ELISA結果顯示，低劑量組和高劑量組SD大鼠血清VEGF表達各時段水平明均顯高于模型組(P<0.05)。HE染色顯示低劑量組和高劑量組在脂肪細胞數(shù)量、形態(tài)、脂肪移植體纖維化程度優(yōu)于模型組，血管內皮細胞Ⅷ因子免疫組織化學染色示新生毛細血管密度高于模型組。 結論 丹紅注射液能顯著提高SD大鼠自體脂肪顆粒移植的存活率。

自體脂肪移植； 丹紅注射液； 血管內皮細胞生長因子； 血管新生； 大鼠； 存活率

近年來，由于軟組織缺損而造成的先天性或后天性畸形的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，最重要的缺損是皮下脂肪組織的缺損[1]。目前治療方案中自體脂肪組織填充最為常用[2]。但自體脂肪注射進行缺損修復時，注射顆粒脂肪存在著吸收率較高的問題，嚴重影響了自體脂肪移植的效果[3]。這個問題也得到了國內外許多學者的關注和研究。這些研究主要集中于兩個方面，一方面是提高自體移植脂肪組織內脂肪細胞的增殖能力，或者促進前脂肪細胞及脂肪干細胞(adipose derived stem cells，ADSCs)向成熟的脂肪細胞分化；另一方面通過改善自體脂肪移植組織的受區(qū)環(huán)境，促進血管內皮細胞增殖，誘導新生血管形成，盡快重建游離脂肪的血運，增加自體移植脂肪組織的血液供應來提高脂肪移植的存活率[4]。

能否找尋一種經(jīng)濟、方便、有效的方法，一方面延緩或抑制移植的脂肪細胞凋亡，促進前脂肪細胞的分化，另一方面改善脂肪移植組織的性狀及供受區(qū)組織的環(huán)境，促進血管內皮細胞增殖，誘導新生血管形成，從而提高移植脂肪顆粒存活率，以便在臨床上能夠得到更為廣泛的應用呢？

近些年來，中藥對人體疾病的治療越來越受到了中外學者的重視，中藥的研究開展得越來越深入，許多中藥的藥理功效得到了較廣泛的認同。研究發(fā)現(xiàn)丹紅對心血管系統(tǒng)、血液循環(huán)系統(tǒng)、物質代謝、肝腎功能及腫瘤治療等均可發(fā)揮良好的作用，丹紅能夠擴張冠狀動脈，改善心臟功能，可使減少的血細胞數(shù)恢復正常，可以增加機體抗缺氧能力，可以保護細胞，延長細胞壽命[5]。鑒于國內外鮮有學者在中藥對自體脂肪移植存活率進行基礎及臨床應用研究，我們應用肌肉注射中藥丹紅注射液到自體脂肪移植的SD大鼠中，探討中藥丹紅對自體脂肪移植術后脂肪移植存活率的影響并分析可能的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑、儀器

SD大鼠(10周齡，雄鼠)，體重(265±5)g，購自山西醫(yī)科大學實驗動物中心；丹紅注射液(國藥準字:Z20026866)(Danhong Injection)，菏澤步長制藥有限公司生產(chǎn)，產(chǎn)品規(guī)格：10 ml/支。VEGF的ELISA試劑盒(美國R&D公司)；鼠多克?、蜃涌贵w(Rat Polycloal to Factor Ⅷ，英國Biorbyt公司)；鼠兔通用免疫組化二抗(丹麥Dako公司)；免疫組化抗體稀釋液(丹麥Dako公司)；鹽酸氯胺酮注射液(2 ml ∶0.1 mg)，福建古田藥業(yè)有限公司；陸眠寧Ⅱ注射液(1.5 ml ∶30 mg)，吉林省華牧動物保健品有限公司。圖像分析系統(tǒng)(IMAGE PROPLUS 6.0,美國)；CO2培養(yǎng)箱(THERMO FORMA3111,美國)；熒光光學顯微鏡(LEICA DM6000M,德國)；倒置相差顯微鏡(Nikon TS-100,日本)；酶標儀(Bio-Tek Synergy HT,美國)。

1.2 大鼠分組與處理

模型組 12只單純行自體脂肪顆粒移植；低劑量組24只行自體脂肪顆粒移植+肌肉注射丹紅注射液4 ml/(kg·d)(持續(xù)用藥2周)；高劑量組24只行自體脂肪顆粒移植+肌肉注射丹紅注射液8 ml/(kg·d)(持續(xù)用藥2周)。術后90 d進行脂肪移植體標本取材，稱量后置入4%多聚甲醛溶液中固定。術后1周、2周、4周、6周、8周分別尾靜脈取血，每只取血1 ml，取血后置入離心管中以1 500 r/min離心5 min，留取上層血清，-80 ℃保存，ELISA試劑盒檢測VEGF濃度。

1.3 大鼠自體脂肪移植存活率檢測

以自體移植脂肪組織術后與術前質量比計算存活率，完整取下脂肪移植體后分離修去周圍多余組織及包膜，精密天平準確測量其質量，與術前記錄數(shù)據(jù)進行對比得到移植存活率。

1.4 大鼠的血清VEGF表達水平檢測

首先配置沖洗緩沖液，底物溶液，擴增液，稀釋度標準品。移去96孔板中的多余板條，在剩余的96孔板中的每一孔中分別加入50 μl的稀釋劑。在第一列的孔中加入200 μl已準備好的標準品。其余的孔中分別加入200 μl待檢測的血清。4 ℃環(huán)境下孵育過夜。在96孔板的每孔中分別加入200 μl的VEGF，在室溫下避光孵育2 h。再次用洗板儀清洗96孔板4次。每孔中分別加入50 μl的底物溶液，放置于室溫下避光孵育45 min。每孔中分別加入50 μl的擴增溶液，室溫下避光孵育45 min。每孔中分別加入50 μl的中止液，吹打混勻。利用酶標儀在30 min內于450 nm下讀取吸光值，繪制標準曲線，得到VEGF含量。

1.5 移植脂肪組織的蘇木精-伊紅(HE)染色和血管內皮細胞Ⅷ因子的免疫組化染色

將標本置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，流水沖洗過夜。乙醇梯度脫水后，將標本置于透明二甲苯中浸泡,浸蠟后，進行包埋，切片機切片后用載玻片每個標本撈片5張。其中，2張用于蘇木精-伊紅染色，3張用于血管內皮細胞Ⅷ因子的免疫組化染色。蘇木精-伊紅(HE)染色，將切片烤干后，二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，蘇木精染色約8 min，鹽酸酒精分化，流水沖洗20 min。分化后鏡檢。伊紅染色：0.1%-0.5%伊紅染液染色1-2 min，70%乙醇5 s。 梯度酒精脫水，二甲苯透明1-2 min。 封片后貼標簽，編號，倒置顯微鏡觀察。血管內皮細胞Ⅷ因子的免疫組化染色 將石蠟切片烤干后，脫蠟、水化，用封閉通透液浸潤切片30 min(室溫避光)后，0.01 mol/L檸檬酸鈉緩沖溶液(pH 6.0)進行抗原修復暴露抗原決定簇，用山羊血清封閉非特異性蛋白 ，加一抗(1∶500)約50 μl，放入濕盒中置于4 ℃冰箱過夜。加二抗孵育和顯色 ，切片復染、脫水、透明、封片后倒置顯微鏡觀察。

1.6 SD大鼠自體脂肪移植組織內毛細血管密度計算

在100倍光鏡下觀察脂肪組織移植體血管內皮細胞Ⅷ因子免疫組化染色切片，在每張切片中分別隨機選取6個視野，周邊區(qū)及中心區(qū)各3個視野，統(tǒng)計每個視野中的毛細血管斷面數(shù)目(條)，計算血管斷面密度(均數(shù)±標準差，條/視野)。凡是免疫組化染色成棕黃色的單個內皮細胞或者內皮細胞團均作為一個微血管計算在內。

1.7 統(tǒng)計學分析

所有數(shù)據(jù)使用 SPSS13.0 軟件進行處理，計量資料以 表示，數(shù)據(jù)采用t檢驗或單因素方差分析進行檢驗，存活率比較采用卡方檢驗，雙側檢驗水準為α=0.05，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 大鼠自體脂肪移植組織塊觀察

脊椎皮下可見丘狀隆起的脂肪移植體，移植的脂肪組織無移位及擴散，在脂肪移植體部位觸及移植體，于其外周1 cm處切開皮膚，鄰近皮膚、皮下組織均未見明顯炎癥反應、組織壞死、空腔或膿腫形成，脂肪移植體均表現(xiàn)為質地略柔軟、邊界清晰、活動度良好的組織團塊，脂肪移植體呈暗黃色，外部被一層纖維組織包膜所覆蓋，界線比較明顯。

2.2 大鼠自體脂肪顆粒移植各實驗組間脂肪移植體存活率比較

結果表明，自體脂肪顆粒移植術后90 d，模型組脂肪移植存活率為(40.6±6.5)%，低劑量組脂肪移植存活率為(62.1±8.2)%，高劑量組脂肪移植存活率為(64.2±8.4)%。低劑量組和高劑量組脂肪移植存活率均明顯高于模型組(P<0.05)，低劑量組與高劑量組脂肪移植存活率無明顯差異(P>0.05)。

2.3 大鼠自體脂肪顆粒移植各實驗組間血清VEGF表達比較

結果表明：SD大鼠自體脂肪顆粒移植低劑量組和高劑量組血清VEGF表達水平在脂肪移植術后1，2，4，6周時，與模型組比較均有明顯增高(P<0.05)，在術后 2 周時達到高峰，低劑量組和高劑量組血清 VEGF 表達水平無顯著差異(P>0.05，見圖1)。

與模型組比較，*P<0.05圖1 大鼠自體脂肪顆粒移植各實驗組間血清VEGF表達比較Figure 1 Expression of VEGF in serum at different time after fat particle transplantation

2.4 大鼠自體脂肪移植組織HE染色

結果顯示：低劑量組和高劑量組自體脂肪移植90 d后均可見脂肪細胞增生，移植脂肪組織纖維間隔不多，脂肪小葉以及脂肪小葉間纖維組織保持較好，周圍血管較豐富，無論在脂肪移植體周邊區(qū)還是在中央?yún)^(qū)均可見到大量的前脂肪細胞和脂肪細胞，形態(tài)規(guī)則，脂肪細胞排列比較整齊，形態(tài)相近。實驗模型組移植脂肪組織中有較多的脂肪細胞壞死融合，形成了數(shù)量較多的大小不等的空泡，存活脂肪細胞大小不規(guī)則，分布不均勻，脂肪組織間纖維結締組織較多，并有分隔傾向，偶可見部分前脂肪細胞與大小不一的脂肪細胞夾雜在一起，血運不豐富，新生血管不明顯(見圖2)。

A.模型組 B.低劑量組 C.高劑量組圖2 自體脂肪顆粒移植90 d后自體移植脂肪組織的HE染色 (×100) Figure 2 Morphology of autotransplanted fat tissues at 90 d after fat particle transplantation by HE (×100)

2.5 SD大鼠自體脂肪移植組織血管內皮細胞Ⅷ因子免疫組織化學染色

血管內皮細胞Ⅷ因子免疫組化染色后，血管呈現(xiàn)棕黃色，低劑量組和高劑量組自體脂肪移植90 d后移脂肪組織周邊區(qū)和中心區(qū)血管均較豐富，但差別不明顯。模型組移植脂肪組織中血運不豐富，新生血管不明顯(見圖3)。

A.模型組 B.低劑量組 C.高劑量組圖3 SD大鼠自體脂肪顆粒移植90 d后自體移植脂肪組織的血管內皮細胞Ⅷ因子免疫組化染色結果 (×100) Figure 3 Immunohistochemical staining of vascular endothelial cells factor Ⅷ in autotransplanted fat tissues 90 d after fat particle transplantation (×100)

2.6 SD大鼠自體脂肪移植組織的毛細血管密度評估

通過光鏡下觀察，計算毛細血管數(shù)量，模型組移植脂肪組織的毛細血管密度為(14.10±2.83)條/HP，低劑量組移植脂肪組織的毛細血管密度為(24.85±3.27)條/HP，高劑量組移植脂肪組織的毛細血管密度為(25.76±3.42)條/HP。低劑量組和高劑量組毛細血管密度明顯高于模型組(P<0.05)，但低劑量組與高劑量組的毛細血管密度無明顯差異(P>0.05)。

3 討論

3.1 自體脂肪組織移植修復的相關實驗研究

自體脂肪組織移植修復軟組織缺損畸形距今已有上百年的歷史，與其他種類的人工合成充填材料、異體脂肪或異種脂肪相比較，自體脂肪組織具有來源豐富、取材簡便、操作簡單、充盈外觀好、無排異反應、組織相容性好、無明顯過敏反應等優(yōu)勢[6,7]，更加易于被患者所接受，從而倍受整形美容外科醫(yī)生的重視，可廣泛用于充填各種先天性軟組織缺損或后天性軟組織缺損，自體脂肪移植技術在整復外科領域治療軟組織缺損沿用已久[8]。但自體脂肪移植的存活率較低長久以來一直是自體脂肪移植的最大障礙，也一直是自體脂肪移植研究討論的重點和難點[9]，長期困擾著臨床醫(yī)師，并且極大地限制了自體顆粒脂肪移植在臨床上的廣泛及大面積應用。

較多國內外學者認識到加快脂肪移植組織的血供重建是提高脂肪顆粒移植存活率的關鍵因素。如果可以找到能夠顯著加速脂肪移植組織血供重建的一些藥物或細胞因子，在脂肪組織移植的過程中，使脂肪組織移植體的血供加快，脂肪組織內的缺血、缺氧、營養(yǎng)不足期縮短，成熟的脂肪細胞缺血壞死減少；同時又減少或延緩脂肪細胞的凋亡，促進前脂肪細胞吸收并合成脂質，促進前脂肪細胞反分化成為成熟的脂肪細胞，從而可以代償被吸收的脂肪組織，便可以明顯提高自體脂肪組織移植的成活率[10]。Langer等[11]利用活體免疫熒光顯微鏡進行觀察，結果發(fā)現(xiàn)脂肪組織移植后的血供主要依賴周圍的血管長入。國內學者杜學亮等[12]通過免疫組化方法研究脂肪組織內微血管的分布，應用免疫組化方法顯示微血管，對不同的時期脂肪組織移植塊按中央?yún)^(qū)和周邊區(qū)劃分，進行了微血管的定量統(tǒng)計研究，發(fā)現(xiàn)脂肪組織移植體周邊區(qū)的血管密度在移植后的14 d達到高峰；中央?yún)^(qū)的血管密度呈逐漸增高趨勢，在同一時期脂肪組織移植體周邊區(qū)的血管密度要高于中央?yún)^(qū)的血管密度，脂肪組織移植塊周邊區(qū)的血管密度明顯高于中央?yún)^(qū)的血管密度。證明了新生血管在脂肪移植組織的血運重建過程中，作為供血的主要渠道，其生長的快慢程度以及數(shù)量對脂肪移植體顯得尤為重要。移植體與受床建立良好的血運是脂肪移植組織存活的關鍵。血運的建立一方面依靠從受床向移植體長入新生血管，另一方面通過新生血管與原有血管吻合溝通。可見，改善血液循環(huán)是提高移植脂肪存活率的有效途徑。由于血管新生是由細胞因子啟動的調控過程，目前最常用的方法是將促血管生長因子應用到局部。血管內皮生長因子(VEGF)在血管形成的過程中發(fā)揮著最重要的作用，血管內皮生長因子是最早被發(fā)現(xiàn)的能夠促進血管生長的生長因子，也是目前發(fā)現(xiàn)的效果最強的促血管生成因子。CM-Dil標記的血管內皮前體細胞復合游離脂肪移植，顯示了較高的脂肪存活率和新生毛細血管密度[13,14]，局部的血管內皮生長因子能提高游離移植脂肪的存活率和質量[15]。Lei等[16]在SD大鼠自體顆粒脂肪移植的部位注射含有編碼重組人血管內皮生長因子(recombinant human vascular endothelial growth factor，rhVEGF)DNA的脂質體質粒，分別在術后3，7，15，30 d取出移植物，測量質量并對移植物進行組織學評價以及微血管計數(shù)。結果顯示，術后15 d和30 d，rhVEGF試驗組的微血管計數(shù)均遠遠高于模型組，脂肪移植體吸收率較低。所以本次實驗通過檢測藥物作用和非藥物作用的模型鼠血液中VEGF的表達，移植脂肪組織中血管密度，來對藥物作用進行判斷。結果顯示低劑量組和高劑量組血管密度均高于模型組，而且VEGF表達也明顯高于模型組。

3.2 SD大鼠自體脂肪顆粒移植動物模型

脂肪顆粒移植動物模型多采用SD大鼠或裸鼠[17-19]。即通過手術切取大鼠自體脂肪組織，然后通過脂肪顆粒注射技術將自體脂肪顆粒移植于大鼠背部皮下；或者通過脂肪抽吸技術獲得人的脂肪顆粒，然后采用脂肪注射技術將脂肪顆粒移植在裸鼠背部皮下。大鼠自體脂肪組織取材的部位多以腹股溝區(qū)域脂肪墊為常見[20]。在自體脂肪移植術后取材的時間選擇上，多數(shù)實驗研究將時間選擇在3-6個月之間。在脂肪移植術后的3個月內，脂肪組織的吸收一般比較嚴重，而移植脂肪組織的量通常在脂肪移植術后3個月后保持穩(wěn)定。因此，本次實驗選擇在自體脂肪移植術后的90 d進行取材，這樣可以更加準確地反映移植脂肪組織真實的吸收率、存活率，貼近臨床應用，與臨床實際觀察結果保持一致。

3.3 丹紅對自體脂肪顆粒移植的影響

近些年來，中藥對人體疾病的治療越來越受到了中外學者的重視，中藥的研究開展得越來越深入，許多中藥的藥理功效得到了較廣泛的認同。臨床治療氣虛血瘀的病證，常配伍使用丹紅，通過益氣而達活血之效?，F(xiàn)代藥理學研究證明，丹紅對心血管系統(tǒng)、血液循環(huán)系統(tǒng)、物質代謝、肝腎功能及腫瘤治療等均可發(fā)揮良好的作用，丹紅能夠擴張冠狀動脈，改善心臟功能，可使減少的血細胞數(shù)恢復正常，可以增加機體抗缺氧能力，可以保護細胞，延長細胞壽命[20]。

基于丹紅較為明確的藥理機制和藥物效果，本研究將丹紅應用在提高自體脂肪顆粒移植存活率的研究中，結果顯示丹紅注射液能顯著提高SD大鼠自體脂肪顆粒移植的存活率。本實驗僅對丹紅注射液提高自體脂肪移植存活率做了定性研究，丹紅在自體脂肪移植術后的最佳給藥方式、最佳劑量范圍以及最佳用藥頻率、持續(xù)時間等定量結果尚不清楚，在本實驗的基礎上，丹紅是否還能夠更好地提高自體脂肪組織移植的存活率？丹紅與其他中藥如當歸等的配伍方能否更加有利于提高自體脂肪移植組織的存活率？這些問題均有待于今后更進一步的研究探討，使該方法能夠更好地應用于臨床，增加脂肪移植組織的存活率，提高自體脂肪移植修復技術的成功率。

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Influence of Danhong injection on the survival rate of fat particle auto-transplantation in rats

JIA Yao1, WANG Peng1,2, CHEN Xihang1,2, WU Chengxing3*

(1DepartmentofPlasticSurgery,FirstHospitalofShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001，China;2FirstClinicalMedicalCollegeofShanxiMedicalUniversity;3PlasticSurgery,ShanxiDayiHospital;*Correspondingauthor,E-mail:591292983@qq.com)

ObjectiveTo investigate the influence of Danhong injection on the survival rate of fat particle auto-transplantation.MethodsAutologous fat particle transplantation rat model was established，and then divided into three groups:model group, low dose group and high dose group. The rat were given different doses of astragalus membranaceus injection by intramuscular injection in experiment groups and nothing in control group. The expression level of VEGF in blood serum was detected. Fat grafts were collected 90 d after the autologous fat transplantation to calculate the survival rate. The adipocyte morphology and density of blood vessels of the fat transplant were observed by HE staining. Immunohistochemical staining of vascular endothelial cells factor Ⅷ was used to observe the capillary growth and density.ResultsAt 90 d after the fat particle transplantation, the survival rates of fat transplant in experiment groups were higher than that in control group(P<0.05). ELISA showed the levels of VEGF expression in experimental groups were higher than that in control group(P<0.05). HE staining showed the number, the shape, the degree of fat transplant fibrosis were better in experimental groups than that in control group. Immunohistochemical staining of vascular endothelial cells factor Ⅷshowed newborn microvessel densities in experimental groups were higher than in control group.ConclusionDanhong injection can significantly promote the survival rate of autologous fat particle transplant in SD rats.

autologous fat transplantation； Danhong injection； vascular endothelial growth factor； angiogenesis； survival rate; rats

山西醫(yī)科大學第一醫(yī)院院青年基金資助項目(YQ1313);山西醫(yī)科大學校青年基金資助項目(02201311)

賈垚,女，1983-01生，碩士，主治醫(yī)師，E-mail：591292983@qq.com

2016-08-12

R622.9

A

1007-6611(2016)11-0982-06

10.13753/j.issn.1007-6611.2016.11.005