吳多虎， 鮑傳裕， 李龍鶴， 鄒永平， 袁 巍， 王德森， 謝晉元， 宮曉光

(海南省人民醫(yī)院急診科，海口 570311; *通訊作者，E-mail: wdhhx@126.com)

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綠原酸對(duì)大鼠阻塞性黃疸導(dǎo)致的肝纖維化的治療作用

吳多虎， 鮑傳裕， 李龍鶴， 鄒永平， 袁 巍， 王德森， 謝晉元， 宮曉光*

(海南省人民醫(yī)院急診科，?？?570311;*通訊作者，E-mail: wdhhx@126.com)

目的 探索綠原酸(CA)對(duì)阻塞性黃疸導(dǎo)致的肝纖維化模型大鼠治療作用及其作用機(jī)制。 方法 Wistar大鼠行膽總管結(jié)扎手術(shù)復(fù)制阻塞性黃疸肝纖維化模型，隨機(jī)分為模型組、水飛薊賓組(Sil，50 mg/kg)、綠原酸低、中和高劑量組(37.5，75，150 mg/kg)，同時(shí)設(shè)假手術(shù)對(duì)照組。除模型組和對(duì)照組外，其他各組大鼠均按10 ml/kg體重灌胃相應(yīng)劑量藥物，持續(xù)4周。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后計(jì)算肝臟指數(shù)，HE觀察肝臟損傷及Masson觀察纖維化程度，RT-PCR技術(shù)檢測(cè)肝臟Ⅰ和Ⅲ型膠原、VEGF、TGF-β1的mRNA水平，免疫印跡法檢測(cè)α-SMA蛋白的表達(dá)水平。 結(jié)果 膽總管結(jié)扎術(shù)誘導(dǎo)模型大鼠肝臟指數(shù)明顯增加，肝組織出現(xiàn)明顯病理改變，并伴有纖維化發(fā)生；與模型組相比，綠原酸中高劑量組肝臟指數(shù)明顯降低，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少，肝小葉結(jié)構(gòu)破壞緩解，同時(shí)Ⅰ、Collagen Ⅲ、TGF-β1、VEGF mRNA水平，α-SMA蛋白的表達(dá)顯著降低(P<0.05)。 結(jié)論 綠原酸在可通過抑制TGF-β1、VEGF和α-SMA的表達(dá)從而降低膽總管結(jié)扎誘導(dǎo)的肝纖維化病變的風(fēng)險(xiǎn)。

綠原酸； 阻塞性黃疸； 肝纖維化

膽總管結(jié)扎手術(shù)是制備肝纖維化動(dòng)物模型的方法之一，該模型在評(píng)估藥物對(duì)肝臟的潛在保護(hù)作用研究方面具有重要的意義[1]。肝纖維化發(fā)生與肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSC)的活化密不可分，活化的HSC可過量表達(dá)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)，誘導(dǎo)大量細(xì)胞外基質(zhì)如膠原等沉積，從而導(dǎo)致肝纖維化[2]。綠原酸(chlorogenic acid，CA)是植物在有氧呼吸過程中產(chǎn)生的一類苯丙類化合物，屬于酚類抗氧化劑。大量文獻(xiàn)報(bào)道，綠原酸對(duì)四氯化碳(CCl4)導(dǎo)致的肝損傷和肝纖維化有明顯的抑制作用，高劑量的綠原酸治療效果最明顯[3,4]。在大鼠阻塞性黃疸導(dǎo)致的肝纖維化研究中發(fā)現(xiàn)，綠原酸在阻塞性黃疸早、中期可促進(jìn)HSC凋亡，抑制纖維化肝組織膠原的產(chǎn)生與沉積減輕肝纖維化，降低肝臟損傷程度[5]。另外，綠原酸還能有效地保護(hù)對(duì)脂多糖誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷[6]。最近的一項(xiàng)研究表明，綠原酸對(duì)治療乙酰氨基酚引起的小鼠肝損傷有明顯的解毒作用[7]。

本實(shí)驗(yàn)通過建立阻塞性黃疸大鼠模型，應(yīng)用不同劑量的綠原酸進(jìn)行干預(yù)，檢測(cè)大鼠肝纖維化程度、纖維化相關(guān)因子mRNA水平，旨在研究綠原酸對(duì)大鼠肝纖維化的治療效果及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)Wistar大鼠，雌雄各半，體重(250±15)g，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供，合格證號(hào)SCXK(京)2004-0004。飼養(yǎng)在室溫(22±2)℃、相對(duì)濕度55%±5%的動(dòng)物房，明暗交替各12 h。

1.2 藥物和主要試劑

綠原酸，純度>99%，美國(guó)Sigma公司提供。水飛薊賓(Silibinin，Sil)由天津天士力制藥股份有限公司提供。三磷酸脫氧核苷(dNTP)混合液、逆轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV)、DNA聚合酶(Taq)由寶生物工程有限公司提供；寡核苷酸引物Oligo(dT)16、PCR擴(kuò)增引物由美國(guó)Invitrogen公司合成。兔抗α-SMA、羊抗β-actin、α-SMA-鼠抗兔IgG和β-actin-兔抗羊IgG均由美國(guó)Sigma公司提供。

1.3 阻塞性黃疸大鼠模型的建立

術(shù)前禁食12 h，腹腔內(nèi)注射10%水合氯醛(350 mg/kg)，深度麻醉后，取上腹部正中直切口，長(zhǎng)約2 cm，逐層進(jìn)腹，暴露十二指腸。找到膽總管和十二指腸，靠近十二指腸處用絲線兩端結(jié)扎，依次關(guān)腹。對(duì)照組僅游離膽總管不予結(jié)扎，其他各組均采用膽總管結(jié)扎的方法。膽總管結(jié)扎第4周后，運(yùn)用病理組織學(xué)方法檢測(cè)模型組，肝纖維化程度為100%，視為建模成功。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理

模型大鼠隨機(jī)分為模型組(n=12)、綠原酸低、中、高劑量組(37.5，75，150 mg/kg，各組n=11)、Sil組(50 mg/kg，n=11)，同時(shí)設(shè)置假手術(shù)對(duì)照組(n=10)。除對(duì)照組和模型組大鼠灌胃蒸餾水外，綠原酸低、中、高劑量組和Sli組給予不同劑量的相應(yīng)藥物，灌胃體積按10 ml/kg體重計(jì)算，每日一次，持續(xù)4周。

1.5 肝臟指數(shù)檢測(cè)

末次給藥后2 h，大鼠腹腔注射10%水合氯醛(350 mg/kg)麻醉，仰臥位摘取全部肝臟，稱取肝臟濕重。按照公式：肝臟指數(shù)=肝臟質(zhì)量/體重×100%，計(jì)算每組大鼠的肝臟指數(shù)。

1.6 肝臟組織病理學(xué)觀察

取大鼠肝臟大葉同一部分組織，用多聚甲醛溶液固定，常規(guī)脫水、透化、石蠟包埋，連續(xù)切片，片厚約5 μm，經(jīng)脫蠟復(fù)水后。分別用HE染色和Masson染色，光學(xué)顯微鏡觀察病理變化。

1.7 RT-PCR檢測(cè)

利用Trizol試劑提取肝組織細(xì)胞的總RNA。將1 μl提取的總RNA(1 μg/μl)和1.0 μl Oligo(dT)16溶于6.0 μl DEPC的滅菌雙蒸水中，制備模板RNA。取模板RNA6 μl加入到反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中，內(nèi)含5×M-MLV buffer 2 μl、dNTP Mixture(各10 μmol/L)0.5 μl、RNase inhibitor(40 U/μl)0.25 μl、RTase M-MLV，即RNase H-(200 U/μl)0.5 μl和RNase free dH2O 10 μl。42 ℃保溫1 h，70 ℃保溫15 min，冰上冷卻，得到的cDNA溶液直接用于PCR。利用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計(jì)Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、TGF-β1、VEGF 基因PCR擴(kuò)增引物，并同時(shí)設(shè)計(jì)內(nèi)參GAPDH基因擴(kuò)增引物，引物序列見表1。用1.5%瓊脂凝膠電泳檢測(cè)Collagen Ⅰ，Collagen Ⅲ，TGF-β1和VEGF的mRNA表達(dá)水平，并采用Gle-pro分析系統(tǒng)對(duì)DNA條帶進(jìn)行半定量分析。目的基因與內(nèi)參mRNA的比值表示目的基因的mRNA表達(dá)情況。

表1 目標(biāo)基因和內(nèi)參基因的引物序列

Table 1 Primer sequences of target genes and internal gene

基因名稱引物序列VEGFFP:5'-CTGCTGTACCTCCACCAT-3'RP:5'-ACAGGACGGCTTGAAGAT-3'TGF-β1FP:5'-GCAACAACGCCATCTATG-3'RP:5'-CAAGGTAACGCCAGGAAT-3'CollagenⅠFP:5'-CAGAGTGGAAGAGCGATTA-3'RP:5'-CAAGGACAGTGTAGGTGAA-3'CollagenⅢFP:5'-GTCCACAGCCTTCTACAC-3'RP:5'-TTCCTGACTCTCCATCCTT-3'GAPDHFP:5'-TCTCCTGCGACTTCAACA-3'RP:5'-TGTAGCCGTATTCATTGTCA-3'

1.8 α-SMA蛋白印跡分析

取肝組織加入含50 mmol/L Trise-HCl(pH 7.5)、150 mmol/L氯化鈉、1%NP-40、1 mmol/L EDTA、1 mmol/L EGTA和1 mmol/L PMSF的裂解液，冰上裂解10 min，15 000 r/min，4 ℃離心10 min，取上清液。SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)膜，3%BSA封閉，兔抗α-SMA(1∶1 000)和羊抗β-actin(1∶1 000)4 ℃過夜，二抗α-SMA-鼠抗兔IgG(1∶5 000)；β-actin-兔抗羊IgG(1∶5 000)室溫孵育1 h。通過光密度定量分析α-SMA蛋白譜帶的相對(duì)強(qiáng)度。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 肝臟指數(shù)檢測(cè)結(jié)果

與對(duì)照組比較,模型組大鼠肝臟指數(shù)顯著升高(P<0.001)；低劑量綠原酸組(37.5 mg/kg)大鼠肝臟指數(shù)組與模型組比較無明顯差異(P>0.05)，而中、高綠原酸劑量及水飛薊賓可以明顯降低肝臟指數(shù)(P<0.01，見圖1)。

2.2 肝組織病理學(xué)變化

對(duì)照組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝索排列整齊，以中央靜脈為中心呈放射狀，肝細(xì)胞正常，匯管區(qū)無炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肝血竇正常無充血(見圖2)；模型組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂不清，肝索解離，可見匯管區(qū)炎細(xì)胞浸潤(rùn)逐漸加重(見圖2)，提示梗阻性黃疸肝損傷模型建立成功。綠原酸給藥組大鼠肝組織浸潤(rùn)炎癥細(xì)胞減少，肝小葉結(jié)構(gòu)破壞現(xiàn)象緩解，尤其以高劑量組最為明顯(見圖2)。

A.對(duì)照組；B.模型組；C.CA 37.5 mg/kg組；D.CA 75 mg/kg組；E.CA 150 mg/kg組；F.水飛薊賓組;與對(duì)照組比較，#P<0.001；與模型組比較，**P<0.01圖1 綠原酸對(duì)膽總管結(jié)扎手術(shù)模型大鼠肝臟指數(shù)的影響Figure 1 Effect of chlorogenic acid(CA) on liver index in bile duct ligation-induced rats

A.對(duì)照組；B.模型組；C.CA37.5 mg/kg組；D.CA75 mg/kg組；E.CA150 mg/kg組；F.水飛薊賓組圖2 綠原酸對(duì)膽總管結(jié)扎手術(shù)模型大鼠肝臟形態(tài)學(xué)的影響 (×100)Figure 2 Effects of chlorogenic acid(CA) on liver histological changes of bile duct ligation-induced rats (×100)

2.3 肝纖維化評(píng)價(jià)

對(duì)照組大鼠肝臟無明顯纖維化結(jié)構(gòu)；模型組大鼠具有明顯的纖維化橋接，大量的膠原沉積物環(huán)繞在匯管區(qū)，纖維化區(qū)域蔓延連接并將肝臟分為大量單獨(dú)的假小葉；隨著綠原酸劑量的增加，纖維化程度明顯改善(見圖3)。

2.4 肝組織中纖維化相關(guān)因子表達(dá)分析

肝纖維化相關(guān)因子Ⅰ型和Ⅲ型膠原、TGF-β1及VEGF基因在正常大鼠肝組織中處于低表達(dá)水平，而膽總管結(jié)扎模型大鼠各因子基因均明顯上調(diào)；而各治療組纖維化相關(guān)因子均出現(xiàn)不同程度下調(diào)，尤其以150 mg/kg綠原酸組降低最為顯著(P<0.05, 見圖2)。

2.5 肝組織中α-SMA表達(dá)分析

正常大鼠肝組織中α-SMA蛋白處于低表達(dá)水平，而膽總管結(jié)扎模型大鼠肝組織α-SMA表達(dá)顯著增加(P<0.001)；各治療組大鼠肝組織α-SMA表達(dá)均不同程度降低，綠原酸可劑量依賴性降低其表達(dá)，尤其以高劑量(150 mg/kg)降低最為顯著(P<0.01，見圖5)。

A.對(duì)照組；B.模型組；C.CA 37.5 mg/kg組；D.CA 75 mg/kg組；E.CA 150 mg/kg組；F. 水飛薊賓組圖3 綠原酸對(duì)膽總管結(jié)扎手術(shù)模型大鼠肝纖維化的影響 (×100)Figure 3 Effects of chlorogenic acid(CA) on liver fibrosis of bile duct ligation-induced rats (×100)

與對(duì)照組比較，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05圖4 綠原酸對(duì)膽總管結(jié)扎模型大鼠肝臟Ⅰ和Ⅲ型膠原、TGF-β1及VEGF基因表達(dá)影響Figure 4 Effects of chlorogenic acid(CA) on collagen Ⅰ,collagen Ⅲ,TGF-β1, and VEGF mRNA in the liver of BDL rats

3 討論

本研究表明綠原酸能對(duì)膽總管結(jié)扎導(dǎo)致的肝纖

與對(duì)照組比較，#P<0.001；與模型組比較，**P<0.01圖5 綠原酸對(duì)膽總管結(jié)扎模型大鼠肝臟α-SMA蛋白表達(dá)的影響Figure 5 Effects of chlorogenic acid(CA) on α-SMA protein expression in the liver of BDL rats

維化大鼠模型具有保護(hù)作用。中劑量和高劑量綠原酸可顯著降低大鼠肝臟指數(shù)，提示綠原酸可緩解膽總管結(jié)扎導(dǎo)致引發(fā)的肝腫大。HE染色和Masson染色病理結(jié)果顯示，綠原酸可顯著抑制肝臟內(nèi)炎癥反應(yīng)和纖維化程度。低劑量的綠原酸(37.5 mg/kg)對(duì)治療肝纖維化效果不明顯，而高劑量的綠原酸(75-150 mg/kg劑量范圍)可顯著改善肝纖維化程度。這與高劑量的綠原酸(70-140 mg/kg劑量范圍)對(duì)四氯化碳(CCl4)導(dǎo)致的肝纖維化有明顯的抑制作用相一致[8]。此外，本研究表明高劑量綠原酸能導(dǎo)致α-SMA蛋白表達(dá)降低。α-SMA蛋白的表達(dá)是HSC激活的標(biāo)志，活化的HSC高表達(dá)α-SMA與其自身獲得收縮能力有關(guān)[9]。抑制α-SMA蛋白的表達(dá)可直接或間接抑制HSC的激活或誘導(dǎo)其凋亡，進(jìn)而抑制肝纖維化發(fā)展[10]。已有文獻(xiàn)報(bào)道，活化的HSC細(xì)胞凋亡與肝纖維化的緩解有關(guān)[11]。肝損傷后能激活枯否細(xì)胞(Kupffer cell，KC)分泌TGF-β等細(xì)胞因子，活化HSC細(xì)胞，使HSC細(xì)胞增殖，轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維細(xì)胞，并且合成大量的Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原和纖維連接蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)成分，導(dǎo)致肝纖維化[12,13]。1998年Schuppan等[14]曾報(bào)道，TGF-β抗體靜脈注射治療結(jié)扎膽總管造成的大鼠肝纖維化獲得較好的效果。TGF-β被眾多的研究認(rèn)為是最主要的致肝纖維化介質(zhì)，TGF-β能刺激Ⅰ、Ⅲ型膠原纖維連接蛋白的合成[15,16]。在本實(shí)驗(yàn)中，綠原酸治療組的Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、TGF-β1、VEGF基因的表達(dá)低于模型組，表明綠原酸能夠改善肝纖維化程度，其作用機(jī)制可能與綠原酸能夠抑制肝纖維化相關(guān)因子表達(dá)有關(guān)。

綠原酸可以促進(jìn)HSC細(xì)胞的凋亡，抑制纖維化肝組織膠原的產(chǎn)生與沉積減輕肝纖維化，降低肝臟損傷程度。促進(jìn)活化的HSC細(xì)胞的凋亡一直被認(rèn)為是治療肝纖維化的有效措施[17]。細(xì)胞凋亡的發(fā)生是由基因調(diào)控的，Bax和Bcl-2以及Bcl-xl和Bcl-xs是兩對(duì)能促進(jìn)和抑制細(xì)胞凋亡的代表基因[18]。Novo等[19]的研究認(rèn)為肝組織中Bax/Bcl-2比值決定著 HSC凋亡的調(diào)控方向，當(dāng)Bax/Bcl-2 比值較高(>23/29)時(shí)，誘導(dǎo)HSC凋亡；比值較低(<23/29)時(shí)，HSC的凋亡受到抑制。因此，下一步應(yīng)探究在阻塞性黃疸大鼠中，綠原酸是否影響這些基因的表達(dá)從而影響HSC細(xì)胞的凋亡。

本研究結(jié)果表明綠原酸能抑制總膽管結(jié)扎引起的肝損傷，盡管尚未完全明確其作用機(jī)制，但該研究表明綠原酸能通過抑制TGF-β1、VEGF和α-SMA的表達(dá)從而改善肝纖維化。因此，綠原酸可作為治療肝纖維化的潛在藥物。

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Effects of chlorogenic acid on hepatic fibrosis in the rats with obstructive jaundice

WU Duohu, BAO Chuanyu, LI Longhe, ZOU Yongping, YUAN Wei, WANG Desen, XIE Jinyuan, GONG Xiaoguang*

(DepartmentofEmergency,HainanGeneralHospital,Haikou570311，China;*Correspondingauthor,E-mail:wdhhx@126.com)

ObjectiveTo explore the protective effects of chlorogenic acid(CA) on hepatic fibrosis in rats with obstructive jaundice.MethodsA total of 66 rats were randomly divided into sham group, model group, silibinin group, low, moderate and high CA groups. The hepatic fibrosis models were established by bile duct ligation(BDL). The rats in silibinin group were treated with 50 mg/kg silibinin and the rats in CA groups were treated with 37.5, 75 mg/kg and 150 mg/kg CA for 4 weeks, respectively. In order to assess the effect of CA on liver damage and fibrosis, the liver index, HE and Masson staining were observed. Moreover, the mRNA levels of collagen Ⅰ, Ⅲ, VEGF and TGF-β1 were detected by RT-PCR, and the level of α-SMA was detected by Western blot.ResultsThe liver index in model group increased highly compared to sham group(P<0.001), and there was obvious pathological changes in liver tissues and hepatic fibrosis. The liver index in moderate and high dose groups significantly deceased compared to model group(P<0.01), and the inflammatory cell infiltration and the damage of lobuli hepatic was reduced. The expression of collagen Ⅰ, collagen Ⅲ, VEGF and TGF-β1 mRNA, and α-SMA protein were decreased in high dose group(P<0.01).ConclusionThe results suggest that CA may exhibit a therapeutic potential for liver fibrosis by inhibiting the production of TGF-β1, VEGF and α-SMA.

chlorogenic acid; hepatic fibrosis; collagen Ⅰ

2014年海南省應(yīng)用技術(shù)研發(fā)與示范推廣專項(xiàng)(ZDXM2014066)

吳多虎,男，1972-12生，本科，副主任醫(yī)師

2016-07-06

R575

A

1007-6611(2016)11-0963-05

10.13753/j.issn.1007-6611.2016.11.001