李 冰，李 梁，王露露，董思敏，黃寶亮，張 晶

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 中藥材學(xué)院，吉林 長春 130118)

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鹿茸膠原多肽復(fù)合酶水解工藝研究

李 冰，李 梁，王露露，董思敏，黃寶亮，張 晶

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 中藥材學(xué)院，吉林 長春 130118)

【目的】 對鹿茸膠原多肽進(jìn)行復(fù)合酶水解，優(yōu)化水解工藝，并測定水解液分子量分布?！痉椒ā?以堿性蛋白酶和胰蛋白酶為供試酶類，選用酶解時(shí)間、pH值、酶解溫度、加酶量為影響因素，采用響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化單酶水解條件，根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)所得到的單酶水解的最適條件，確定雙酶復(fù)合水解方案。通過 Sephadex G25測定鹿茸膠原多肽的分子量分布?！窘Y(jié)果】 堿性蛋白酶最優(yōu)水解條件為：酶解時(shí)間3.6 h，pH值10.50，酶解溫度55 ℃，加酶量4%，水解液的水解度為22.03%；胰蛋白酶最優(yōu)水解條件為：酶解時(shí)間3.2 h，pH值8.00，酶解溫度50 ℃，加酶量 4.4%，水解液的水解度為15.81%。復(fù)合酶水解條件：酶解溫度為52.5 ℃，調(diào)節(jié)pH值為10.50，加入4%的堿性蛋白酶酶解3.6 h；調(diào)節(jié)pH值至8.00，加入4.4%的胰蛋白酶酶解3.2 h，所得水解液的水解度可達(dá)33.42%。復(fù)合酶水解膠原多肽的分子量分布在400～1 400 u?！窘Y(jié)論】 確定了鹿茸膠原多肽堿性蛋白酶和胰蛋白酶復(fù)合水解的工藝條件。

鹿茸；響應(yīng)面試驗(yàn)；復(fù)合酶水解；膠原多肽

鹿茸是鹿科動物雄性梅花鹿(CervusnipponTemminck)或馬鹿(CervuselaphusL.)未骨化密生絨毛的幼角[1]?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》中記載鹿茸“味甘、性溫、主漏下惡血，寒熱驚痢，益氣強(qiáng)志，生齒不老”[2]。通過對多種品系鹿茸中化學(xué)成分的分析發(fā)現(xiàn)，鹿茸中粗蛋白質(zhì)含量占干質(zhì)量的50%以上，而其中膠原蛋白則為含量最高的蛋白質(zhì)[3-4]。膠原蛋白起著支撐器官、保護(hù)機(jī)體的功能，具有很強(qiáng)的生物活性和生物功能[5]，但膠原蛋白分子質(zhì)量為300 ku，不溶于水，不易被人體吸收利用[6]。膠原多肽是膠原蛋白的水解產(chǎn)物，其進(jìn)入人體后，可直接被腸道吸收，在提高機(jī)體免疫力、增強(qiáng)抗病能力、維護(hù)健康方面有顯著的功效[7-9]。膠原多肽因具有保濕、抗氧化和抗衰老等功效[10-12]，已被廣泛地應(yīng)用于醫(yī)藥、化妝品、保健品等高附加值多肽產(chǎn)品中[13]。由于蛋白酶對肽鍵作用具有專一性，在單酶水解時(shí)，只能從幾個(gè)固定的氨基酸殘基處進(jìn)行水解，水解程度受到限制。為了得到分子質(zhì)量更小的水解產(chǎn)物，采用復(fù)合酶水解是一種趨勢。本研究采用響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化鹿茸膠原多肽單酶水解過程，并進(jìn)一步對復(fù)合酶水解過程進(jìn)行探討，建立了鹿茸膠原多肽堿性蛋白酶和胰蛋白酶復(fù)合水解的工藝條件，旨在更大程度上提高鹿茸膠原蛋白的水解度，使水解物分子質(zhì)量更小，為其多肽產(chǎn)品的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 鹿茸膠原蛋白粉 鹿茸膠原蛋白粉，實(shí)驗(yàn)室自制，純度為72%左右(采用羥脯氨酸比色法測定)。

1.1.2 試 劑 磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉、鹽酸，均為分析純。胰蛋白酶，北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)；堿性蛋白酶、還原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽、VC、VB12，上海瑞永生物科技有限公司生產(chǎn)。

1.1.3 儀器與設(shè)備 PB-10酸度計(jì)(德國賽多利斯公司)，紫外可見分光光度計(jì)(上海元析儀器有限公司)，SBS-100數(shù)控計(jì)滴自動部分收集器(上海青浦滬西儀器廠)，數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司)，冷凍干燥機(jī)(北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)，20 mm×40 cm Sephadex G25層析柱。

1.2 方 法

1.2.1 水解度(DH)的測定 DH是指蛋白質(zhì)中的肽鍵被水解的百分?jǐn)?shù)，即DH=h/htot，其中h為蛋白質(zhì)水解后每克蛋白中被裂解肽鍵的物質(zhì)的量(mmol/g)，htot指每克原料蛋白中肽鍵的物質(zhì)的量。本試驗(yàn)DH的測定采用pH-stat法[14]。水解過程中用0.1 mol/L的NaOH來控制pH值，使其保持基本不變。由于鹿茸膠原蛋白水解產(chǎn)生氨基酸使pH值下降，所以可根據(jù)其保持初始pH值所需的NaOH的量計(jì)算其水解度。

式中：VNaOH為消耗NaOH溶液的體積(mL)；CNaOH為消耗NaOH溶液的濃度，取0.1 mol/L；MP為被水解的蛋白質(zhì)質(zhì)量(g)；htot為每克原料蛋白質(zhì)中肽鍵的物質(zhì)的量，膠原蛋白取均值8.0 mmol/g[15]；pK為平衡常數(shù)；pH為水溶液的氫離子濃度。

1.2.2 復(fù)合酶水解提取膠原多肽工藝的研究 準(zhǔn)確稱取一定量的自制鹿茸膠原蛋白粉，加入適量磷酸鹽(pH 7.5，0.02 mol/L)溶解制成10 g/L的膠原溶液，同時(shí)加入蛋白酶，調(diào)節(jié)pH值，在一定的溫度條件下反應(yīng)一定時(shí)間，滅活酶，將溶液于 10 000 r/min 離心30 min，上清液凍干即得膠原多肽粉。

采用響應(yīng)面分析中的Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化堿性蛋白酶和胰蛋白酶水解過程。選取酶解時(shí)間(A)、pH值(B)、酶解溫度(C)和加酶量(D)進(jìn)行單酶解4因素3水平正交試驗(yàn)，因素水平見表1和表2，研究堿性蛋白酶和胰蛋白酶對膠原蛋白水解度的影響。根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)所得到的單酶水解的最適條件，設(shè)計(jì)2種酶混合水解和先后水解試驗(yàn)，確定雙酶復(fù)合水解方案。

1.2.3 Sephadex G25測定膠原多肽分子量分布 通過Sephadex G25層析柱(20 mm×40 cm)測定鹿茸膠原多肽分子量分布。取1 mL樣品用0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)洗脫，收集洗脫液,在280 nm下檢測吸光度(A280)。分別用VC、還原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽、VB12上Sephadex G25層析柱，按參考文獻(xiàn)[16]的方法測定各已知分子量標(biāo)準(zhǔn)物的洗脫體積，繪制分子量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表 1 鹿茸膠原多肽堿性蛋白酶酶解試驗(yàn)因素、水平及編碼

表 2 鹿茸膠原多肽胰蛋白酶酶解試驗(yàn)因素、水平及編碼

2 結(jié)果與分析

2.1 堿性蛋白酶提取鹿茸膠原多肽條件的優(yōu)化

鹿茸膠原多肽堿性蛋白酶單一酶解試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案和結(jié)果見表3。利用Design Expert 8.05軟件對表3中數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得各因素與DH的多元二次回歸方程：DH=21.74+0.5A+0.71B+0.22C+0.36D+0.54AB+0.16AC+0.25AD+0.19BC-0.68BD-0.11CD-0.67A2-0.99B2-2.13C2-0.64D2。為檢驗(yàn)該方程的有效性，確定各自變量對響應(yīng)值的影響程度，對回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表4。

表 3 鹿茸膠原多肽堿性蛋白酶酶解Box-Behnken中心組合試驗(yàn)結(jié)果

表 4 鹿茸膠原多肽堿性蛋白酶酶解的二次多項(xiàng)模型方差分析結(jié)果

注：*表示差異顯著(P<0.05)；**表示差異極顯著(P<0.01)。表6同。

Note:“*” indicates significant differenceP<0.05,“**” indicates extremely significant differenceP<0.01.The same for table 6.

表4結(jié)果表明，該二次方程模型達(dá)極顯著水平(P=0.000 1<0.01)，且失擬項(xiàng)不顯著(P>0.05)，說明該方程擬合較好，試驗(yàn)誤差小，可用于堿性蛋白酶酶解法提取鹿茸膠原多肽工藝的分析和預(yù)測。對DH來說，一次項(xiàng)A、B、D，交互項(xiàng)BD，二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2對膠原蛋白水解度有極顯著影響，交互項(xiàng)AB有顯著影響，表明各因素對膠原蛋白水解度的影響不是簡單的線性關(guān)系。

響應(yīng)面分析結(jié)果見圖1。通過響應(yīng)面分析軟件中的Design-Expert求解方程，得出堿性蛋白酶酶解法提取鹿茸膠原多肽的最佳條件為：酶解時(shí)間3.61 h，pH值10.49，酶解溫度55.09 ℃，加酶量 4.13%，此條件下模型水解度預(yù)測值為22.1%，考慮到實(shí)際情況，將其優(yōu)化后的條件修正為酶解時(shí)間3.6 h，pH值10.50，酶解溫度55 ℃，加酶量4%，測定該條件下鹿茸膠原蛋白最大水解度為22.03%，實(shí)測值與預(yù)測值基本一致，表明該優(yōu)選工藝可靠。

2.2 胰蛋白酶提取鹿茸膠原多肽條件的優(yōu)化

鹿茸膠原多肽胰蛋白酶單一酶解試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案和結(jié)果見表5。利用Design Expert 8.05軟件對表5中數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得各因素與DH的多元二次回歸方程:DH=15.71-0.073A+0.067B+0.054C+0.82D+0.39AB+0.48AC+0.77AD+0.43BC+0.095BD-0.21CD-0.83A2-1.10B2-1.49C2-1.15D2。

為檢驗(yàn)該方程的有效性，確定各自變量對響應(yīng)值的影響程度，對回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表6。由表6可以看出，該二次方程模型達(dá)極顯著水平(P=0.000 1<0.01)，失擬項(xiàng)不顯著(P>0.05)，說明該方程擬合較好，可用于胰蛋白酶酶解法提取鹿茸膠原多肽工藝的分析和預(yù)測；對DH來說，一次項(xiàng)D、交互項(xiàng)AD和二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2對水解度有極顯著影響，交互項(xiàng)AB、AC、BC對DH有顯著影響，且各因素之間有較強(qiáng)的交互作用。

響應(yīng)面分析結(jié)果見圖2。通過響應(yīng)面分析軟件中的Design-Expert求解方程，得出胰蛋白酶酶解法提取鹿茸膠原多肽的最佳條件為：酶解時(shí)間3.18 h，pH 值8.08，酶解溫度50.03 ℃，加酶量4.42%，此條件下模型水解度預(yù)測值為15.87%，考慮到實(shí)際情況，將其優(yōu)化后的條件修正為酶解時(shí)間3.2 h，pH值8.00，酶解溫度50 ℃，加酶量4.4%，該條件下測定鹿茸膠原蛋白水解度為15.81%，實(shí)測值與預(yù)測值基本一致，表明該優(yōu)選工藝可靠。

圖 1 堿性蛋白酶水解時(shí)各因素之間的交互作用對鹿茸膠原蛋白水解度的影響

表 5 鹿茸膠原多肽胰蛋白酶酶解Box-Behnken中心組合試驗(yàn)結(jié)果

表 5(續(xù)) Continued table 5

表 6 鹿茸膠原多肽胰蛋白酶酶解的二次多項(xiàng)模型方差分析結(jié)果

2.3 復(fù)合酶水解方案的選擇

根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)得到的單酶水解最適條件，確定了雙酶復(fù)合水解的方案，結(jié)果如表7所示。由表7可以看出，選取堿性蛋白酶和胰蛋白酶進(jìn)行復(fù)合酶水解試驗(yàn)，得到水解產(chǎn)物的水解度較之單酶都有一定的提高。復(fù)合酶水解的最佳條件為：堿性蛋白酶和胰蛋白酶先后水解，溫度52.5 ℃，堿性蛋白酶在pH值 10.50，加酶量4%的條件下水解3.6 h；調(diào)節(jié)pH至8.00，胰蛋白酶添加量4.4%，水解3.2 h，所得水解液水解度為33.42%。

表 7 堿性蛋白酶和胰蛋白酶復(fù)合酶水解鹿茸膠原多肽試驗(yàn)結(jié)果

注：A.堿性蛋白酶;B.胰蛋白酶;A+B.同時(shí)加入堿性蛋白酶和胰蛋白酶酶解;A→B.先加入堿性蛋白酶酶解后加入胰蛋白酶酶解;B→A.先加入胰蛋白酶酶解后加入堿性蛋白酶酶解。

Note:A.Alkaline protease;B.Trypsin;A+B.Adding alkaline protease and trypsin at the same time;A→B.Adding alkaline protease before trypsin;B→A.Adding trypsin before alkaline protease.

2.4 鹿茸膠原多肽分子量分布

2.4.1 分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線 VC、VB12、還原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽4種已知分子量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的分子質(zhì)量及洗脫液體積如表8所示。對表8數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得分子量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：Y=-38.359X+176.2，R2=0.998 1。Y為標(biāo)準(zhǔn)物的洗脫體積(mL)，X為分子質(zhì)量(u)的常用對數(shù)(lg M)。試驗(yàn)表明，lg M在2.1～3.3時(shí)X與Y線性關(guān)系良好。

2.4.2 膠原多肽的分子量分布 取水解液直接上柱，得到如圖3所示的洗脫曲線。從圖3可以看出，堿性蛋白酶和胰蛋白酶復(fù)合水解鹿茸膠原多肽的洗脫液在55.5 mL和76.5 mL出現(xiàn)了2個(gè)洗脫峰，將洗脫峰體積帶入分子量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出鹿茸膠原多肽的分子量分布在400～1 400 u。

表 8 標(biāo)準(zhǔn)物的分子量和洗脫體積

圖 3 堿性蛋白酶和胰蛋白酶復(fù)合水解鹿茸膠原多肽產(chǎn)物的洗脫曲線

3 討 論

膠原多肽的提取方法主要有2種：化學(xué)法和酶法。化學(xué)法是用酸、堿等化學(xué)試劑在一定溫度下促使蛋白質(zhì)分子的肽鏈斷裂形成小分子物質(zhì)。酸法多采用硫酸、鹽酸等強(qiáng)酸在高溫下反應(yīng)，反應(yīng)劇烈，設(shè)備腐蝕嚴(yán)重，并產(chǎn)生二次污染，現(xiàn)已逐漸被淘汰；堿法水解過程中發(fā)生消旋現(xiàn)象，得到的水解物無生物利用價(jià)值[17]。酶解法反應(yīng)條件溫和，反應(yīng)時(shí)間短，無環(huán)境污染，產(chǎn)物理化性質(zhì)穩(wěn)定，作為膠原多肽提取方法已經(jīng)成為發(fā)展趨勢。

從同一種酶水解過程來看，不同的水解條件造成水解液的水解度不同[18]，水解產(chǎn)物的分子量受水解過程影響[19]。在酶解溫度52.5 ℃，堿性蛋白酶在pH 值10.50，加酶量4%的條件下水解3.6 h；調(diào)節(jié)pH至8.00，胰蛋白酶添加量4.4%，水解3.2 h的條件下，所得水解液的水解度最大可達(dá)33.42%，分子量分布在400～1 400 u。不同的酶水解位點(diǎn)不同，試驗(yàn)結(jié)果表明，復(fù)合酶水解能夠有效提高鹿茸膠原蛋白的水解度，而復(fù)合酶的組合方式對水解液水解度的影響較大。

有學(xué)者同時(shí)加入木瓜蛋白酶和胰蛋白酶提取牛皮膠原多肽，在最優(yōu)工藝條件下膠原蛋白的水解度為32.02%[20]；楊吉平等[21]曾用胃蛋白酶和胰蛋白酶雙酶法制備梅花鹿鹿茸膠原多肽，在最佳工藝條件下酶解得到的鹿茸膠原多肽相對分子質(zhì)量小于3 000的約占60.65%，相對分子質(zhì)量小于5 000的約占88.16%。在本研究中，最佳工藝條件下水解液的水解度略高于文獻(xiàn)報(bào)道，分子量也比文獻(xiàn)報(bào)道的更小，適用于工業(yè)生產(chǎn)，為工業(yè)化生產(chǎn)鹿茸膠原多肽提供理論依據(jù)。

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Composite enzymatic hydrolysis of collagen peptide from antler

LI Bing,LI Liang,WANG Lulu,DONG Simin,HUANG Baoliang,ZHANG Jing

(CollegeofChineseMedicinalMaterials,JilinAgriculturalUniversity，Changchun,Jilin130118,China)

【Objective】 Hydrolysis of collagen peptide of antler by composite enzymes was optimized and the molecular weight (MW) distribution of hydrolysates was investigated.【Method】 Response surface design experiment was applied to optimize the hydrolysis conditions (including hydrolysis time,pH value,hydrolysis temperature and enzyme loading) for alkaline protease and trypsin to determine the optimal composite enzymatic hydrolysis of collagen peptide from antler.The molecular weight distribution of hydrolysates was also determined using Sephadex G25 partition.【Result】 The optimal conditions for alkaline protease were pH 10.50,temperature 55 ℃,and enzyme loading 4% for 3.6 h with the degree of hydrolysate (DH) of 22.03%.The optimal conditions for trypsin were pH 8.00,temperature 50 ℃,and enzyme loading 4.4% for 3.2 h with DH of 15.81%.The optimum parameters of composite enzyme hydrolysis were hydrolyzed 4% alkaline protease at 52.5 ℃ and pH 10.50 for 3.6 h before hydrolyzing 4.4% trypsin at pH 8.00 for 3.2 h.The obtained DH was 33.42%.The molecular weight distribution of collagen peptide from antler ranged from 400 to 1 400 u.【Conclusion】 This study determined the optimal conditions for composite enzymatic hydrolysis of collagen peptide from antler by alkaline protease and trypsin.

velvet antler;response surface design experiment;composite enzymatic hydrolysis;collagen peptide

時(shí)間:2016-10-09 10:08

10.13207/j.cnki.jnwafu.2016.11.028

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20161009.1008.056.html

2015-05-12

吉林省科技廳發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(20140204063YY，20130413044GH，20120246)

李 冰(1991-)，女，吉林公主嶺人，在讀碩士，主要從事天然產(chǎn)物研究。E-mail:862256868@qq.com

張 晶(1971-)，女，吉林長春人，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事天然產(chǎn)物研究。E-mail:zhjing0701@163.com

R284；Q512+.6

A

1671-9387(2016)11-0193-09