朱洪竹,阮曉娟,朱梅菊,曾志剛,肖國(guó)強(qiáng)

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運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)2型糖尿病大鼠腎臟NF-κB-p65和相關(guān)蛋白表達(dá)的影響及機(jī)制研究

朱洪竹1,阮曉娟1,朱梅菊1,曾志剛1,肖國(guó)強(qiáng)2

目的：研究運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)2型糖尿病大鼠腎臟NF-κB-p65及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，以探討運(yùn)動(dòng)改善2型糖尿病大鼠腎損傷的可能作用機(jī)制。方法：SD大鼠通過高脂飼料喂養(yǎng)6周和低劑量腹腔注射STZ的方法復(fù)制2型糖尿病大鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組(A)，糖尿病安靜組(B)和糖尿病運(yùn)動(dòng)組(C)。C組進(jìn)行6周的有氧游泳訓(xùn)練，其余兩組不施加干預(yù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，測(cè)試隨機(jī)血糖、24 h UAE、T-SOD、MDA、NF-κB-p65、Activated Caspase-3和Nephrin蛋白表達(dá)，并進(jìn)行電鏡觀察腎臟顯微結(jié)構(gòu)的改變。結(jié)果：1)電鏡下，運(yùn)動(dòng)干預(yù)的C組大鼠可見濾過膜3層結(jié)構(gòu)較清晰，基底膜未見明顯增加，足突稍腫大、足細(xì)胞融合等癥狀較B組大鼠均有所改善。2)運(yùn)動(dòng)干預(yù)后，C組大鼠的血糖濃度、24 h UAE排泄量均降低，與B組比較，均有顯著性差異(P<0.05或P<0.01)。3)運(yùn)動(dòng)干預(yù)后，C組大鼠腎皮質(zhì)T-SOD活性上升而MDA含量下降，與B組比較，亦有明顯差異(P<0.05或P<0.01)。4) 運(yùn)動(dòng)干預(yù)后，C組大鼠腎皮質(zhì)NF-κB-p65和Activated Caspase-3蛋白表達(dá)均明顯降低，而Nephrin蛋白表達(dá)明顯增加，與B組比較，差異均呈顯著性(P<0.05或P<0.01)。結(jié)論：運(yùn)動(dòng)能降低2型糖尿病大鼠血糖，減輕腎臟病理?yè)p傷，并提高腎功能,其機(jī)制可能與運(yùn)動(dòng)的下調(diào)氧化應(yīng)激介導(dǎo)的2型糖尿病大鼠腎臟核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB-p65的表達(dá)，以改善效應(yīng)蛋白Activated Caspase-3異常表達(dá)和恢復(fù)足細(xì)胞特異標(biāo)志物-Nephrin蛋白的表達(dá)，而改善大鼠腎臟損傷的保護(hù)作用有關(guān)。

2型糖尿?。贿\(yùn)動(dòng)訓(xùn)練；腎臟損傷；NF-κB-p65；相關(guān)蛋白；大鼠

前言

目前認(rèn)為，2型糖尿病腎病變的臨床早期主要表現(xiàn)為微量蛋白尿的出現(xiàn)且持續(xù)增加[2]。引起蛋白尿出現(xiàn)的根本原因是足細(xì)胞裂孔膜(Slit Diaphragm,SD)相關(guān)蛋白的損害或表達(dá)下調(diào)而導(dǎo)致的足細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的障礙[9,10]。Nephrin蛋白是足細(xì)胞表面的功能蛋白之一，由足細(xì)胞合成，其分布和表達(dá)的缺失可引起SD和足細(xì)胞形態(tài)的改變，進(jìn)而出現(xiàn)蛋白尿[8,9]，引起腎小球損傷。研究已知，NF-κB是氧應(yīng)激敏感的轉(zhuǎn)錄因子。高糖環(huán)境下，體內(nèi)的氧化應(yīng)激可激活NF-κB[21]，NF-κB異常活化可啟動(dòng)下游基因的轉(zhuǎn)錄，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，引起腎臟損傷[22]。但NF-κB介導(dǎo)的腎臟損傷，可否通過誘導(dǎo)活化凋亡蛋白Activated Caspase-3的表達(dá)增加來減少足細(xì)胞功能蛋白Nephrin的表達(dá)而影響足細(xì)胞功能，目前對(duì)此的直接報(bào)道較少。研究又發(fā)現(xiàn)，有氧游泳運(yùn)動(dòng)可降低2型糖尿病大鼠蛋白尿的排泄，保護(hù)受損腎臟[18]。目前尚不清楚運(yùn)動(dòng)的腎保護(hù)作用是否依賴其對(duì)NF-κB的調(diào)節(jié)，降低Activated Caspase-3的蛋白水平和恢復(fù)足細(xì)胞Nephrin的表達(dá)，來改善2型糖尿病大鼠腎臟損傷。

本研究采用高脂飲食飼喂6周+低劑量鏈脲佐菌素(STZ)腹腔注射的方法誘導(dǎo)建立2型糖尿病大鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，通過檢測(cè)大鼠血糖、氧化應(yīng)激水平、腎功能、NF-κB-p65、Activated Caspase-3和Nephrin蛋白的表達(dá)，觀察有氧游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)2型糖尿病大鼠早期腎臟損傷的影響，探討運(yùn)動(dòng)的新的腎保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物造模與分組

模型的建立參照Reed等[17]研究方法進(jìn)行改良。SPF雄性SD大鼠46只(購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司)，4周齡，體質(zhì)量140±20 g。1周的適應(yīng)性喂養(yǎng)后，隨機(jī)分為正常對(duì)照組(A組，10只)和建模組(36只)2組。正常組繼續(xù)飼喂普通飼料，建模組改為高脂飼料喂養(yǎng)，高脂飼料為普通飼料63.5%、蔗糖20%、豬油10%、蛋黃粉5%、膽固醇1%、膽酸鹽0.5%。6周后，建模組行葡萄糖耐量試驗(yàn)和胰島素敏感性實(shí)驗(yàn)后，確定存在胰島素抵抗的建模大鼠經(jīng)單次腹腔注射STZ(35 mg/kg bw)[17]，以復(fù)制2型糖尿病大鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀Ｗ⑸銼TZ 1周后尾靜脈采血測(cè)試血糖，以隨機(jī)血糖≥16.7 mmol/L入選暫成模大鼠。連續(xù)觀察1周后，再測(cè)血糖，隨機(jī)血糖仍≥16.7 mmol/L確立為2型糖尿病建模成功。共29只大鼠符合2型糖尿病模型標(biāo)準(zhǔn)，隨機(jī)分為糖尿病安靜組(B組，14只)和糖尿病運(yùn)動(dòng)組(C組，15只)。

1.2 動(dòng)物訓(xùn)練方案

動(dòng)物運(yùn)動(dòng)方案參照Ploug等[16]的研究方法結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)，C組大鼠施加6周無負(fù)重游泳訓(xùn)練。第1～2周的訓(xùn)練時(shí)間分別是30 min/天和45 min/天，從第3～6周以60 min/天進(jìn)行訓(xùn)練。每周訓(xùn)練6天，中間休息1天。水溫保持在33±1℃,水深50 cm。

1.3 主要試劑

免抗鼠NF-κB-p65、Activated Caspase-3、Nephrin均為多克隆抗體，購(gòu)于北京博奧森生物公司；大鼠尿微量白蛋白(UAE)ELISA Kit購(gòu)自美國(guó)ABR公司；總超氧化物岐化酶(T-SOD)和丙二醛(MDA)測(cè)試盒均購(gòu)于南京建成生物公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)取材與指標(biāo)檢測(cè)

1.4.1 實(shí)驗(yàn)取材

6周游泳運(yùn)動(dòng)干預(yù)停止36 h后，過夜禁食12 h，大鼠分批麻醉處死。麻醉前1天代謝籠收集24 h尿液，測(cè)24 h尿微量白蛋白(24 h UAE)。大鼠腹腔麻醉，心臟采血，經(jīng)左心室插管冷生理鹽水充分灌洗腎臟，分離腎皮質(zhì)，入-20℃冰箱保存待測(cè)SOD活性和MDA含量。另分離新鮮腎皮質(zhì)，入多聚甲醛固定溶液(4%)中固定，待作免疫組化檢測(cè)。取腎臟髓質(zhì)交界處皮質(zhì)部分，一半切取1 mm3腎皮質(zhì)組織放入2.5%戊二醛電鏡固定液中，用于制備電鏡標(biāo)本；另一半放入液氮中速凍后轉(zhuǎn)移到-80℃超低溫冰箱保存待用免疫印跡法檢測(cè)Activated Caspase-3和Nephrin蛋白表達(dá)量。

1.4.2 指標(biāo)檢測(cè)

1.腎臟電鏡標(biāo)本的制作與觀察。1 mm3的腎皮質(zhì)組織塊固定4 h后，經(jīng)1%鋨酸固定、常規(guī)梯度脫水、滲透、包埋與聚合、切片(厚度約80 nm)、飽和醋酸鈾和枸櫞酸鉛雙重染色。美國(guó)透射電鏡(Tecnai G2 S-Twin)與Digital Microgragh攝像軟件主要觀察腎小球?yàn)V過屏障(毛細(xì)血管基底膜、內(nèi)皮細(xì)胞、足細(xì)胞)超微結(jié)構(gòu)。

2.血糖和24 h UAE測(cè)定。血糖的測(cè)定采用生化法；24 h UAE的測(cè)定采用酶聯(lián)免疫法(ELISA法)。

3.腎皮質(zhì)SOD、MDA指標(biāo)的檢測(cè)。采用常規(guī)生化法檢測(cè)，嚴(yán)格按試劑盒操作說明書進(jìn)行。

4.NF-κB-p65 免疫組織化學(xué)檢測(cè)。 常規(guī)方法制作腎皮質(zhì)石蠟切片(厚度3 μm)，NF-κB-p65的表達(dá)采用Envision免疫組織化學(xué)染色。嚴(yán)格按試劑盒的說明書操作(NF-κB-p65一抗工作濃度為1∶500)。用OLYMPUS公司的BX41型光學(xué)顯微鏡觀察，圖像分析系統(tǒng)(Image-Pro Plus生物醫(yī)學(xué)圖像分析軟件)檢測(cè)陽(yáng)性表達(dá)。測(cè)定NF-κB-p65的IOD值和AREA，計(jì)算MOD，即MOD=IOD值/AREA，其值越大表示NF-κB-p65陽(yáng)性產(chǎn)物表達(dá)越強(qiáng)。

5.Activated Caspase-3、Nephrin指標(biāo)Western-blotting檢測(cè)。檢測(cè)步驟為：樣品聚丙烯酰氨凝膠電泳后，將膠上蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，室溫下5%的脫脂奶粉封閉2.0 h，加一抗4℃孵育過夜(抗體工作濃度分別為1∶1 500和1∶500)，加二抗室溫孵育4 h。洗膜、顯影、定影、曝光,洗片，于凝膠電泳成像儀中成像。

1.5 數(shù)據(jù)處理

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 各組大鼠血糖濃度和24 h UAE含量的變化

如表1所示，B組和C組大鼠的血糖濃度和24 h UAE與干預(yù)前(0周)的A組相比，均明顯增加(均P<0.01)。與A組比較，B組大鼠血糖濃度和24 h UAE逐漸增多，自第2周起兩組相鄰兩周同時(shí)間點(diǎn)比較，差異呈極顯著性(均P<0.01)。自第4周開始，運(yùn)動(dòng)干預(yù)的C組大鼠的血糖濃度和24 h UAE含量均有所下降，第6周下降尤為明顯，與B組同期相比，其差異均有顯著性(P<0.05或P<0.01)。

表1 各組大鼠血糖濃度和24 h UAE含量的變化

2.2 各組大鼠腎臟T-SOD活性、MDA含量的變化

從表2可看出，與A組相比，B組大鼠腎臟的總超氧化物歧化酶(T-SOD)活性明顯降低(P<0.01)，而丙二醛(MDA)含量顯著增加(P<0.01)；與B組相比，C組大鼠腎臟的T-SOD活性上升明顯(P<0.01)，MDA含量明顯下降(P<0.05)。

表2 干預(yù)第6周末各組大鼠腎臟T-SOD活性、MDA含量的變化

2.3 電鏡下足細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變

電鏡下可見，A組大鼠足細(xì)胞排列整齊，未見明顯異常；基底膜厚度均勻。與A組相比，B組大鼠可見足細(xì)胞排列明顯紊亂，足突間距增寬，融合增加、甚至消失；基底膜呈節(jié)段性增厚。運(yùn)動(dòng)干預(yù)的C組大鼠較B組上述癥狀明顯減輕(圖1)。

2.4 各組大鼠腎組織NF-κB-p65免疫組化檢測(cè)結(jié)果

免疫組化結(jié)果顯示，A組大鼠腎皮質(zhì)內(nèi)NF-κB-p65幾乎不表達(dá)；B組大鼠腎皮質(zhì)NF-κB-p65蛋白表達(dá)較A組明顯增加，其差異呈顯著性(P<0.01)；6周有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)的C組大鼠，其腎皮質(zhì)NF-κB-p65蛋白表達(dá)明顯降低，與B組比較，差異亦呈顯著性(P<0.05，圖2)。

圖1 3組大鼠腎小球電鏡下的病理變化示意圖

圖2 分組大鼠腎組織NF-κB-p65 免疫組化染色檢測(cè)示意圖 (×100)

表3 各組大鼠腎皮質(zhì)NF-κB-p65的平均光密度值的變化

2.5 各組大鼠腎組織Activated Caspase-3、Nephrin Western-blotting檢測(cè)結(jié)果

由圖3和圖4可知，B組大鼠腎皮質(zhì)組織Activated Caspase-3的表達(dá)水平較A組明顯升高(P<0.01)，其腎皮質(zhì)Nephrin的表達(dá)水平明顯低于A組(P<0.01)。6周游泳運(yùn)動(dòng)干預(yù)后，C組大鼠腎皮質(zhì)的Activated Caspase-3蛋白表達(dá)較B組顯著降低(P<0.05)，但仍高于A組水平(P<0.01)；而C組大鼠腎皮質(zhì)的Nephrin蛋白表達(dá)較B組明顯增加，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，亦顯著低于A組(P<0.05)。`

3 分析與討論

3.1 運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)2型糖尿病大鼠血糖、微量蛋白尿及腎臟形態(tài)學(xué)的影響

Nielsen等研究表明[13]，2型糖尿病腎臟損害早期的主要臨床標(biāo)志即微量蛋白尿(Urinary albumin excretion，UAE)，在糖尿病患者出現(xiàn)此癥狀時(shí)，其腎功能已開始下降。

圖3 各組大鼠腎組織Activated Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量的變化示意圖

圖4 各組大鼠腎組織Nephrin蛋白相對(duì)表達(dá)量的變化示意圖

由表1實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，糖尿病安靜組(B組)和運(yùn)動(dòng)干預(yù)的糖尿病組(C組)的UAE在干預(yù)前已明顯高于正常對(duì)照組(A組)，說明本實(shí)驗(yàn)制作的2型糖尿病模型大鼠，其腎功能在干預(yù)前已存在障礙。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，B組大鼠隨著血糖濃度的逐漸增加，UAE的排泄量也相繼出現(xiàn)升高，其腎功能相繼下降明顯，對(duì)糖尿病腎臟的損害也進(jìn)一步加重，與前人研究相一致[18]。電鏡下觀察腎臟的形態(tài)學(xué)改變，是腎臟結(jié)構(gòu)損傷的最直接證明。鏡下可見B組大鼠出現(xiàn)腎小球3層結(jié)構(gòu)不清，基底膜呈節(jié)段性增厚，足細(xì)胞排列紊亂、多數(shù)足細(xì)胞融合甚至消失等病理現(xiàn)象。進(jìn)一步從形態(tài)學(xué)方面佐證本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ痛笫笠殉霈F(xiàn)足細(xì)胞損傷及2型糖尿病腎臟早期受損的現(xiàn)象[15]。6周有氧游泳運(yùn)動(dòng)干預(yù)后，模型大鼠血糖濃度、24 h UAE的排出、腎小球足細(xì)胞和基底膜損傷較未干預(yù)組明顯得到改善，提示，有氧游泳訓(xùn)練除了能明顯降低2型糖尿病腎損傷大鼠的血糖水平，還能有效提高其腎功能，一定程度減輕腎損傷的作用，與多數(shù)有氧運(yùn)動(dòng)研究相一致[1，7，15]。

3.2 運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)氧化應(yīng)激介導(dǎo)的2型糖尿病大鼠腎臟NF-κB-p65及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

已有研究表明[9，11]，Nephrin蛋白的表達(dá)異常或缺失，可導(dǎo)致SD結(jié)構(gòu)的喪失，蛋白尿的出現(xiàn)和腎功能衰竭。Langham等[9]在研究糖尿病伴蛋白尿患者和糖尿病實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭幸炎C實(shí)，Nephrin mRNA和蛋白表達(dá)的降低與蛋白尿的增加呈線性關(guān)系。本研究采用Western-blot方法檢測(cè)到B組大鼠腎臟Nephrin蛋白表達(dá)顯著低于A組，結(jié)合電鏡觀察結(jié)果和表1實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，說明本模型大鼠Nephrin蛋白的丟失引起了微量蛋白尿出現(xiàn)，導(dǎo)致大鼠腎臟結(jié)構(gòu)的破壞,與前人報(bào)道相似[24]。

此前的研究已表明，有氧運(yùn)動(dòng)能保護(hù)2型糖尿病受損腎臟，但運(yùn)動(dòng)的腎保護(hù)效應(yīng)是否通過影響Nephrin蛋白的表達(dá)實(shí)現(xiàn)？其作用機(jī)理是什么？目前尚不明確。為此，本研究檢測(cè)了運(yùn)動(dòng)干預(yù)的C組大鼠腎臟Nephrin蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)C組大鼠的Nephrin蛋白表達(dá)水平較B組明顯上升。實(shí)驗(yàn)結(jié)果同時(shí)表明，與B組相比，C組大鼠腎功能和腎小球基底膜及足細(xì)胞損傷均得到改善，提示，運(yùn)動(dòng)抗足細(xì)胞損傷的腎保護(hù)作用可能與恢復(fù)Nephrin蛋白表達(dá)有關(guān)。目前少見足細(xì)胞Nephrin蛋白與有氧運(yùn)動(dòng)抗糖尿病腎臟損傷實(shí)驗(yàn)方面的研究報(bào)道。多種病因可引起糖尿病腎小球足細(xì)胞損傷，引起Nephrin蛋白表達(dá)缺失[9]。有研究發(fā)現(xiàn)[25]，氧化應(yīng)激與Nephrin的表達(dá)缺失密切關(guān)聯(lián)。在本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中也得到了證明：B組大鼠腎臟在Nephrin表達(dá)降低的同時(shí)，T-SOD活性降低，MDA含量增高，提示，本模型大鼠足細(xì)胞損傷與腎組織抗氧化能力下降有關(guān)。通過對(duì)運(yùn)動(dòng)干預(yù)組氧化應(yīng)激指標(biāo)的測(cè)試發(fā)現(xiàn)，腎組織中T-SOD活性顯著增加，而MDA含量明顯減少，提示，運(yùn)動(dòng)減少Nephrin蛋白缺失發(fā)揮腎保護(hù)作用可能與其減少糖尿病大鼠腎臟氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。氧化應(yīng)激/ Nephrin蛋白在運(yùn)動(dòng)抗糖尿病大鼠腎臟損傷中具體的作用機(jī)制尚不清楚。

研究又知，高糖狀態(tài)下，體內(nèi)的慢性高血糖促進(jìn)了氧化應(yīng)激的生成，集中激活應(yīng)激敏感的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，如NF-κB信號(hào)、p38MAPK等間接損傷細(xì)胞[20]。核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，未被應(yīng)激情況下，以無活性形式存在于胞漿中，一旦受到TNF-a、氧化應(yīng)激等刺激，NF-κB被激活轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核內(nèi)，在胞核中活化的NF-κB可通過誘導(dǎo)下游基因的表達(dá)上調(diào)引起腎臟細(xì)胞凋亡，從而導(dǎo)致腎臟損傷[3，5，22]。本研究顯示了相似的結(jié)果，B組大鼠腎小球內(nèi)NF-κB-p65(NF-κB的活化形式)呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，其蛋白表達(dá)水平明顯高于A組，同時(shí)大鼠體內(nèi)血糖和氧化應(yīng)激水平也明顯升高，結(jié)合大鼠腎臟病理變化結(jié)果，推測(cè)，本模型糖尿病大鼠體內(nèi)的慢性高血糖促進(jìn)了氧化應(yīng)激的生成[6，20]，而氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的NF-κB表達(dá)增加[6]，可能參與了糖尿病早期出現(xiàn)的足細(xì)胞損傷。另有研究顯示，有氧運(yùn)動(dòng)可抑制炎癥因子TNF-a的產(chǎn)生，并增加1κB表達(dá)，抑制NF-κB的活化[19]。有研究也指出，高糖下氧化應(yīng)激可通過不同的機(jī)制來增加如TNF-a、TGF-β等細(xì)胞因子的產(chǎn)生，并可加快腎小球病變速度[23]；在糖尿病腎病中氧化應(yīng)激是TNF-a的上游效應(yīng)因子，可相互作用，激活NF-κB通路介導(dǎo)腎臟損傷[4]。本研究顯示，經(jīng)6周的實(shí)驗(yàn)干預(yù)后，糖尿病大鼠腎組織的氧化應(yīng)激水平明顯降低，同時(shí)NF-κB-p65蛋白表達(dá)亦明顯下調(diào)，提示，有氧運(yùn)動(dòng)可能通過抑制2型糖尿病大鼠腎組織中氧化應(yīng)激的生成直接或間接減弱NF-κB-p65的過表達(dá)引起的腎臟損傷效應(yīng)。目前少見有關(guān)有氧運(yùn)動(dòng)與2型糖尿病腎臟氧化應(yīng)激和NF-κB-p65之間的關(guān)系研究。

Caspas-3是細(xì)胞凋亡的主要效應(yīng)因子和關(guān)鍵酶蛋白。本研究氧化應(yīng)激介導(dǎo)的NF-κB活化，是否可誘導(dǎo)2型糖尿病大鼠腎臟效應(yīng)蛋白Activated Caspase-3的表達(dá)增加？NF-κB誘導(dǎo)表達(dá)增加的Activated Caspase-3又是否能引起足細(xì)胞功能蛋白Nephrin的表達(dá)減少，從而影響足細(xì)胞功能？目前對(duì)此的直接報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，B組與A組相比，大鼠腎臟NF-κB-p65蛋白表達(dá)增加的同時(shí)，Activated Caspase-3(Caspase-3的活化形式)表達(dá)明顯上升，而Nephrin蛋白的表達(dá)卻顯著降低，提示，本研究Activated Caspase-3的表達(dá)增多和足細(xì)胞Nephrin的下調(diào)有可能依賴于NF-κB的過度激活。有證據(jù)表明，在腎臟組織內(nèi)，細(xì)胞凋亡發(fā)生后，可引起足細(xì)胞數(shù)目和足細(xì)胞上Nephrin的缺失，從而影響腎小球通透性增加和足細(xì)胞結(jié)構(gòu)的受損[12，14，15]。結(jié)合本研究大鼠腎小球足細(xì)胞病理改變結(jié)果，可以推測(cè)，NF-κB的過表達(dá)有可能通過上調(diào)Activated Caspase-3效應(yīng)蛋白的表達(dá)誘導(dǎo)大鼠腎臟細(xì)胞發(fā)生凋亡性損傷[6，23]，繼而引起足細(xì)胞Nephrin的表達(dá)缺失，從而導(dǎo)致SD糖尿病模型大鼠足細(xì)胞損傷和腎臟結(jié)構(gòu)的破壞及腎功能的降低。此外，本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，6周實(shí)驗(yàn)干預(yù)后，糖尿病大鼠腎臟NF-κB-p65表達(dá)明顯降低的同時(shí)，Activated Caspase-3蛋白顯著減少，而Nephrin蛋白表達(dá)則明顯增加，UAE排出量明顯減少，足細(xì)胞結(jié)構(gòu)明顯改善。以上提示，有氧運(yùn)動(dòng)有可能通過抑制糖尿病狀態(tài)下氧化應(yīng)激介導(dǎo)的NF-κB-p65激活，下調(diào)Activated Caspase-3蛋白表達(dá)來減少Nephrin蛋白缺失，進(jìn)而作用于足細(xì)胞，改善足細(xì)胞結(jié)構(gòu)，從而減少蛋白尿的排泄，最終減輕對(duì)糖尿病腎臟的損害。這在有關(guān)NF-κB-p65和相關(guān)蛋白(Activated Caspase-3、Nephrin)與有氧運(yùn)動(dòng)抗糖尿病腎臟損傷的實(shí)驗(yàn)研究中鮮有報(bào)道，本研究發(fā)現(xiàn)，有氧游泳運(yùn)動(dòng)能明顯下調(diào)NF-κB-p65蛋白水平，繼而減弱由其效應(yīng)蛋白Activated Caspase-3和Nephrin引起的2型糖尿病大鼠腎臟損傷效應(yīng)。

4 小結(jié)

在本實(shí)驗(yàn)條件下，6周有氧游泳訓(xùn)練可以影響2型糖尿病大鼠血糖，改善其腎功能，并減輕大鼠腎臟早期損傷。其機(jī)制可能與運(yùn)動(dòng)的抑制氧化應(yīng)激介導(dǎo)的2型糖尿病大鼠腎臟NF-κB-p65的激活，改善效應(yīng)蛋白Activated Caspase-3異常表達(dá)來恢復(fù)足細(xì)胞Nephrin蛋白的表達(dá)，而改善大鼠腎臟損傷的保護(hù)作用有關(guān)。在有效控制血糖的基礎(chǔ)上，氧化應(yīng)激/NF-κB-p65及相關(guān)蛋白(Activated Caspase-3、Nephrin)有可能成為運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練改善2型糖尿病腎病變的新靶點(diǎn)。

[1]姜勤佳，陳雅，袁春華.不同強(qiáng)度有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)糖尿病腎臟疾病大鼠腎功能影響研究[J].山西體育科技，2012，32(3):15-18.

[2]吳燕.糖尿病腎病診斷及治療規(guī)范[J].腎臟病與透析腎移植雜志,2004,13(5):463-465.

[3]熊盈,陳思嬌,李紅燕.雷帕霉素減少GK糖尿病大鼠腎臟細(xì)胞凋亡及其機(jī)制[J].中國(guó)糖尿病雜志,2011,19 (4):302-306.

[4]朱玲娜，唐麗琴.糖尿病腎病中氧化應(yīng)激對(duì)炎癥細(xì)胞因子的影響[J].安徽醫(yī)藥，2012，16(9)：1226-1229.

[5]CHEN C L,HUANG R F,CHEN Y H,etal.Folate defieiency-induced oxidative stress and apoptosis are mediated via homocysteine-dependent over production of hydrogen peroxide and enchanced activation of NF-kB inhuman HepG2 cells[J].Biomed Pharmacother,2001,55(8):434-442.

[6]JIA Q Q,WANG J C,LONG J,etal.Sesquiterpene lactones and their derivatives inhibit high glucose-induced NF -κB activation and MCP-1 and TGF-β1 expression in rat mesangial cells[J].Molecules,2013,18(10):13061-13077.

[7]KURDAK H,SANDIKC S,ERGEN N.The effects of regular aerobic exercise on renal functions in streptozotocin induced diabetic rats[J].J Sports Sci Med,2010,9(2)：294-299.

[8]KESTILA M,LENKKERIL U,MANNIKKO M,etal.Positionally cloned gene for a novel glomerular protein- nephrin-is mutated in congenital nephrotic syndrome[J].Mol Cell,1998,1(4):575-582.

[9]LANGHAM R G，KELLY D J，COX A J,etal.Proteinuria and the expression of the podocyte slit diaphragm protein,nephrin,in diabetic nephropathy:effects of angiotensin converting enzyme inhibition[J].Diabetologia,2002,45(11):1572- 1576.[10]LEE E Y,KIM G T,HYN M,etal.Peroxisome proliferator-activated receptor-δ activation ameliorates albuminuria by preventing nephrin loss and restoring podocyte integrity in type 2 diabetes[J].Nephrol Dial Transplant,2012,27(11):4069-4079.[11]LIN C L，WANG F S，HSU Y C，etal.Modulation of Notch-1 signaling alleviates VEGF-mediated diabetic ne- phropathy[J].Diabetes，2010，59(8):1915-1925.

[12]MERTENS P R,RAFFETSEDER U，RAUEN T.Notch receptors:a new target in glomerular diseases[J].Nephrol Dial Transplant,2008,23(9):2743-2745.

[13]NIELSE S，SCHMITZ A,MOGENSEN C E.Rate of Progression of nephropathy in Normal and microalbuminurial type Ⅱ diabetic patients[J].Diabetologia,1991,34(suppI2):A144.

[14]NIRANJAN T,MUREA M,SUSZTAK K.The pathogenic role of Notch activation in podocytes[J].Nephron Exp Nephrol,2009,(4):e73-79.

[15]NIRANJAN T,BIELESZ B.The Notch pathway in podocytes plays a role in the development of glomerular disease[J].Nature Med,2008,14(3):290- 298.

[16]PLOUG T,STALLKNECHT B M,PEDERSEN D,etal.Effeet of endurance training on glucose transport capacity and glucose transporter expression in rat skeletal muscle[J].Am J Physiol,1990,259(6Pt1):778-786.

[17]REED M J,MESZAROS K,ENTES L J,etal.A new rat model of type 2 diabetes:the fat fed,streptozotoc in treated rat[J].Metabolism,2000,49(11):1390-1394.

[18]SOMINENI H K,BOIVIN G P，ELASED K M.etal.Daily exercise training protects against albuminuria and angiotensin converting enzyme 2 (ACE2) shedding in db/db diabetic mice[J].J Endocrinol，2014,221(2):235-251.

[19]SRIWIJTKAMOL A Q,CHRIST-ROBERTS C,BERRIA R,etal.Reduced skeletal muscle inhibitor of KappaB bête content is associated with insulin resistance in subjects with type 2 diabetes:reversal by exercise training[J].Diabetes,2006,55(3):760-767.

[20]THANDAVARAYAN R A,GIRIDHARAN V V,SARI F R,etal.Depletion of 14-3-3 protein exacerbates cardiac oxidative stress,inflammation and remodeling process via modulation of MAPK/NF-κB signaling pathways after streptozotocin -induced diabetes mellitus[J].Cell Physiol Biochem,2011,28(5):911 -922.[21]TORICES S,ALVAREZ-RODRIGUEZ L,GRANDE L,etal.A truncated variant of ASCC1,a novel Inhibitor of NF-κB,Is associated with disease severity in patients with rheumatoid arthritis[J].J Immunol,2015,195(11):5415-5420.[22]TSAI J,ZHANG R,QIU W,etal.Inflammatory NF-kappaB activation Promotes hepatic apolipoprotein B100 secretion:evidence for a link between hepatic inflammation and lipoprotein Production[J].Physiol Gastrointest Liver Physiol,2009,296(6):G1287-G1298.

[23]XIAO H，Li Y，QI J，etal．Peroxynitrite plays a key role in glomerular lesions in diabetic rats[J].J Nephrol， 2009，22(6):800-808.

[24]YANG L，TANG X，LI P H,etal.Effect of siRNA targeting CTGF on the decreased expression of nephrin and podocin induced by high glucose in mouse podocyte[J].J China Med Univ，2011，40( 6):512-515.

[25]ZHU Y，LU L.Relationship between glomerular nephrin expression and oxidative stress reaction in rats with adriamycin-induced nephrosis[J].Chin J Contemp Pediatr，2009，11(1):56-60.

本刊聲明

《體育科學(xué)》為國(guó)家社會(huì)科學(xué)基金資助期刊，不收取任何費(fèi)用，特此聲明。

《體育科學(xué)》編輯部

2016年8月10日

The Effects and Mechanism of Exercise Training on the Expression of NF-κB-p65 and Related Protein in kidney Tissue of Type 2 Diabetes Rats

ZHU Hong-zhu1，RUAN Xiao-juan1，ZHU Mei-ju1，ZENG Zhi-gang1，XIAO Guo-qiang2

Objective: To investigate the effect of exercise training on NF-κB-p65 and related proteins in type 2 diabetic rats and its mechanism.Methods: The model of type 2 diabetic rats was established through SD rats fed high-fat diet for six weeks together with intraperitoneal infecting after a low dose of STZ.The model rats were randomly divided into diabetic control group(B)and diabetic exercise group(C)with intervention of exercise for six weeks,additionally provided normal control group(A)without any intervention.We examined blood glucose concentrations and the excretion of 24 h microalbuminuria(UAE),and T-SOD activity and MDA content and the expressions of NF-κB-p65,Activated Caspase-3 and Nephrin in the renal cortex and glomerular ultrastructure changes were observed by electron microscope after the experiment end.Results: 1) Group B could be found that it had glomerular wall oozing with the adhesions and part of telangiectasia,obvious glomerular basement membrane foot process fusion and so on,while the above glomerular injury improved significantly in Group C with exercise through electron microscope.2) Compared with Group B,the concentrations of blood glucose and 24 h UAE in Group C decreased significantly (P<0.05 orP<0.01).3) Compared with Group B,the activity of T-SOD in Group C increased significantly,while the content of MDA decreased significantly (P<0.05 orP<0.01).4) Compared with Group B,the expressions of NF-κB-p65 and Activated Caspase-3 significantly decreased,while Nephrin in Group C of the renal cortex significantly increased (P<0.05 orP<0.01).Conclusion: Exercise could improve blood glucose and renal function,and decrease renal injure for type 2 diabetes,which may be related to decreasing the protein over-expression of NF-κB-p65 induced by oxidative stress and Activated Caspase-3 activity,while increasing of Nephrin expression in type 2 diabetes after exercise.

type2diabetes；exercisetraining；renalinjury；NF-κB-p65；relatedproteins；rats

1000-677X(2016)08-0050-06

10.16469/j.css.201608004

2016-03-02；

2016-06-24

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31360255)；江西省教育廳科技項(xiàng)目(GJJ150770)；井岡山大學(xué)自然科學(xué)研究項(xiàng)目(JZB1313)。

朱洪竹(1971-)，女，湖南婁底人，講師，博士，主要研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)與慢性病防治的機(jī)理研究，Tel:(0796)8100491，E-mail：zhuhongzhu 2007 @163.com；肖國(guó)強(qiáng)(1949-)，男，湖北武漢人，教授，博士，博士生導(dǎo)師，主要研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)生理學(xué)，Tel:(020)39310273，E-mail：Xiaogqde163.com；阮曉娟(1971-)，女，江西吉安人，講師，碩士，主要研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)與健康，Tel:(0796)8100491，E-mail：465497200@qq.com。

1.井岡山大學(xué) 體育學(xué)院，江西 吉安 343009；2.華南師范大學(xué) 體育科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510006 1.Jinggangshan University,Ji’an 343009,China；2.South China Normal University,Guangzhou 510631,China.

G804.7

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