張珍林

(皖西學院 生物與制藥工程學院，安徽 六安 237012)

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酶法制備南瓜籽殼纖維低聚糖

張珍林

(皖西學院 生物與制藥工程學院，安徽 六安 237012)

以南瓜籽殼纖維為原料，采用酶法制備纖維低聚糖，并結(jié)合高效液相色譜法(HPLC)進行定量測定。結(jié)果表明：利用β-葡聚糖酶在酶解溫度50 ℃、酶解時間2.5 h、酶用量4 U/g的情況下酶解，可以得到較高比例的葡萄糖、纖維二糖、纖維三糖和纖維四糖，最終計算纖維低聚糖得率為12.2 g/100 g。

南瓜籽殼纖維；纖維低聚糖；β-葡聚糖酶

南瓜一種葫蘆科植物的果實，具有全面而又豐富的營養(yǎng)；南瓜的種籽同樣是國內(nèi)外醫(yī)藥界公認的功能性食品[1]，這種功能性食物目前的利用形式往往都是取籽棄殼。查文獻知道，正常狀態(tài)下，殼占整個南瓜籽的重量的60%，假若某地一年產(chǎn)南瓜籽5萬噸，那就相當于約3萬噸的殼可能被遺棄，據(jù)醫(yī)學研究報告，南瓜籽殼能作為某些特殊功能藥劑的原料，使糖尿病患者和高血壓患者有明顯的醫(yī)療康復作用和緩解作用[2-4]，這塊巨大的資源能盡快地開發(fā)和利用，不僅可以避免環(huán)境污染，又可以增加種植者的收益。

纖維低聚糖亦稱纖維寡糖(cello-oligosaccharide)，文字描述指具有2～10個葡萄糖單體通過β-1,4糖苷鍵鏈接而成的線性低聚糖，具有一定功能性的低聚糖；這種寡糖能促進人和動物體腸道雙歧桿菌增殖，利于腸道蠕動，同時腸道也不會吸收[5-7]。另外，由于纖維低聚糖帶有甜味，甜度約為蔗糖的30%～40%，可以作為食品的甜味添加劑，代替蔗糖用于糖尿病患者的食品(如纖維二糖、纖維三糖)。β-1,4糖苷鍵的鏈接使得纖維低聚糖產(chǎn)生了如下的特性：結(jié)構(gòu)剛性強、分子質(zhì)量小、穩(wěn)定性好等[8-10]，加大了應用范圍，提高了應用前景。

現(xiàn)在測定纖維低聚糖的方法有很多，考慮本實驗測定物料的要求，選用高效液相色譜法(HPLC)是最簡單、最快速、最精確；運用HPLC法，以紫外檢測器對南瓜籽殼粉中的纖維低聚糖組分進行測定。結(jié)合酶法制備纖維低聚糖，為南瓜籽殼纖維低聚糖的定向制備提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

南瓜籽殼粉，自制；β-葡聚糖酶，武漢宏信康精細化工有限恭喜；葡萄糖、纖維二糖、纖維三糖、纖維四糖標準品，美國AccuStandard公司；氫氧化鈉與乙酸鈉為優(yōu)級純；其他藥品及試劑均為市售分析純。

1.2 儀器與設備

Waters Breeze高效液相色譜系統(tǒng)(配有可變波長紫外檢測器和Rev.A.06.03色譜工作站)；HMBTO1型超微粉碎機；DZF-6050型真空干燥箱；UV-2102C型紫外-可見分光光度計。

1.3 方法

1.3.1 原料預處理

選擇外表光滑、無病蟲害南瓜籽殼洗滌數(shù)次，去除雜質(zhì)，80 ℃烘干后超微粉碎過220目篩備用。采用硝酸-乙醇法[11]測定南瓜籽殼粉的纖維素含量為 44.83%。

1.3.2 纖維低聚糖的制備

1.3.2.1 工藝流程

預處理的南瓜籽殼粉→一定濃度的南瓜籽殼粉懸濁液(加入pH 5.0 檸檬酸緩沖溶液)→酶解(β-葡聚糖酶)→滅酶(100 ℃ 12 min)→抽濾，濾液即為纖維低聚糖溶液。

1.3.2.2 單因素實驗

選擇對酶解南瓜籽殼粉纖維低聚糖影響較大的三個因素，酶解溫度、酶解時間、酶用量，進行單因素實驗。選取不同的單因素條件，酶解溫度(35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃)，酶解時間(1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、7 h)和酶用量(3 U/g、4 U/g、5 U/g、6 U/g、7 U/g、8 U/g、9 U/g)，進行酶解，得到的酶解產(chǎn)物通過HPLC法定量顯示，觀察圖譜發(fā)現(xiàn)不同的單因素條件下，纖維低聚糖各組分的質(zhì)量濃度和比例都不一樣，讀取峰值帶入公式，從而確定最佳的各單因素條件。

1.3.3 纖維低聚糖的HPLC檢測

1.3.3.1 色譜條件

色譜柱：CarboPac 18-100分析柱(4.6 mm×250 mm)，檢測器：紫外檢測器，流動相：3.0 mmol/L 甲醇水溶液，柱溫：40 ℃，進樣量：10 μL，流速：0.8 mL/min。

1.3.3.2 標準溶液的配制及檢測

精確稱取1 mg葡萄糖、纖維二糖、纖維三糖和纖維四糖標準品，溶于10 mL去離子水中，配制成濃度為100 μg/mL的標準品溶液，冷藏保存待測。

1.3.3.3 南瓜籽殼粉樣品檢測

精確稱取0.1 mg經(jīng)過酶解的南瓜籽殼粉樣液，用200 mL去離子水稀釋，得到0.5 μg/mL的稀釋樣液，進樣前需經(jīng)0.45 μm水系濾膜過濾后，用微孔進樣器注入儀器。

1.3.4 纖維低聚糖得率計算

纖維低聚糖得率/%=

×100

2 結(jié)果與分析

2.1 處理樣品的酶制劑選擇

樣品南瓜籽殼粉經(jīng)過一系列的前處理后，組分也就很簡單，基本都是大分子的纖維素，由于纖維素酶的酶系復雜性，酶解時斷開糖苷鍵比較凌亂，得到的酶解產(chǎn)物也不只是低聚糖，增加檢測的復雜性，從根本出發(fā)考慮纖維素是由β-1,4-糖苷鍵連接一系列葡萄糖分子構(gòu)成[12-14]，因此本實驗決定利用β-葡聚糖酶進行酶解，結(jié)合HPLC的定量分析發(fā)現(xiàn)β-葡聚糖酶，能準確地切斷鏈接葡萄糖的β-1,4糖苷鍵，簡便有效地分解出纖維低聚糖的各組分，使得定量更加準確。

2.2 測纖維低聚糖的色譜條件

HPLC法測定含有極性基團的大分子時一般選用水作為流動相，實驗過程發(fā)現(xiàn)，簡單的水流動相不能很好分離纖維低聚糖各組分；通過使用混合流動相甲醇水溶液不僅可以使分離度提高，而且還可以明顯降低分離時間，加入3.0 mmol/L 的甲醇效果最佳?？紤]實驗樣品的本身性質(zhì)，在進行流速設定時，分別為0.5 mL/min、0.8 mL/min、1 mL/min進行預實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，流速為0.8 mL/min時，峰形保留時間恰當，分離效果最佳。

2.3 纖維低聚糖色譜分析

圖1 標準品HPLC圖(注：1纖維四糖；2纖維三糖；3纖維二糖；4葡萄糖)

圖2 樣品HPLC圖(注：1纖維四糖；2纖維三糖；3纖維二糖；4葡萄糖)

標準品及南瓜籽殼粉樣品圖譜如圖1和圖2。通過分析樣品測定圖譜發(fā)現(xiàn)，在色譜圖中通過與標準品單糖保留時間比較后判斷該樣品用β-葡聚糖酶可以酶解出葡萄糖、纖維二糖、纖維三糖和纖維四糖，在樣品圖中除了和單糖圖譜相對應的峰形，距離纖維四糖附近保留6 min處有一明顯色譜峰，通過查資料初步判斷可能是纖維五糖[15]。因此，對進一步分離南瓜籽殼粉中的纖維低聚糖組分提供了一定的基礎。

2.4 標準回歸方程

稀釋標準品溶液按照10、20、40、60、80、100 μg/mL的梯度，經(jīng)0.45 μm水系濾膜過濾后，用微量進樣器分別進樣分析，根據(jù)結(jié)果計算以質(zhì)量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標得標準曲線回歸方程見表1。讀取表1數(shù)據(jù)可以明顯看出，四種糖的線性相關系數(shù)R2均大于0.99，這是四個線性特征非常明顯的實驗模型，可以作為定量的依據(jù)。

表1 標準回歸方程

2.5 最佳酶解溫度

觀察圖3發(fā)現(xiàn)，最佳的酶解溫度應為50 ℃，在50 ℃之前，隨著溫度的升高，產(chǎn)物的質(zhì)量濃度是逐漸增加，達到50 ℃葡萄糖、纖維二糖、纖維三糖和纖維四糖的質(zhì)量濃度最大，繼續(xù)升溫，產(chǎn)物的質(zhì)量濃度又開始下降，說明溫度升高影響了酶的活力，降低了酶的酶解質(zhì)量。因此，本實驗最佳的酶解溫度為50 ℃，通過峰面積計算各組分所占比例，纖維二糖(31.8%)、葡萄糖(26.8%)、纖維三糖(9.45%)、纖維四糖(4.12%)。

圖3 酶解溫度對酶解南瓜籽殼粉纖維低聚糖的影響

2.6 最佳酶解時間

觀察圖4發(fā)現(xiàn)，最佳的酶解時間應為2.5 h，在2.5 h之前，酶解產(chǎn)物各組分的質(zhì)量濃度都是增加狀態(tài)，在2.5 h之后，聚合度小的葡萄糖、纖維二糖濃度繼續(xù)增加，但很慢，聚合度稍大的纖維三糖、纖維四糖濃度則呈現(xiàn)下降的趨勢。分析此原因主要是由于隨著時間的增加β-葡聚糖酶也會隨機切斷聚合度稍大的纖維三糖和纖維四糖，成為聚合度小的纖維二糖和葡萄糖[16]。因此本實驗最佳的酶解時間為2.5 h，通過峰面積計算各組分所占比例，纖維二糖(40.9%)、葡萄糖(32.3%)、纖維三糖(6.21%)、纖維四糖(3.33%)。

圖4 酶解時間對酶解南瓜籽殼粉纖維低聚糖的影響

2.7 最佳酶用量

觀察圖5發(fā)現(xiàn)，最佳的酶用量應為4 U/g，在4 U/g之前，增加酶量，各組分質(zhì)量濃度都是大幅度的增加狀態(tài)，在4 U/g之后，葡萄糖和纖維二糖繼續(xù)增加，纖維三糖稍有下降趨勢，但纖維四糖的量卻在5 U/g時達到最大，此后隨著酶量的加大，纖維三糖和纖維四糖開始減少；分析是由于酶量的加大，體系中游離酶增加，一方面積極酶解大分子低聚糖，另一方面在反應中又進一步酶解了聚合度大的纖維三糖和纖維四糖。因此，綜合考慮本實驗最佳的酶用量4 U/g，通過峰面積計算各組分所占比例，纖維二糖(31.25%)、葡萄糖(22.8%)、纖維三糖(7.75%)、纖維四糖(4.23%)。

圖5 酶用量對酶解南瓜籽殼粉纖維低聚糖的影響

3 結(jié)論

選用β-葡聚糖酶酶解，通過單因素確定了酶解溫度、酶解時間、酶用量三個主要實驗因素的取值范圍，配合HPLC法定量分析，以CarboPac 18-100分析柱(4.6 mm×250 mm)，3.0 mmol/L甲醇水溶液流動相，0.8 mL/min流速檢測南瓜籽殼粉中的纖維低聚糖，同時以標準品的外標法進一步確定了定量的準確性，線性相關系數(shù)R2>0.99，說明該實驗模型很好。質(zhì)量濃度的最大值確定了最佳酶解條件：酶解溫度50 ℃、酶解時間2.5 h、酶用量4 U/g，在此最佳條件上計算纖維低聚糖為12.2 g/100 g。 實驗結(jié)果顯示此法簡便、準確，為后續(xù)開發(fā)南瓜籽殼粉深加工食品提供了一定的基礎資料。

通過HPLC樣品圖譜發(fā)現(xiàn)酶解產(chǎn)物中除了存在葡萄糖、纖維二糖、纖維三糖和纖維四糖外，還可能存在豐富的纖維五糖，但由于標準品的不具備，沒有進一步進行認證實驗，這樣的一個實驗結(jié)果也為繼續(xù)研發(fā)南瓜籽殼的功能特性提供了依據(jù)。

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Preparation of Cello-oligosaccharides from Pumpkin Seeds Shell Fiber by Enzymatic Method

ZHANG Zhenlin

(CollegeofBiologicalandpharmaceuticalEngineering,WestAnhuiUniversity,Lu’an237012,China)

An enzymatic method for the preparation of cello-oligosaccharides from pumpkin seeds shell fiber was developed, and HPLC was used for quantitative determination. The results showed that the hydrolysis obtained after 50 ℃ of hydrolysis with 2.5 h of hydrolysis with 4 U/g β-glucanase contained a high proportion of glucose, cellobiose, cellotriose and cellotetrose, and the yield of cello-oligosaccharides was 12.2 g/100 g under these conditions.

pumpkin seeds shell fiber; cello-oligosaccharides; β-glucanase

2016-05-06

六安市定向委托皖西學院市級研究項目(2013LW020)。

張珍林(1985-)，女，安徽霍邱人，助教，碩士，研究方向：食品研究與開發(fā)。

TS241

A

1009-9735(2016)05-0075-04