雷 星， 陳 碩， 單 濤*

(1延安大學(xué)附屬醫(yī)院普外科，延安 716000； 2西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院普通外科； *通訊作者，E-mail:shantao820304@163.com)

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結(jié)直腸癌中AQP3的表達(dá)及其與臨床預(yù)后的關(guān)系

雷 星1， 陳 碩2， 單 濤2*

(1延安大學(xué)附屬醫(yī)院普外科，延安 716000；2西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院普通外科；*通訊作者，E-mail:shantao820304@163.com)

目的 探討水通道蛋白-3(AQP3)的表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理及預(yù)后關(guān)系。 方法 收集術(shù)前未予化療治療的臨床病例資料齊全的原發(fā)性結(jié)直腸癌病例，取癌組織、癌旁組織、正常組織各40例，采用免疫組化法檢測(cè)AQP3的表達(dá)。比較AQP3表達(dá)與年齡、腫瘤大小、臨床分期、腫瘤部位、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理類型之間的關(guān)系，并結(jié)合隨訪資料分析AQP3表達(dá)與否和預(yù)后的關(guān)系。 結(jié)果 40個(gè)腫瘤標(biāo)本中，11例(27.5%)AQP3高表達(dá)，28例(70.0%)中度表達(dá)，1例(2.5%)無(wú)AQP3染色。癌旁和正常組織中AQP3陽(yáng)性表達(dá)分別為4例(10.0%)和2例(5.0%)。AQP3的表達(dá)還與TNM分期(P=0.007)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.009)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(P=0.000)成正相關(guān)。在不同年齡、性別、組織學(xué)分級(jí)和腫瘤大小中AQP3表達(dá)沒(méi)有顯著性差異(P>0.05)。除此之外，AQP3陰性組比陽(yáng)性組明顯具有生存優(yōu)勢(shì)。 結(jié)論 AQP3可能是預(yù)測(cè)結(jié)直腸癌預(yù)后的良好指標(biāo)。

結(jié)直腸癌； 水通道蛋白3(AQP3)； 預(yù)后； 免疫組化

結(jié)腸癌是常見的惡性腫瘤之一，近年來(lái)由于診治技術(shù)的提高，使得結(jié)腸癌的早期診斷治療有了顯著的提高，盡管在診斷和治療中取得一定進(jìn)展，但結(jié)直腸癌仍嚴(yán)重影響生命健康[2]。因此，尋找干預(yù)治療的新靶向非常重要。

近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明，腫瘤的生長(zhǎng)、進(jìn)展、侵襲和轉(zhuǎn)移依賴于腫瘤微環(huán)境和腫瘤代謝[3]。水分子在腫瘤的進(jìn)展中發(fā)揮顯著的作用，這一認(rèn)識(shí)對(duì)于制定抗腫瘤治療方案非常重要[4]。水通道蛋白是具有分泌和吸收功能的上皮細(xì)胞運(yùn)輸水的一類水膜通道，某些亞型也參與其他分子的運(yùn)輸，如甘油和尿素。目前，在哺乳動(dòng)物中有13種AQP成員，其中，AQP0、AQP1、AQP2、AQP4、AQP5、AQP6、AQP8主要是水選擇性，而AQP3、AQP7、AQP9、AQP10、AQP11、AQP12也可以輸送甘油和其他小分子溶質(zhì)[5]。AQPs基于其特定的組織定位在幾種類型腫瘤中表達(dá)有所不同，AQP1的表達(dá)通常與腦腫瘤相關(guān)[6]。王璐等[7]研究發(fā)現(xiàn)AQP3表達(dá)與皮膚鱗狀細(xì)胞癌的分化程度相關(guān)，在AQP3敲除小鼠的研究中，AQP3基因缺失延緩致癌物誘導(dǎo)皮膚腫瘤形成。通過(guò)AQP3進(jìn)行的甘油轉(zhuǎn)運(yùn)有助于細(xì)胞增殖和腫瘤發(fā)生中ATP(adenosine triphosphate)的生成[8]。AQP5可能參與細(xì)胞增殖而廣泛過(guò)表達(dá)于胰腺癌中[9]。

AQP3在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)與腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)，這表明，AQP3過(guò)表達(dá)在腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮一定作用。然而，AQP3在結(jié)直腸癌中的表達(dá)和臨床意義尚未完全闡明。為了評(píng)估AQP3作為結(jié)直腸癌的一種新型預(yù)后標(biāo)志物的潛力，我們使用免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)直腸癌臨床樣本中AQP3的表達(dá)，進(jìn)一步分析AQP3的表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

選取延安大學(xué)附屬醫(yī)院普外科2014-08～2016-05的40例結(jié)直腸癌患者(結(jié)腸20例，直腸20例)的腫瘤組織，40 ml/L的福爾馬林固定。其中，男性20例，女性20例，手術(shù)時(shí)的年齡范圍35-74歲(中位年齡為56.4歲)。樣本的組織學(xué)類型均為結(jié)直腸腺癌，腫瘤分期和組織學(xué)分級(jí)均根據(jù)國(guó)際抗癌協(xié)會(huì)的分類記錄。40例標(biāo)本中，Ⅰ期3例、Ⅱ期11例、Ⅲ期22例、Ⅳ期4例。病理分級(jí)如下：5例Ⅰ級(jí)、20例Ⅱ級(jí)、15例Ⅲ級(jí)。對(duì)所有的患者進(jìn)行隨訪，隨訪中位時(shí)間為14個(gè)月(3-36個(gè)月)。所有的研究均由延安大學(xué)人體試驗(yàn)委員會(huì)批準(zhǔn)，受試人員均簽署由中國(guó)延安大學(xué)人體試驗(yàn)委員會(huì)倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)的知情同意書。

1.2 免疫組化

檢測(cè)AQP3蛋白的免疫組化采用標(biāo)準(zhǔn)化的鏈霉親和過(guò)氧化物酶的方法，組織切片(4 μm)在適當(dāng)濃度的一抗中孵育過(guò)夜，次日，切片在生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG中孵育30 min，隨后在過(guò)氧化酶標(biāo)記的鏈霉親和素室溫孵育20 min。用0.02%的3,3′-二氨基聯(lián)苯胺在50 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.6)中染色5-7 min，經(jīng)蘇木精復(fù)染、水沖洗、脫水、清除，封片。免疫染色的陰性對(duì)照用非免疫山羊或兔血清替代一抗，顯微鏡觀察，抗AQP3和β-actin抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz生物公司。

1.3 結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)

使用DA KO Hercept Test 評(píng)分方法:(-),無(wú)細(xì)胞染色或少于30%的腫瘤細(xì)胞細(xì)胞膜(漿)較弱染色；(+),大于30%的腫瘤細(xì)胞細(xì)胞膜(漿)部分較弱染色；(++),大于30%的腫瘤細(xì)胞細(xì)胞膜(漿)完全較弱到中等染色；(+++)大于30%的腫瘤細(xì)胞細(xì)胞膜完全強(qiáng)染色。(-)和(+)的判為AQP3表達(dá)陰性，而評(píng)分為(++)和(+++)的判為AQP3表達(dá)陽(yáng)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用χ2檢驗(yàn)或雙側(cè)Fisher精確檢驗(yàn)分析方法。采用Kaplan-Meier計(jì)算生存率、Log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行差異性檢驗(yàn)。選擇有顯著性差異的因素逐步建立Cox多元比例風(fēng)險(xiǎn)模型，以確定其預(yù)后價(jià)值。P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，所有的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS13(SPSS,Chicago)軟件。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌中AQP3蛋白的表達(dá)

為確定AQP3在結(jié)直腸癌中的表達(dá)狀態(tài)，首先用免疫組化評(píng)估結(jié)直腸癌患者的腫瘤標(biāo)本、癌旁組織和正常組織。研究結(jié)果顯示AQP3在病例組中11例(27.5%)強(qiáng)表達(dá)，28例(70.0%)中度表達(dá)，僅偶爾在癌旁組織[4(10.0%)]和正常組織[1(5.0%)]中檢測(cè)到(見圖1)。

A.正常結(jié)直腸組織 B.癌旁組織 C.結(jié)直腸癌組織圖1 結(jié)直腸癌、癌旁和正常組織間質(zhì)中AQP3的表達(dá)水平 (×400) Figure 1 AQP3 expression in colorectal cancer by immunohistochemistry staining (×400)

2.2 AQP3表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系

AQP3在Ⅰ-Ⅱ期病例中的表達(dá)水平顯著低于在Ⅲ期和Ⅳ期中的表達(dá)水平(P=0.007)；在有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.009)和有無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(P=0.000)間AQP3表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；AQP3表達(dá)在不同年齡(P=0.900)、不同性別(P=0.830)、不同組織學(xué)分級(jí)(P=0.954)和不同腫瘤大小(P=0.161)間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見表1)。

表1 結(jié)直腸癌組織中AQP3表達(dá)與臨床病理因素關(guān)系 例(%)

Table 1 Association between AQP3 protein expression and clinicopathological factors in pancreatic cancers cases(%)

臨床特征nAQP3評(píng)分2分1分0分P例數(shù)4011(27.5)28(70.0)1(2.5)年齡(歲)0.900 >60267(26.9)18(69.2)1(3.8) ≤60144(28.6)10(71.4)0(0.0)性別0.830 女205(25.0)14(70.0)1(4.8) 男206(30.0)14(70.0)0(0.0)組織分級(jí)0.954 Ⅰ52(40.0)3(60.0)0(0.0) Ⅱ205(25.0)14(70.0)1(5.0) Ⅲ154(26.7)11(73.3)0(0.0)腫瘤大小0.161 ≤2cm123(25.0)9(75.0)0(0.0) 2-5cm246(25.0)17(70.8) 1(4.1) >5cm42(50.0)2(50.0)0(0.0)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移0.009 陰性122(16.7)9(75.0)1(100.0) 陽(yáng)性289(32.1)19(67.8) 0(0.0)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移0.000 陰性368(22.2)27(75.0)1(2.7) 陽(yáng)性44(100.0)0(0.0)0(0.0)TNM分期0.007 Ⅰ/Ⅱ141(7.1) 12(85.7)1(7.1) Ⅲ226(27.3)16(72.7)0(0.0) Ⅳ44(100.0)0(0.0)0(0.0)

2.3 AQP3與結(jié)直腸癌預(yù)后的關(guān)系

為了確定AQP3與結(jié)直腸癌預(yù)后關(guān)系，對(duì)基于AQP3表達(dá)狀態(tài)的患者累積生存率進(jìn)行了分析，將AQP3弱染色和無(wú)染色定為陰性，強(qiáng)染色定位陽(yáng)性。AQP3陰性患者(n=29)1年累積生存率為100.0%(中位時(shí)間，30.2個(gè)月)，而AQP3陽(yáng)性患者(n=11)的累積生存率為78.6%(中位時(shí)間，20.0個(gè)月)，二者間有顯著性差異(P=0.011，見圖2)。

圖2 兩組患者結(jié)直腸癌組織中AQP3表達(dá)陽(yáng)性組和陰性組生存曲線圖 Figure 2 Kaplan-Meier analysis of the overall postoperative survival curves in colorectal cancer patients with positive or negative AQP3 protein expression

多因素分析顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.009)和TNM分期(P=0.007)是結(jié)直腸癌患者總生存期的獨(dú)立預(yù)后因素；腫瘤大小等其他臨床參數(shù)不是獨(dú)立的預(yù)后因素(見表2)。

表2 Cox多元比例風(fēng)險(xiǎn)預(yù)后模型

Table 2 Prognostic factors in Cox multivariate analysis

參數(shù) 生存率P風(fēng)險(xiǎn)比AQP30.0091.886淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移0.0101.561TNM分期0.0201.276腫瘤大小0.0810.900性別0.2551.224年齡0.3001.663

3 討論

水通道蛋白(aquaporin，AQPs)是廣泛存在于原核和真核生物細(xì)胞膜、高效選擇性轉(zhuǎn)運(yùn)水分子的特異通道[6]。腫瘤是機(jī)體在各種致瘤因素的作用下，細(xì)胞在基因水平上失去其生長(zhǎng)的正常調(diào)控，導(dǎo)致新生物生成的過(guò)程。細(xì)胞所依賴的各種代謝都需要水分子的參與，而水通道蛋白可以快速特異地轉(zhuǎn)運(yùn)水分子。

AQP3，最初認(rèn)為生理?xiàng)l件下表達(dá)在皮膚角質(zhì)細(xì)胞中[11]，AQP3敲除小鼠會(huì)因?yàn)榻琴|(zhì)細(xì)胞中缺少甘油及水分而出現(xiàn)皮膚彈性及屏障功能受損[10]，與光化性角化病、Bowen病和浸潤(rùn)性皮膚鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生有密切聯(lián)系[12]。AQP3在結(jié)直腸癌、宮頸癌、腎癌、皮膚腫瘤、食道癌、肝癌等多種腫瘤中也具有高表達(dá)[10]。但AQP3在腫瘤進(jìn)展具體作用機(jī)制還不完全明確。在胃癌細(xì)胞系中AQP3可通過(guò)Wnt/GSK-3beta/beta-catenin信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移[13]，還可以通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路減少腫瘤細(xì)胞水和能量代謝[14]。在乳腺癌細(xì)胞中，AQP3通過(guò)調(diào)控CXCL12/CXCR4依賴的H2O2轉(zhuǎn)運(yùn)影響乳腺癌細(xì)胞的遷移能力[15]。在前列腺癌中，AQP3可介導(dǎo)ERK1/2激活、提高M(jìn)MP3表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和浸潤(rùn)能力[16]。

然而，AQP3在結(jié)直腸癌中的表達(dá)和臨床意義尚未完全闡明。本研究中檢測(cè)到的結(jié)直腸組織中AQP3表達(dá)與以前研究結(jié)果[17]相一致。此外，我們分析了AQP3與結(jié)直腸癌臨床病理特征的相關(guān)性，結(jié)果表明，AQP3與患者的年齡、性別無(wú)顯著性相關(guān)，而與腫瘤TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)。本研究初步證實(shí)了AQP3在結(jié)直腸癌中可能的作用地位，具體AQP3通過(guò)何種機(jī)制影響結(jié)直腸癌進(jìn)展，有必要在細(xì)胞分子生物學(xué)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步探討研究，這也是課題組下一步的方向。

總之，本階段研究提示AQP3蛋白在結(jié)直腸癌中表達(dá)上調(diào)，與高TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后緊密相關(guān)。因此，AQP3可作為結(jié)直腸癌侵襲和轉(zhuǎn)移的新的生物標(biāo)志物。

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AQP3 expression in colorectal carcinoma and its relationship with clinical prognosis

LEI Xing1，CHEN Shuo2，SHAN Tao2*

(1DepartmentofGeneralSurgery,AffiliatedHospitalofMedicalCollege,Yan’anUniversity,Yan’an716000,China;2DepartmentofGeneralSurgery,SecondAffiliatedHospitalofMedicalCollege,Xi’anJiaotongUniversity;*Correspondingauthor,E-mail:shantao820304@163.com)

ObjectiveTo investigate AQP3 expression in colorectal carcinoma and its relationship with clinical prognosis.MethodsClinical data and followed-up data from 40 colorectal cancer patients without chemotherapy before surgery were collected. The expression of AQP3 was measured in 40 cases of colorectal cancer tissues, 40 cases of para-neoplastic tissues and 40 cases of normal tissues by immunohistochemistry(IHC). Then the correlation between AQP3 expression and clinicopathological parameters and prognosis was analyzed.ResultsOf 40 tumor specimens, 11(27.5%) had high expression of AQP3, 28(64.4%) exhibited moderate(intermediate) staining, and 1(2.5%) showed no AQP3 expression. AQP3 was only occasionally detected in para-neoplastic tissues[4(10.0%)] and normal tissues[2(5.0%)]. AQP3 overexpression was associated with TNM stage(P=0.007), lymph node metastasis(P=0.009), and distant metastasis(P=0.000). The relationships between age, gender, histological grade and tumor size and expression of AQP3 were not significant(P>0.05). In addition, patients with negative AQP3 expression had a superior cumulative survival rate compared to patients with positive AQP3 expression.ConclusionAQP3 may be used as a novel biomarker for predicting colorectal cancer prognosis.

colorectal cancer; aquaporin 3; prognosis; immunohistochemistry

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81402583);陜西省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2014JQ4165)；西安交通大學(xué)?；鹳Y助項(xiàng)目(xjj2014077)

雷星，男，1979-03生，碩士，副主任醫(yī)師，E-mail：leisaner@163.com

2016-08-27

R735.35

A

1007-6611(2016)11-1008-04

10.13753/j.issn.1007-6611.2016.11.012