康 強，周 鑫，羅 燕，田 青，程建國，趙 位

(1 四川農(nóng)業(yè)大學(xué) a 森林資源保護(hù)與利用實驗室，b 微生物學(xué)實驗室，c 動物醫(yī)學(xué)院，四川 都江堰 611830；2 四川養(yǎng)麝研究所，四川 都江堰 611830)

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林麝糞便基因組DNA的提取及PCR擴增

康 強1a，周 鑫1b,1c，羅 燕1b，田 青1b,1c，程建國2，趙 位1b,1c

(1 四川農(nóng)業(yè)大學(xué) a 森林資源保護(hù)與利用實驗室，b 微生物學(xué)實驗室，c 動物醫(yī)學(xué)院，四川 都江堰 611830；2 四川養(yǎng)麝研究所，四川 都江堰 611830)

【目的】 探索從林麝糞便中提取基因組DNA并進(jìn)行物種鑒定的可行性，為林麝野外調(diào)查工作以及分子糞便學(xué)在林麝保護(hù)中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)?！痉椒ā?采集林麝糞便，采用改良的CTAB抽提基因組DNA；按常規(guī)PCR法對mtDNA D-loop區(qū)和Cytb基因進(jìn)行擴增測序后，用DNAMAN 6.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析；在不同溫度存放不同時間，研究林麝糞便基因組DNA的提取與mtDNA D-loop區(qū)和Cytb基因PCR擴增的時效性?！窘Y(jié)果】 以提取的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴增均能特異性地擴增出mtDNA D-loop區(qū)和Cytb基因。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明：所擴增產(chǎn)物為林麝的mtDNA D-loop區(qū)和Cytb基因。時效性分析結(jié)果顯示：常溫和4℃條件下保存96 h以內(nèi)的林麝糞便所提取的基因組DNA能有效擴增出mtDNA D-loop區(qū)和Cytb基因?！窘Y(jié)論】 自然條件下林麝糞便中林麝自身體細(xì)胞DNA保存時間較長，通過在野外采集林麝糞便提取基因組DNA并進(jìn)行物種鑒定是可行的。

林麝；糞便；線粒體DNA；D-loop區(qū)；Cytb基因

林麝(Moschusberezovskii)是我國一級保護(hù)動物，已被列入CITES附錄Ⅰ中[1]。林麝是典型的林棲動物，多棲居在海拔2 000～3 800 m的針闊混交林和陰暗針葉林內(nèi)，其嗅覺和聽覺都比較發(fā)達(dá)，但性情膽怯常在黃昏后或拂曉時分進(jìn)行活動[2]。因此，在對野外林麝的行為生態(tài)學(xué)和分子進(jìn)化遺傳學(xué)等研究中，通過直接捕獲動物獲取用于分子生物學(xué)相關(guān)研究的材料較為困難。近年來，在對野生動物進(jìn)行保護(hù)研究時，人們常采用不觸及或不傷害動物體本身，通過收集其掉落的毛發(fā)和排放的糞便等非損傷性取樣方法進(jìn)行采樣[3]。而在所有的非損傷性取樣中，收集糞樣對動物是干擾最小且最容易收集的。隨著分子糞便學(xué)的發(fā)展，利用糞樣來提取基因組DNA，具有巨大的潛在應(yīng)用價值[4]。

目前糞便基因組DNA提取的方法主要有酚-氯仿抽提法、Chelex-100 煮沸法、硫氰酸胍裂解法、淀粉吸附法以及商業(yè)試劑盒法等[5-6]。但因各種動物食性的差異及糞便所在野外環(huán)境的不同等因素影響，不同動物糞便基因組DNA的提取常選取不同的程序[7]。2003年，鐘華等[8]采用預(yù)處理-酚/氯仿抽提法對大熊貓糞便DNA提取方法進(jìn)行了改進(jìn)，使所提DNA的PCR擴增變得更加容易。2004年，張保衛(wèi)等[9]采用自創(chuàng)改進(jìn)方案從大熊貓和小熊貓糞便中提取到高質(zhì)量的DNA，能有效進(jìn)行相關(guān)基因擴增。2008年，劉宇慶等[10]根據(jù)狗獾的食性特征結(jié)合多種糞便DNA提取方法優(yōu)化了狗獾糞便DNA提取方案。近年來，國內(nèi)外在對林麝進(jìn)行遺傳學(xué)分析或系統(tǒng)發(fā)育分析時，已采取多種方式進(jìn)行基因組DNA的提取。2011年，馮慧等[11]對20世紀(jì)50年代左右林麝熟制標(biāo)本皮張DNA進(jìn)行了提取，通過對Cytb基因的擴增分析證實，盡管DNA提取物中DNA含量較少，但其線粒體DNA保存較好，能夠擴增出特異性條帶。2012年，白康等[12]通過PCR儀法對采集的林麝毛發(fā)樣本進(jìn)行基因組DNA提取，得到的DNA濃度高、純度好，PCR產(chǎn)物條帶清晰、位置正確。目前，采用糞便為材料提取林麝基因組DNA的報道較少。

本研究結(jié)合多種糞便基因組DNA提取方法[13-16]，對林麝糞便基因組DNA提取方案進(jìn)行優(yōu)化，通過對線粒體的保守區(qū)域Cytb基因[17]以及進(jìn)化最快的D-loop區(qū)[18-19]進(jìn)行PCR擴增,驗證該方法的可靠性；另外，通過設(shè)置溫度差異性處理和時間間隔變量，再進(jìn)行mtDNA D-loop區(qū)和Cytb基因的擴增，探索了不同溫度與時間下糞樣擴增mtDNA D-loop區(qū)和Cytb基因的變化情況，對林麝野外調(diào)查工作以及分子糞便學(xué)在物種鑒定和林麝保護(hù)中的應(yīng)用具有一定的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 林麝糞樣 林麝糞便樣品采自四川養(yǎng)麝研究所白沙養(yǎng)麝場和馬爾康養(yǎng)麝場，各10份，糞樣的采集在林麝便后數(shù)分鐘內(nèi)進(jìn)行。林麝新鮮糞樣用無菌自封袋采集，做好標(biāo)記后迅速放入有冰袋的冰盒中帶回實驗室，4 ℃保存。

1.1.2 主要試劑TaqDNA聚合酶、10×TaqDNA Reaction Buffer、dNTPs、DNA Marker (DL2000)、Gold View、普通產(chǎn)物純化試劑盒(DP204)、瓊脂糖凝膠回收試劑盒(DP209)等，均購自天根生物有限公司。

1.2 林麝糞樣mtDNA D-loop區(qū)和Cytb基因擴增引物

根據(jù) NCBI上提供的林麝Cytb基因全堿基序列，用primer premier 5.0 軟件設(shè)計Cytb基因引物；mtDNA D-loop區(qū)PCR擴增引物參見文獻(xiàn)[20]。2對引物均由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，其相關(guān)信息見表1。

表 1 mtDNA D-loop區(qū)和Cyt b基因的PCR引物序列

1.3 林麝糞樣基因組DNA的提取

林麝糞便基因組DNA的提取按如下方法進(jìn)行。(1)取林麝糞便6～7粒(約600 mg)于5 mL離心管中，用鑷子將其夾碎，加入2 mL 0.9%的生理鹽水，間歇振蕩1 min至樣本混勻，12 000 r/min 離心2 min，棄上清液。

(2)向沉淀中加入2 mL十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)裂解緩沖液(CTAB 55 mmol/L， NaCl 1.4 mol/L，pH 8.0的Tris-HCl 100 mmol/L，pH 8.0的EDTA 20 mmol/L)振蕩混勻30 s，置65 ℃水浴2 h。

(3)將上述裂解液渦旋15 s，12 000 r/min 離心4 min，轉(zhuǎn)移上清液1.5 mL至新的5 mL離心管，等體積加入飽和酚-氯仿-異戊醇(V(飽和酚)∶V(氯仿) ∶V(異戊醇)=25∶24∶1)間歇振蕩10 min，12 000 r/min 離心10 min。取上清液至新的5 mL離心管重復(fù)該步驟1次。

(4)取上清液按10∶1∶20的體積比分別加入上清液、3 mol/L NaAc和冰預(yù)冷無水乙醇，溫和地上下翻轉(zhuǎn)數(shù)次，混勻后置-20 ℃冰箱1 h。

(5)將(4)的提取液12 000 r/min 離心10 min，棄上清，加入1 mL 體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇溶液，用移液器輕輕吹打混勻，12 000 r/min 離心2 min，棄上清，室溫放置數(shù)分鐘至沉淀干燥。加入200 μL TE 緩慢混勻溶解沉淀，最后用普通產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行純化，得到的林麝糞便基因組DNA置-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 林麝糞樣mtDNA D-loop區(qū)和Cytb基因的PCR擴增與測序分析

以提取的林麝糞便基因組DNA為模板，以F1/R1與F2/R2為引物分別進(jìn)行mtDNA D-loop區(qū)和Cytb基因的PCR擴增。PCR擴增采用50 μL反應(yīng)體系：10×TaqDNA Reaction Buffer 5.0 μL，上、下游引物各2 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4 μL，2.0 UTaqDNA聚合酶，基因組DNA 1 μL，最后加ddH2O補足至50 μL。擴增程序：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性1 min，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，30次循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠(電壓80 V)電泳檢測，瓊脂糖凝膠回收試劑盒(DP209)回收目的片段后送生工(上海測序部)測序。

林麝糞樣mtDNA D-loop區(qū)和Cytb基因PCR擴增測序結(jié)果用Blast在NCBI上進(jìn)行比對分析，用DNAMAN 6.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。其中選取林麝(Moschusberezovskii)、安徽麝(Moschusanhuiensis)、馬鹿(Cervuselaphus)、梅花鹿(Cervusnippon)、馴鹿(Rangifertarandus)、牛(Bostaurus)相關(guān)序列進(jìn)行mtDNA D-loop區(qū)系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建；選取赤麂(Muntiacusmuntjak)、馬鹿(Cervuselaphus)、大角鹿(Megalocerosgiganteus)、馬麝(Moschuschrysogaster)、安徽麝(Moschusanhuiensis)、林麝(Moschusberezovskii)、黑麝(Moschusfuscus)、喜馬拉雅麝(Moschusleucogaster)、山羊(Caprahircus)、捻角山羊(Caprafalconeri)、長頸羚(Litocraniuswalleri)、東高加索羱羊(Capracylindricornis)、大角驢羚(Kobusmegaceros)、黑驢羚(Kobuslechesmithemani)相關(guān)序列進(jìn)行Cytb基因系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建。

1.5 林麝糞樣mtDNA D-loop區(qū)和Cytb基因PCR擴增的時效性

先將20份林麝糞便分別編號為1～20,然后將其各分出一半分別對應(yīng)編號為1′～20′。接著將樣品1～20置于4 ℃保存，樣品1′～20′置于室溫保存(10～20 ℃，平均相對濕度70%)。在保存期間每隔12 h分別隨機取樣進(jìn)行基因組DNA提取以及mtDNA D-loop區(qū)和Cytb基因的PCR擴增，觀察電泳結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 林麝糞便mtDNA D-loop區(qū)和Cytb基因的PCR擴增

以提取的林麝糞便基因組DNA為模板進(jìn)行mtDNA D-loop區(qū)和Cytb基因的PCR擴增，凝膠電泳結(jié)果顯示兩者PCR擴增條帶皆與目標(biāo)條帶預(yù)期大小一致(圖1)。PCR產(chǎn)物測序后將測序結(jié)果提交至NCBI并進(jìn)行Blast比對，結(jié)果顯示測序序列分別與林麝的mtDNA D-loop區(qū)和Cytb基因序列具有很高的同源性(≥99%)，即所擴增基因均為目的基因。

2.2 林麝糞樣mtDNA D-loop區(qū)和Cytb基因擴增序列分析

mtDNA D-loop區(qū)和Cytb基因各自的系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建結(jié)果如圖2和圖3所示。從林麝糞樣Cytb基因系統(tǒng)發(fā)育樹圖(圖3)可以看出，本研究中測定的Cytb基因序列(FMD1_Cyt_b)在系統(tǒng)發(fā)育樹上同時與馬麝、安徽麝和林麝有著很近的進(jìn)化距離，單從Cytb基因序列無法進(jìn)行具體的種屬鑒定。但從林麝糞樣mtDNA D-loop區(qū)基因系統(tǒng)發(fā)育樹圖(圖2)可以看出，所擴增序列與鹿科的馬鹿、梅花鹿等有著明顯的分支，而與麝屬的林麝、安徽麝有著明顯的聚類趨勢，并且與林麝有著很近的進(jìn)化距離，因此可以特異性地判定所擴增序列為林麝mtDNA D-loop區(qū)序列。

M.DNA Marker(DL2000)； 1.林麝糞樣擴增產(chǎn)物

圖 2 林麝糞便mtDNA D-loop區(qū)系統(tǒng)發(fā)育樹圖

圖 3 林麝糞便Cyt b基因系統(tǒng)發(fā)育樹圖

2.3 林麝糞便mtDNA D-loop區(qū)和Cytb基因的時效性

林麝糞樣在不同條件(4 ℃和室溫)下保存，每隔12 h分別隨機取2份同一樣品不同溫度處理的糞便樣品進(jìn)行基因組DNA提取與mtDNA D-loop區(qū)和Cytb基因的PCR擴增，電泳結(jié)果如圖4和圖5所示。從圖4和圖5可知，林麝糞便在4 ℃及常溫處理條件下，于96 h內(nèi)都能夠特異擴增出mtDNA D-loop區(qū)和Cytb基因序列，說明林麝糞便可以在常溫條件下有效保存較長時間。

M.DNA Marker (DL2000)；1～8.依次為排便后12,24,36,48,60,72,84,96 h 樣品擴增產(chǎn)物 Samples

3 討 論

本研究對林麝糞便樣品提取基因組DNA并進(jìn)行了mtDNA D-loop區(qū)和Cytb基因的PCR擴增，提取的20份林麝糞便基因組DNA都擴增出了這2個基因，說明從林麝糞便中提取基因組DNA并進(jìn)行分子檢測的成功率較高；同時，時效性研究結(jié)果表明，林麝糞便可以在常溫條件下有效保存較長時間，說明分子糞便學(xué)在林麝野外采樣調(diào)查工作中的應(yīng)用是可能的。

在利用mtDNA D-loop區(qū)與Cytb基因進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建以鑒定動物種屬關(guān)系時，單一的分子鑒定結(jié)果有時并不能很好地進(jìn)行物種鑒定，需要結(jié)合多種分子鑒定結(jié)果進(jìn)行物種的精細(xì)定位。彭紅元等[21]結(jié)合線粒體Cytb、16S rRNA等基因?qū)甑姆肿酉到y(tǒng)進(jìn)化地位進(jìn)行了再研究，結(jié)果表明在不同基因以及序列長度分析中，不同的物種數(shù)目及分析方法對研究結(jié)果產(chǎn)生明顯影響。

糞便基因組DNA的提取方法有多種，常規(guī)的有硫氰酸胍裂解法、Chelex-100 煮沸法和酚-氯仿抽提法等[7]。林麝為植食性動物，其糞便中含有大量的植物殘渣、消化液、色素、膽鹽、蛋白等雜質(zhì)，針對其植食性特點本試驗設(shè)計并利用基于CTAB法并結(jié)合產(chǎn)物純化回收試劑盒來提取林麝糞便基因組DNA。由于林麝糞便中本身含有大量的腸壁脫落細(xì)胞、微生物細(xì)胞以及植物細(xì)胞等，所以提取的糞便基因組DNA為林麝腸道脫落細(xì)胞基因組DNA、腸道微生物基因組DNA以及其他未消化植物殘渣基因組DNA的混合物。從本研究中mtDNA D-loop區(qū)和Cytb基因的PCR結(jié)果來看，所擴增出的目的條帶單一，大小準(zhǔn)確，序列NCBI比對結(jié)果吻合，說明背景DNA物質(zhì)對其PCR效果干擾很小，適合用于林麝物種鑒定。本研究試驗前期在對林麝糞便進(jìn)行基因組DNA提取時林麝糞便用量較少，結(jié)果未能很好地擴增出mtDNA D-loop區(qū)和Cytb基因，這可能是由于糞便中消化道脫落細(xì)胞含量較少，而且遺傳物質(zhì)會存在一定的降解；之后增加了林麝糞便用量，所提取基因組DNA的PCR擴增效果得到了較大改善。在野外調(diào)查工作中，工作人員通常以動物毛發(fā)、糞便形狀、活動痕跡等外觀性狀對動物進(jìn)行分類，而在野生環(huán)境中很多動物尤其是親緣性較近的種其形態(tài)特征、生活習(xí)性十分相近，僅僅依靠野外觀察往往難以確定一個生態(tài)系統(tǒng)中的物種組成以及它們之間的演替關(guān)系。林麝生性膽小懦怯，對周圍環(huán)境變化十分敏感，傳統(tǒng)的如血液、毛發(fā)等采樣方法對林麝應(yīng)激較大，而糞便采集對林麝的影響較小。同時，該研究證明從林麝糞便中可提取基因組DNA，且能夠通過糞便基因組DNA的遺傳信息特異性分析動物種屬進(jìn)化關(guān)系等。因此分子手段的加入定能使野外調(diào)查工作更加準(zhǔn)確高效。

4 結(jié) 論

本研究采用改良CTAB法對常溫和4 ℃條件下保存96 h內(nèi)的林麝糞便進(jìn)行基因組DNA的提取，所提取的基因組DNA能有效擴增出林麝自身基因組mtDNA D-loop區(qū)和Cytb基因。該研究表明在自然條件下林麝糞便中林麝自身體細(xì)胞DNA有較長的保存時間，通過采集野外林麝糞便進(jìn)行基因組DNA的提取并進(jìn)行物種鑒定的方法是可行的。

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Extraction and PCR amplification of genomic DNA of forest musk deer feces

KANG Qiang1a,ZHOU Xin1b,1c,LUO Yan1b,TIAN Qing1b,1c, CHENG Jianguo2,ZHAO Wei1b,1c

(1 aLabofForestResourceProtectionandUtilization,bLabofMicrobiology, cCollegeofVeterinaryMedicine，SichuanAgriculturalUniversity,Dujiangyan，Sichuan611830，China; 2SichuanInstituteofMuskDeerBreeding,Dujiangyan,Sichuan611830,China)

【Objective】 This study explored the feasibility of genomic DNA extraction and species identification from forest musk deer feces to provide scientific basis for field investigation and application of deer molecular scatology in protection of forest musk deer.【Method】 Genomic DNA of forest musk deer feces was extracted by the modified CTAB extraction method.Cytbgene and mtDNA D-loop region were amplified by PCR.Both sequences were analyzed by DNAMAN 6.0 software.The timeliness of genomic DNA extraction and PCR amplification of mtDNA D-loop region andCytbgene was investigated at different temperatures.【Result】 Genomic DNA of forest musk deer feces could be extracted,and the phylogenetic analysis showed that both mtDNA D-loop region andCytbgene could be amplified.Timeliness analysis showed that mtDNA D-loop region andCytbgene could be specifically amplified within 96 h at both room temperature and 4 ℃.【Conclusion】 The DNA of musk deer in feces can be preserved at a long time under natural conditions.It is feasible to conduct species identification by collecting forest musk deer feces in the wild.

forest musk deer;feces;genomic DNA;D-loop region;Cytbgene

時間:2016-10-09 10:08

10.13207/j.cnki.jnwafu.2016.11.001

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20161009.1008.002.html

2015-06-04

四川省林業(yè)廳省級自然保護(hù)區(qū)重點物種科學(xué)研究項目；四川農(nóng)業(yè)大學(xué)院級專項

康 強(1963-)，男，四川彭州人，副教授，本科，主要從事森林資源管理及保護(hù)研究。E-mail：283755855@qq.com

羅 燕(1974-)，女，四川都江堰人，教授，博士，主要從事野生動物保護(hù)及病原微生物與分子生物學(xué)研究。 E-mail：lycjg@163.com

S865.4+1

A

1671-9387(2016)11-0001-07