李林強，朱莉莉，萬 威，王 亮，田蘇輝，田萬強

(1 陜西師范大學 食品工程與營養(yǎng)科學學院，陜西 西安 710119；2 西安宏興乳業(yè)公司，陜西 臨潼710600；3 楊凌職業(yè)技術學院 動物工程分院，陜西 楊凌 712100)

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牛羊乳熱處理蛋白質變性程度比較及機理分析

李林強1，朱莉莉1，萬 威1，王 亮1，田蘇輝2，田萬強3

(1 陜西師范大學 食品工程與營養(yǎng)科學學院，陜西 西安 710119；2 西安宏興乳業(yè)公司，陜西 臨潼710600；3 楊凌職業(yè)技術學院 動物工程分院，陜西 楊凌 712100)

【目的】 比較牛、羊乳熱處理后蛋白質變性程度，探討牛、羊乳蛋白質熱穩(wěn)定性差異機理?！痉椒ā?采用離心沉淀法、全自動色差儀和SDS-PAGE電泳法，以未熱處理的常溫(18～20 ℃)牛、羊乳為對照，測定不同溫度(95，121 ℃)處理15 min后牛、羊乳蛋白質沉淀率、紅值(a*)和酪蛋白的組成；并采用考馬斯亮藍法、菲林試劑法和激光粒度儀測定牛羊鮮乳蛋白質、還原糖質量濃度及蛋白質粒度大小?！窘Y果】 羊乳蛋白質沉淀率顯著高于牛乳(P<0.05)，牛乳酪蛋白的紅值顯著高于羊乳(P<0.05)，牛、羊乳酪蛋白主要均為β-酪蛋白和αs1-酪蛋白2種，分子質量分別約為34和26 ku；羊乳蛋白質質量濃度((37.67±1.67) g/L)顯著高于牛乳((20.33±1.20) g/L)(P<0.05)，還原糖質量濃度((421.77±10.17) mg/L)顯著低于牛乳((525.67±14.98) mg/L)(P<0.05)；牛乳蛋白質粒度大小主要集中在1 nm以下，羊乳蛋白質粒度只有少部分在1 nm以下，主要分布于1～1 000 nm?！窘Y論】 牛、羊乳蛋白質粒度和還原糖質量濃度分別是影響其蛋白質沉淀率和羰氨反應程度大小的主要因素。

牛乳；羊乳；蛋白質；熱變性；變性機理

乳及乳制品是人們攝取動物性蛋白的重要來源，其中液態(tài)乳是其中消費量最大的一種，主要包括巴氏殺菌乳和常溫奶(UHT乳)2類，而以UHT牛乳最為普遍，其保質期達6個月，但其在貨架期會出現(xiàn)蛋白沉淀現(xiàn)象[1]，引起消費者的安全顧慮?，F(xiàn)代營養(yǎng)科學證明，羊乳具有和母乳更為接近的營養(yǎng)組成[2]，生產實踐證明羊乳熱處理后蛋白質沉淀現(xiàn)象較為嚴重，成為液態(tài)羊乳生產的技術瓶頸，因此市場上羊乳產品主要以羊奶粉為主，產品單一，影響其消費量的增加和奶山羊產業(yè)的發(fā)展。

影響乳熱穩(wěn)定性的因素有酸度[3-4]、pH值[5]、酪蛋白組成[6-7]、乳清蛋白和酪蛋白的相互作用[8-9]、熱處理溫度[10-14]等，其中熱處理是最為重要的影響因素。常規(guī)熱處理對乳品體系沉淀率影響不大[15-16]，但高溫處理對蛋白質穩(wěn)定性的影響是目前工業(yè)生產一直存在的問題，特別是羊乳熱穩(wěn)定性更為脆弱。沉淀和色變是衡量蛋白質穩(wěn)定性的重要指標[17-19]，目前尚缺乏對二者的定量研究及機理分析。為此，本研究主要探討不同熱處理對牛、羊乳蛋白質變性指標沉淀率和色值的影響，并分析熱處理后牛、羊乳相關理化特征指標的變化，以期揭示牛、羊乳熱變性機理，豐富牛、羊乳穩(wěn)定性研究理論，進而為牛、羊乳穩(wěn)定性熱加工技術參數的確定提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

牛、羊乳分別采自于西北農林科技大學畜牧站荷斯坦牛和薩能奶山羊。

1.2 試 劑

硫酸銅、酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉、亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、葡萄糖，成都金山化學試劑有限公司產品；牛血清蛋白，上海永葉生物科技有限公司產品；考馬斯亮藍G-250、蛋白Mark，F(xiàn)ermentas公司產品；干酪素，北京奧博星生物技術有限責任公司產品；三羥甲基氨基甲烷(Tris)、硝酸銀、丙烯酰胺、十二烷基硫酸鈉(SDS)、TEMED、甘氨酸、甘油、β-巰基乙醇、溴酚藍、鹽酸、考馬斯亮藍R250、氯化鈉、三氯乙酸、戊二醛、碳酸鈉、甲醛、檸檬酸、醋酸鈉、氫氧化鈉、醋酸、體積分數95%乙醇、乙醚，均為分析純。

1.3 主要儀器

臺式離心機800B，上海安亭科學儀器廠；全自動色差儀(SC-80C)，北京康光光學儀器有限公司；722型可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司；電泳系統(tǒng)(PowerPacTMUniversal)，美國Bio-rad；凝膠成像系統(tǒng)(Universal Hood II，XRS)，美國Bio-rad；激光粒度分析儀(MS2000)，英國馬爾文儀器公司。

1.4 方 法

1.4.1 蛋白質沉淀率的測定 牛、羊乳于95，121 ℃各處理15 min，冷卻至2～4 ℃保存60 h，每隔12 h取樣液，400×g離心15 min，傾出上清液，稱量沉淀蛋白的質量，每次平行測定3個樣品，共測定5次，同時設置未熱處理常溫(18～20 ℃)牛、羊乳為對照。按下式計算蛋白質沉淀率：

W=(m1/m)×100%。

式中：W為蛋白質沉淀率，%；m1為沉淀蛋白質量，g；m為樣液質量，g。

1.4.2 酪蛋白提取及其紅值測定 取常溫、95 ℃加熱15 min和121 ℃加熱15 min的牛、羊乳各30 mL，200×g離心5 min，棄去上層脂肪；下層液體加入等體積0.2 mol/mL醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH 4.6)，搖勻，加熱至40 ℃，然后冷卻至室溫，放置5 min，200×g離心5 min傾出上層液體，沉淀物用蒸餾水洗滌，200×g離心5 min，重復洗滌3次，所得沉淀物即為粗酪蛋白。將粗酪蛋白置于30 mL體積分數95%乙醇中洗滌2次，200×g離心5 min，再用乙醚洗滌2次，抽濾，將所得沉淀物攤開在表面皿上，使乙醚完全揮發(fā)，所得沉淀物即為酪蛋白。相機拍照，并利用全自動色差儀測定其紅值(a*)。

1.4.3 酪蛋白組成的SDS-PAGE分析 取酪蛋白1 mg溶于1 mL樣品緩沖液中，沸水煮5 min。配制質量分數12%分離膠加入凝膠板中，凝固40 min，加入質量分數3%濃縮膠，凝固40 min，在加樣孔中加入樣品10 μL，開始電泳，80 V恒壓40 min，然后100 V恒壓2.5 h，停止電泳；體積分數20%三氯乙酸浸泡凝膠板8 h，150 mL去離子水充分洗滌凝膠板20 min，重復洗滌3次；體積分數1%戊二醛溶液150 mL避光浸泡凝膠板6 h，去離子水洗滌10 min，重復洗滌3次；氨銀染液100 mL避光染色20 min；去離子水150 mL洗滌凝膠表面2次，每次1 min。加入顯色液至顯色清晰后棄去顯色液，去離子水洗滌2次，每次1 min，加入終止顯色液終止顯色，凝膠成像系統(tǒng)照相。

1.4.4 蛋白質質量濃度的測定 采用考馬斯亮藍法。用0.15 mol/L NaCl 溶液配制1 mL質量濃度為1 mg/mL的標準牛血清蛋白溶液；稱取100 mg考馬斯亮藍G-250溶于50 mL體積分數95%乙醇中，加入100 mL 850 g/L磷酸，用蒸餾水定容至1 000 mL，濾紙過濾并裝入棕色瓶中保存。最終試劑中含0.1 g/L考馬斯亮藍G-250、體積分數4.7%乙醇、85 g/L磷酸。以標準蛋白質質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線，根據標準曲線計算樣液中蛋白質質量濃度。

1.4.5 還原糖質量濃度的測定 取牛、羊乳各30 mL，加蒸餾水50 mL，慢慢加入5 mL乙酸鋅溶液(219 g/L乙酸鋅，30 mL/L冰乙酸)和5 mL亞鐵氰化鉀(106 g/L)溶液，定容至150 mL，靜置30 min，過濾，濾液備用；取堿性酒石酸銅甲液(15 g CuSO4·5H2O及0.05 g次甲基藍溶入1 000 mL水中)、乙液(50 g酒石酸鉀鈉及75 g氫氧化鈉溶于水中，加入4 g亞鐵氰化鉀，充分溶解后，用水稀釋至 1 000 mL)各5 mL，置于150 mL錐形瓶中，加蒸餾水10 mL，然后加入玻璃珠2粒，2 min內加熱至沸，滴加試樣溶液，并保持溶液沸騰狀態(tài)，以每2 s 1滴的速度滴定至溶液藍色剛好褪去為終點，記錄消耗樣液體積，每次平行測定3次，根據樣液消耗體積計算還原糖質量濃度，計算公式為：

式中：W為試樣中還原糖質量濃度，mg/L；C為葡萄糖標準溶液的質量濃度，mg/mL；V1為滴定10 mL費林試劑消耗葡萄糖標準溶液的體積，mL；V2為滴定時平均消耗樣品溶液的體積，mL；V3為樣品體積，mL；V為樣品定容體積，mL。

1.4.6 粒度的測定 各取50 mL牛、羊乳加入等體積乙醚，靜置10 min，1 200×g離心15 min，傾去上層脂肪，用激光粒度分析儀測定粒度。

1.5 數據處理

2 結果與分析

2.1 不同溫度處理后牛、羊乳蛋白質沉淀率的變化

圖1表明，不同處理溫度和貯存時間對牛乳蛋白質沉淀率雖有一定程度影響，但影響均不顯著(P>0.05)。由圖2可見，貯存時間對羊乳蛋白質沉淀率無顯著影響(P>0.05)，但溫度則不同，隨著處理溫度升高羊乳蛋白質沉淀率顯著增加(P<0.05)。圖1和圖2結果比較表明，羊乳的熱穩(wěn)定性低于牛乳。

圖 1 不同溫度處理后牛乳蛋白質沉淀率的動態(tài)變化

圖 2 不同溫度處理后羊乳蛋白質沉淀率的動態(tài)變化

2.2 不同溫度處理后牛、羊乳酪蛋白顏色的變化

由圖3可見，121 ℃處理的牛、羊乳酪蛋白明顯呈紅褐色。由圖4可見，隨著處理溫度的提高，牛、羊乳酪蛋白的紅值均顯著增加(P<0.05)，但牛乳酪蛋白的紅值顯著高于羊乳(P<0.05)。該結果表明，牛、羊乳在熱處理的過程中均發(fā)生一定程度的羰氨反應，牛乳發(fā)生羰氨反應的程度高于羊乳，表明牛、羊乳蛋白質和還原性糖的質量濃度有一定的差異。

C1～C3，G1～G3分別為牛、羊乳于121，95，20 ℃處理的酪蛋白

圖 4 不同溫度處理對牛、羊乳酪蛋白紅值變化的影響

2.3 牛、羊乳酪蛋白的SDS-PAGE分析

由圖5可見，牛、羊乳酪蛋白主要有β-酪蛋白和αs1-酪蛋白2種蛋白，依據標準蛋白Mark，β-酪蛋白和αs1-酪蛋白的分子質量分別約為34和26 ku，表明熱處理對牛、羊乳酪蛋白分子大小影響不大。

2.4 牛、羊乳蛋白質和還原糖的質量濃度

圖6表明,羊乳蛋白質質量濃度(37.67±1.67) g/L顯著高于牛乳(20.33±1.20) g/L(P<0.05)，

該結果與文獻[20]所得的牛、羊乳蛋白質含量的結果一致。圖7表明,牛乳還原糖質量濃度(525.67±14.98) mg/L顯著高于羊乳還原糖質量濃度(421.77±10.17) mg/L(P<0.05)，這與文獻[21]的研究結果一致。

條帶1～3依次為20，95，121 ℃處理的牛乳酪蛋白，6～4依次為相同處理的羊乳酪蛋白

圖 6 牛、羊乳蛋白質質量濃度的比較

圖 7 牛、羊乳還原糖質量濃度的比較

2.5 不同溫度處理對牛、羊乳蛋白質粒度的影響

由圖8和9可見，牛乳蛋白粒度大小主要集中在1 nm以下，而羊乳蛋白粒度只有少部分在1 nm以下，主要分布在10～1 000 nm，其中以100 nm左右最多。該結果表明羊乳蛋白粒度大于牛乳。

圖 8 牛乳蛋白粒徑的分布

圖 9 羊乳蛋白粒徑的分布

3 討 論

3.1 蛋白質和還原糖含量對羰氨反應的影響

羰氨反應的發(fā)生與乳中含有的蛋白質和還原糖有關，同時也受溫度的影響，溫度越高，羰氨反應越劇烈，紅值越高[17-19]。本研究結果也表明，隨著熱處理溫度的升高，牛、羊乳紅值均顯著增加(P<0.05)。這是由于乳糖在100 ℃以上的溫度條件下可降解產生還原性的葡萄糖，其與蛋白質發(fā)生羰氨反應，羥甲基糠醛是羰氨反應的一種中間產物，而且加熱時間越長，褐變就越嚴重[22]。本研究表明，牛乳蛋白質含量低于羊乳，而發(fā)生羰氨反應的程度卻高于羊乳，結合還原糖質量濃度測定結果表明，乳糖降解產生葡萄糖的多少是引起羰氨反應程度大小的主要原因。

3.2 蛋白結構對牛、羊乳穩(wěn)定性的影響

本研究表明，牛、羊乳酪蛋白均主要含有β-酪蛋白和αs1-酪蛋白2種蛋白，這與Bramanti等[23]、Crudden等[24]和Veloso等[25]的研究結果一致，表明熱處理對牛、羊乳酪蛋白分子量影響較小。章宇斌[26]、李子超等[27-28]研究表明，熱處理后乳酪蛋白二級結構α-螺旋、β-轉角和β-折疊數目均發(fā)生明顯變化，牛、羊乳酪蛋白膠束結構有很大差異。上述結果提示，牛、羊乳熱變性可能是由于其酪蛋白結構發(fā)生變化所致，但是牛、羊乳酪蛋白熱處理結構的差異是基于二者本身結構的異同，還是僅僅由于熱變性所致，尚待進一步研究。

本研究表明，牛乳蛋白粒度大小主要集中在1 nm以下。李子超等[27]采用納米粒度儀對酪蛋白粒徑的測量結果表明，巴氏殺菌牛乳蛋白粒度集中分布于105.7～1 106.0 nm，UHT牛乳中粒徑為105.7～164.2 nm和 255.0～458.7 nm，蛋白含量分別占58.8%和41.1%，這與本研究牛乳粒度分析結果有一定的差異，可能是由于測定乳樣是否進行加熱和脫脂所致。綜上所述表明，熱處理后牛乳蛋白質粒度有所增大。本研究結果表明，羊乳蛋白粒度大于牛乳，而且羊乳在121 ℃處理后可明顯觀察到沉淀，表明羊乳熱穩(wěn)定性較差。該結果顯示，牛、羊乳蛋白質粒度大小是牛、羊乳熱穩(wěn)定性差異的直接影響因素。

4 結 論

牛乳蛋白熱穩(wěn)定性顯著高于羊乳(P<0.05)，羊乳蛋白質粒度遠大于牛乳，二者酪蛋白主要由β-酪蛋白和αs1-酪蛋白2種蛋白組成，其分子質量分別約為34和26 ku，熱處理對二者的分子質量影響不大，牛、羊乳蛋白質粒度大小是影響其穩(wěn)定性的主要因素；牛乳熱處理發(fā)生羰氨反應的程度顯著大于羊乳(P<0.05)，牛乳還原糖質量濃度(525.67±14.98) mg/L顯著高于羊乳(421.77±10.17) mg/L(P<0.05)，羊乳蛋白質質量濃度(37.67±1.67) g/L顯著高于牛乳(20.33±1.20) g/L(P<0.05)，還原糖質量濃度是影響羰氨反應程度大小的主要因素。

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Comparison and mechanism analysis of protein thermal denaturation degree of cow milk and goat milk

LI Linqiang1,ZHU Lili1,WAN Wei1,WANG Liang1,TIAN Suhui2,TIAN Wanqiang3

(1CollegeofFoodEngineeringandNutritionalScience,ShaanxiNormalUniversity,Xi’an,Shaanxi710119,China; 2Xi’anHongxingDairyCompany,Lintong,Shaanxi710600,China;3AnimalEngineeringDepartment,YanglingVocationalandTechnicalCollege,Yangling,Shaanxi712100,China)

【Objective】 Thermal denaturation degree of protein from cow milk and goat milk was compared to investigate mechanisms in thermal stability of protein. 【Method】 Protein precipitation rate,redness value (a*),and casein composition of cow milk and goat milk after 15 min treatment with different temperatures (95 ℃ and 121 ℃) were analyzed using centrifugal sedimentation method,full automatic colorimeter,and SDS-PAGE.Fresh cow milk and goat milk at room temperature of 18-20 ℃ were used as control.Protein content,reduced sugar content,and size of protein particle from fresh cow milk and goat milk were measured by Kaumas coomassie brilliant blue method,Fehling reagent method,and laser particle size analyzer,respectively.【Result】 Precipitation rate of goat milk was significantly higher than that of cow milk (P<0.05),whilea*of cow milk was significantly higher than that of goat milk (P<0.05).Both cow milk and goat milk mainly had β-CN and αs1-CN,with molecular weights of 34 and 26 ku,respectively.The protein content of goat milk (37.67±1.67) g/L was significantly higher than that of cow milk (20.33±1.20) g/L (P<0.05),while the content of reduced sugar of goat milk (421.77±10.17) mg/L was significantly lower than that of cow milk (525.67±14.98) mg/L (P<0.05).Particles of cow milk protein were mainly in 1 nm or less,while that of goat milk protein mainly distributed in 1-1 000 nm.【Conclusion】 Particle size of milk protein and reduced sugar content were the main factors affecting protein precipitation rate and maillard reaction,respectively.

cow milk;goat milk;protein;thermal denaturation;denaturation mechanism

時間:2016-10-09 10:08

10.13207/j.cnki.jnwafu.2016.11.021

網絡出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20161009.1008.042.html

2015-05-08

陜西省農業(yè)科技創(chuàng)新與攻關項目(2016NY-212)

李林強(1971-)，男，陜西扶風人，副教授，博士，主要從事畜產品及功能食品研究。E-mail:lilinq@snnu.edu.cn

TS252.1

A

1671-9387(2016)11-0149-06