王曉劍 , 張 悠，王曉紅

(1首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院藥劑科, 北京 100050; 2北京市豐盛中醫(yī)骨傷?？漆t(yī)院內(nèi)科; 3江蘇省第二中醫(yī)院內(nèi)分泌科； *通訊作者，E-mail:wxjhxj2006@163.com)

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大黃散質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

王曉劍1*, 張 悠2，王曉紅3

(1首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院藥劑科, 北京 100050;2北京市豐盛中醫(yī)骨傷專科醫(yī)院內(nèi)科;3江蘇省第二中醫(yī)院內(nèi)分泌科；*通訊作者，E-mail:wxjhxj2006@163.com)

目的 建立大黃散的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。 方法 采用薄層色譜法(TLC)法對(duì)大黃散中黃連進(jìn)行定性鑒別，采用HPLC法檢測(cè)大黃素和大黃酚的含量。色譜柱：Kromasil ODS C18(200 mm×4.6 mm，5 μm)，流速：1.0 ml/min，流動(dòng)相：甲醇-0.1%磷酸溶液(70 ∶30)，pH 2.3，檢測(cè)波長為256 nm。 結(jié)果 薄層色譜中，黃連斑點(diǎn)清晰可見，分離度符合要求，陰性無干擾；大黃素和大黃酚含量分別在36.4-182.0 ng，70.3-351.5 ng范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均加樣回收率分別為104.9%(RSD=3.3%，n=6)、99.3%(RSD=2.4%，n=6)，精密度RSD均為0.9%。 結(jié)論 本文構(gòu)建的TLC法定性鑒別黃連及HPLC法檢測(cè)大黃素和大黃酚含量的方法結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可作為大黃散的質(zhì)量控制方法。

大黃散； 薄層色譜法； 高效液相色譜法； 大黃素； 大黃酚

大黃散是由大黃、黃連和黃芩三味藥組成的復(fù)方制劑，收載于《外臺(tái)秘要》，主治黃疸。該方目前尚無相關(guān)質(zhì)量控制方法，影響了其進(jìn)一步開發(fā)利用，為加強(qiáng)對(duì)本品的質(zhì)量控制，本文采用薄層色譜法(TLC)法對(duì)黃連進(jìn)行了定性鑒別，并采用高效液相色譜法(HPLC)法對(duì)大黃中大黃素、大黃酚的含量進(jìn)行了測(cè)定。

1 儀器、試劑與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀(依利特P200Ⅱ)；可見紫外分光光度計(jì)(日本島津UV-2450型)。

1.2 試劑與試藥

甲醇-色譜純，水-純化水，其余試劑均為分析純，大黃素(含量測(cè)定用，批號(hào)：110756-200110)和大黃酚對(duì)照品(含量測(cè)定用，批號(hào)：110796-201319)、黃連對(duì)照藥材(批號(hào)：120913-201109)、小檗堿對(duì)照品(鑒別用，批號(hào)：110713-200910)，均購于中國藥品生物制品檢定所。

2 方法與結(jié)果

2.1 黃連的薄層色譜鑒別

2.1.1 溶液制備 供試品溶液制備：取大黃散6 g，甲醇加熱回流 1 h，放冷，濾過，取濾液，即得。

對(duì)照藥材溶液制備：取黃連對(duì)照藥材，甲醇加熱回流1 h，放冷，濾過，取濾液，即得。

對(duì)照品溶液制備：取鹽酸小檗堿對(duì)照品，制成0.5 mg/ml甲醇溶液。

陰性對(duì)照品溶液制備：取黃連和黃芩，按供試品溶液的制備方法制成。

薄層色譜(附錄ⅥB)試驗(yàn)：吸取上述供試品溶液、對(duì)照藥材溶液、對(duì)照品溶液及陰性對(duì)照品溶液四種溶液各5 μl，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-濃氨試液(9 ∶6 ∶3 ∶1)為展開劑，預(yù)飽和后展開，取出，晾干后紫外光燈365 nm下檢視。

2.1.2 色譜結(jié)果 薄層色譜中，供試品與對(duì)照品相應(yīng)位置顯相同的1個(gè)黃色熒光斑點(diǎn)；在與黃連對(duì)照藥材對(duì)應(yīng)位置顯相同顏色3個(gè)黃色熒光斑點(diǎn)(見圖1)。

1.大黃散(批號(hào):161001)；2.大黃散(批號(hào):161002)；3.大黃散(批號(hào):161003)；4.缺黃連陰性樣品；5.黃連對(duì)照藥材；6.鹽酸小檗堿圖1 黃連薄層色譜鑒別Figure1 Thin layer chromatogram of rhizoma coptidis

2.2 大黃素和大黃酚的含量測(cè)定

2.2.1 溶液的制備 供試溶液的制備：精密稱取大黃散3 g，置錐形瓶中，量取乙醇25 ml，稱定重量，加熱回流1 h，冷卻后用乙醇補(bǔ)足重量，濾過。取續(xù)濾液，精密量取10 ml，揮干溶劑，以15 ml 30%乙醇-鹽酸(10 ∶1)溶液為溶劑加熱回流1 h，冷卻，分別用三氯甲烷振搖提取4次，合并提取液，回收溶劑，殘?jiān)脽o水乙醇-乙酸乙酯(2 ∶1)混合溶液溶解，移至25 ml的量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，備用。

對(duì)照品溶液的制備：分別精密稱取大黃素和大黃酚對(duì)照品適量，加無水乙醇-乙酸乙酯(2 ∶1)混合溶液，制成大黃素8 μg/ml和大黃酚15 μg/ml的混合溶液，即得。

空白溶液的制備：取處方除大黃的藥味，按成品工藝及供試品溶液的制備方法制備空白對(duì)照品溶液。

2.2.2 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜柱：采用迪馬Kromasil ODS C18(200 mm×4.6 mm，5 μm)，大黃素和大黃酚色譜峰可基線分離；紫外全程掃描確定大黃素在256 nm處有最大吸收，故選擇256 nm作為檢測(cè)波長；以甲醇-0.1%磷酸溶液(70 ∶30)作為流動(dòng)相，色譜圖顯示大黃素和大黃酚色譜峰保留時(shí)間適宜，與其他色譜峰分離度大于1.5，理論塔板數(shù)按大黃素計(jì)不得少于3 000。

2.2.3 專屬性試驗(yàn) 取方中除大黃的藥味黃連和黃芩，按大黃散制備工藝及供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照溶液，按正文2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果本品陰性對(duì)照溶液在大黃素和大黃酚色譜峰所在位置無干擾(見圖2)，證明本文建立的方法專屬性強(qiáng)。

1.大黃素；2.大黃酚圖2 大黃素、大黃酚HPLC圖Figure 2 High performance liquid chromatogram of emodin and chrysaphanol

2.2.4 線性范圍考察 分別精密稱取大黃素和大黃酚對(duì)照品適量，加無水乙醇-乙酸乙酯(2 ∶1)制成含大黃素72.8 mg/L和含大黃酚140.6 mg/L的對(duì)照品溶液，分別量取 0.5，1，1.5，2，2.5 ml至10 ml量瓶中，用無水乙醇-乙酸乙酯(2 ∶1)稀釋至刻度，分別進(jìn)樣10 μl，測(cè)定。大黃素和大黃酚進(jìn)樣量(ng)對(duì)峰面積作圖，得直線，其大黃素回歸方程為y=69.321+46.530x，r=0.999 9；大黃酚回歸方程為y=189.43+135.9x，r=0.999 9；結(jié)果表明，大黃素和大黃酚分別在36.4-182.0 ng和70.3-351.5 ng范圍內(nèi)進(jìn)樣量與峰面積之間呈良好線性關(guān)系。

2.2.5 精密度考察 精密吸取同一份供試品溶液20 μl(批號(hào)：161001)，在上述色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣5次，結(jié)果大黃素、大黃酚峰面積RSD分別為0.9%和0.9%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性考察 取同一份供試品溶液(批號(hào)：161001)，分別在制備后0，2，6，12，24 h后依法測(cè)定大黃素和大黃酚的峰面積，結(jié)果大黃素、大黃酚峰面積RSD分別為0.8%和0.9%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同批樣品(批號(hào)：161001)，依法平行測(cè)定6份，分別計(jì)算大黃素和大黃酚的總量，結(jié)果平均含量為0.534 mg/g，RSD值為2.8%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.2.8 回收率試驗(yàn) 采用加樣回收方法，精密稱取已知含量的樣品(批號(hào)：161001)適量，分別加入一定量的大黃素和大黃酚對(duì)照品，參照2.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依法測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果表明該法具有良好的回收率，大黃素和大黃酚平均加樣回收率分別為104.9%(RSD=3.3%，n=6)和99.3%(RSD=2.4%，n=6)，見表1。

表1 大黃素、大黃酚回收率試驗(yàn)結(jié)果 (n=6)

Table 1 Results of recovery test of emodin and chrysaphanol in Dahuang powders (n=6)

序號(hào)取樣量(g)測(cè)得量(mg)樣品含量(mg)對(duì)照品加入量(mg)回收率(%)平均回收率(%)大黃素大黃酚大黃素大黃酚大黃素大黃酚大黃素大黃酚大黃素大黃酚11.50110.45870.85360.22370.43080.220.43106.8398.32104.999.321.53210.46450.87210.22830.43970.220.43107.37100.5631.49960.45230.86320.22340.43040.220.43104.03100.6541.50820.45780.85890.22470.43290.220.43105.9499.0851.56080.45680.86320.23260.44790.220.43101.9396.5761.48990.44890.85890.22200.42760.220.43103.14100.30

2.2.9 大黃藥材的含量測(cè)定 精密稱取大黃藥材0.15 g，置錐形瓶中，加乙醇25 ml，稱定重量，加熱回流1 h，放冷，乙醇補(bǔ)足減失重量，濾過，精密量取續(xù)濾液10 ml，水浴蒸干，加30%乙醇-鹽酸(10 ∶1)溶液15 ml，加熱回流1 h，立即冷卻，三氯甲烷振搖提取4次，每次15 ml，合并三氯甲烷液，回收溶劑，殘?jiān)脽o水乙醇-乙酸乙酯(2 ∶1)混合溶液溶解，移置25 ml量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

按正文中的供試品含測(cè)條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表2。

表2 大黃藥材含量測(cè)定結(jié)果 (n=6)

Table 2 Determination of emodin and chrysophanol in Rhubarb (n=6)

序號(hào)大黃素含量(mg/g)大黃酚含量(mg/g)總含量(mg/g)百分含量(%)11.4879.07610.5631.0621.5469.89911.4451.1431.49910.00711.5061.15

2.2.10 樣品測(cè)定 按正文擬定含量測(cè)定方法，分別對(duì)10批樣品進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表3。

表3 大黃散中大黃素、大黃酚含量測(cè)定結(jié)果 (mg/g，n=3)

Table 3 Determination of emodin and chrysophanol in Dahuang powders (mg/g，n=3)

批號(hào)大黃素含量大黃酚含量總含量1610010.1520.2610.4131610020.1560.2260.3821610030.1510.2780.4291610040.1460.2790.4251605010.1530.2860.4391510010.1470.290.4371510020.1490.2670.4161510030.1540.2840.4381510040.1570.2870.4441510050.1420.2730.415

結(jié)果顯示，本文所測(cè)10批大黃散中大黃素和大黃酚的平均含量為0.424 mg/g。在保證產(chǎn)品質(zhì)量的前提下，綜合考慮藥材成分轉(zhuǎn)移率等因素，建議本品每克含大黃以大黃素和大黃酚含量總和計(jì)不得少于0.3 mg。

3 討論

大黃散是由大黃、黃連和黃芩三味藥組成的復(fù)方制劑，收載于《外臺(tái)秘要》。方中以大黃之苦寒瀉熱通便，瀉下焦之火；黃連之苦寒瀉火堅(jiān)陰，瀉中焦之火；黃芩之苦寒，清熱除煩，瀉上焦之火，又可清解少陽腑中之熱。其中大黃為君藥，其主要有效成分為大黃素和大黃酚等蒽醌類成分。研究表明大黃具有多種藥理活性，包括調(diào)整胃腸運(yùn)動(dòng)、改善血液循環(huán)、清潔腸道、減少毒素吸收、保護(hù)腸屏障、調(diào)整免疫、保護(hù)器官等?，F(xiàn)代藥理學(xué)也證實(shí)大黃具有抗菌作用，且抗菌譜廣、作用強(qiáng)。以大黃為主要藥味的國家標(biāo)準(zhǔn)復(fù)方中成藥品種達(dá)八百多種，且大黃已作為一個(gè)世界性藥物載入多個(gè)國家的藥典。

本文采用薄層色譜法對(duì)大黃散中黃連進(jìn)行定性鑒別[1，2]，并以方中君藥大黃為研究對(duì)象，參考《中國藥典》(2015年版)及文獻(xiàn)建立了高效液相色譜法測(cè)定大黃中大黃素和大黃酚的含量[3-6]，同時(shí)加入黃連的定性鑒別，可有效控制大黃散的質(zhì)量。在監(jiān)控藥品制劑質(zhì)量的同時(shí)，對(duì)投料藥材的質(zhì)量進(jìn)行同步監(jiān)控，可保證從源頭控制產(chǎn)品質(zhì)量。鑒于中藥復(fù)方所含化學(xué)成分類型多樣，選擇以對(duì)照品和對(duì)照藥材同時(shí)作為對(duì)照，可以準(zhǔn)確檢測(cè)藥材，有利于提高專屬性，加強(qiáng)中藥復(fù)方質(zhì)量控制。

本文構(gòu)建的采用薄層色譜法定性鑒別方中黃連、采用高效液相色譜法測(cè)定大黃素和大黃酚的含量的方法結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可作為大黃散的質(zhì)量控制方法，為保證其臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)，為進(jìn)一步開發(fā)研究提供依據(jù)。

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Study on quality standard of Dahuang powder

WANG Xiaojian1*, ZHANG You2, WANG Xiaohong3

(1DepartmentofPharmacy,BeijingFriendshipHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing100050,China;2DepartmentofInternalMedicine,BeijingFengshengSpecialHospitalofTraditionalMedicalTraumatologyandOrthopaedics;3DepartmentofEndocrinology,JiangsuProvinceSecondHospitalofTCM;*Correspondingauthor,E-mail:wxjhxj2006@163.com)

ObjectiveTo establish the quality standard of Dahuang powder.MethodsRhizoma coptidis was identified by thin layer chromatography(TLC), and the contents of emodin and chrysophanol in Dahuang powder were both determined by high performance liquid chromatography(HPLC). The separation was performed on Kromasil ODS column with methanol-0.1% phosphoric acid(70 ∶30) as mobile phase and pH=2.3，and the UV detector was set at 256 nm.ResultsThe calibration curves of emodin and chrysophanol were linear in the range of 36.4-182 ng and 70.3-351.5 ng respectively. The average recoveries of emodin and chrysophanol were 104.9%(RSD=3.3%，n=6) and 99.3%(RSD=2.4%，n=6),respectively, and the RSD of precision was both 0.9%.ConclusionThe method is accurate, reliable, and can be used for the quality control of the preparation of Dahuang powder.

Dahuang powder; thin layer chromatography; high performance liquid chromatography; emodin; chrysophanol

王曉劍，男，1983-10生，碩士，藥師，E-mail：wxjhxj2006@163.com

2016-05-06

R927.1

A

1007-6611(2016)11-0988-04

10.13753/j.issn.1007-6611.2016.11.006