胡慶蘋,魏鑒騰,裴 棟,王寧麗,劉曄瑋,邸多隆

(1.蘭州大學 公共衛(wèi)生學院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學研究所,甘肅蘭州 730000;2.中國科學院蘭州化學物理研究所中科院西北特色植物資源化學重點實驗室和甘肅省天然藥物重點實驗室,甘肅蘭州 730000;3.青島市資源化學與新材料研究中心,山東青島 266100)

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響應面法優(yōu)化魚籽多肽酶解液脫色工藝

胡慶蘋1,2,3,魏鑒騰2,3,裴 棟2,3,王寧麗2,3,劉曄瑋1,*,邸多隆2,3

(1.蘭州大學 公共衛(wèi)生學院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學研究所,甘肅蘭州 730000;2.中國科學院蘭州化學物理研究所中科院西北特色植物資源化學重點實驗室和甘肅省天然藥物重點實驗室,甘肅蘭州 730000;3.青島市資源化學與新材料研究中心,山東青島 266100)

采用活性炭對魚籽多肽酶解液進行脫色,以脫色率和多肽回收率為評價指標,分別考察活性炭用量、時間、溫度、pH對脫色效果的影響,在單因素實驗的基礎上,采用響應面法優(yōu)化魚籽多肽酶解液的脫色工藝。結果表明:魚籽多肽最佳脫色工藝條件為10.5%(m/m)、時間41 min、溫度55 ℃、pH2.8,在此條件下,脫色率77.51%±1.49%、多肽回收率82.26%±2.82%,與理論值差異不顯著。該脫色工藝簡單可靠,脫色效果好,多肽回收率高,為魚籽多肽產品后期研發(fā)提供依據。

魚籽多肽,脫色,響應面法,脫色率,多肽回收率

魚籽是水產品加工中一種重要的副產物,富含蛋白質、多不飽和脂肪酸、鈣、鐵、維生素、膽固醇等營養(yǎng)物質,目前魚籽主要用于食品加工,魚子醬是其主要的食品成品,具有很高的營養(yǎng)價值,在歐洲國家有很大的需求[1-2]。魚籽多肽是由魚籽蛋白經酶解后得到的,以分子量小于3000 u的小分子肽為主的多肽混合物[3]。魚籽酶解多肽具有良好的溶解性、乳化性能、脂肪吸附容量及起泡性能[4]。魚籽多肽是一種生物活性肽,具有降血壓、抗氧化、抗菌、提高免疫力等作用[5-6]。

魚籽多肽酶解液呈棕黃色或褐色,易引起產品感官不適,不利于產品的深度研發(fā)。目前常用的脫色劑有活性炭、大孔樹脂、復合吸附劑、強堿性陰離子樹脂等[7]?；钚蕴渴且环N無序微孔結構,因其價格低廉,化學性質穩(wěn)定,耐高溫、耐酸堿,良好的吸附性能,比表面積大等優(yōu)點在脫色工藝中廣泛使用[8-9]。

本文采用實驗室前期制備的魚籽多肽酶解液樣品,以活性炭為脫色劑,脫色率、多肽回收率為評價指標,考察影響活性炭對魚籽多肽脫色效果的因素,并運用響應面法進行脫色工藝優(yōu)化[10],以期為魚籽多肽產品研發(fā)提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

魚籽多肽酶解液 實驗室自制[11];粉末活性炭;無水硫酸銅、濃硫酸、氫氧化鈉、37%甲醛、乙酰丙酮、硫酸銨、對硝基苯酚、乙酸鈉、乙酸等 國藥集團化學試劑有限公司;去離子水 實驗室自制。

TU-1810型紫外分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;臺式低速離心機 湖南湘儀離心機儀器有限公司;紅外智能消化爐 上海沛歐分析儀器有限公司;HWS26型電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學儀器有限公司;Sartorius PB-10 pH計 賽多利斯科學儀器有限公司;Sartorius BSA224S電子天平 賽多利斯科學儀器有限公司;電熱鼓風干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司等。

1.2 實驗方法

1.2.1 工藝流程 魚籽多肽酶解液→脫色→離心(4000 r/min,5 min)→0.45 μm微孔濾膜過濾→檢測上清液。

1.2.2 脫色率 將魚籽多肽酶解液在可見-紫外光譜200～900 nm進行全波長掃描,結果顯示可見光區(qū)無吸收峰,但在380～760 nm范圍內,吸光度逐漸減小。根據脫色前后多肽溶液均為橙黃色,故從溶液的互補色考慮[12-14],選擇450 nm作為檢測波長,在此波長下測定多肽溶液脫色前后吸光度值,并按下式計算溶液脫色率:

脫色率(%)=(A脫色前-A脫色后)/A脫色前×100

式(1)

1.2.3 多肽回收率 采用GB 5009.5-2010分光光度法檢測脫色前后多肽溶液中多肽含量,按下式計算多肽回收率:

多肽回收率(%)=m脫色后/m脫色前×100

式(2)

1.2.4 單因素實驗設計 分別考察活性炭用量、時間、溫度、pH四個因素對魚籽多肽酶解液脫色率、多肽回收率的影響,其水平見表1。通過查閱文獻[15],結合實際生產成本等因素,將脫色初始溫度設為50 ℃;在生產中,時間越短,成本越低,結合文獻脫色時間[16],將脫色初始時間設為30 min;本實驗中多肽酶解液初始pH為5.55,呈弱酸性,而活性炭在酸性條件下,脫色效果佳[17],結合降低生產成本等因素,故將脫色初始pH設為5.55。因此固定溫度50 ℃,時間30 min,pH5.55,考察活性炭用量對脫色效果的影響;固定活性炭用量10%(m/m),溫度50 ℃,pH5.55,考察時間對脫色效果的影響;固定活性炭用量10%(m/m),時間30 min,pH5.55,考察溫度對脫色效果的影響;固定活性炭用量10%(m/m),溫度50 ℃,時間30 min,考察pH對脫色效果的影響。

1.2.5 響應面法優(yōu)化實驗設計 根據單因素實驗結果,采用Box-Behnken實驗設計方法對魚籽多肽溶液脫色進行4因素3水平設計[18-19],見表2,并采用Design Expert 8.0.6軟件對實驗數據進行分析處理。

表1 單因素實驗因素及水平Table 1 Factors and levels of the single factor experiment

表2 響應面因素設計水平表Table 2 Factors and level value of response surface methodology

1.2.6 數據處理 采用SigmaPlot 12.5軟件作圖,Design-Expert 8.0.6軟件進行方差分析。

2 結果與討論

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 活性炭用量對脫色效果的影響 由圖1可知,活性炭用量對魚籽多肽樣品的脫色效果影響顯著?；钚蕴棵撋珜儆谖锢砻撋?其顆粒表面的空隙,可強烈吸附色素分子[20]。隨著活性炭用量的增加,脫色率整體呈增加趨勢,但當活性炭用量增加到12%時,脫色率減小,在8%～12%用量的范圍內,脫色效果較好,結合多肽回收率,綜合考慮選擇10%活性炭用量。

圖1 活性炭用量對脫色效果的影響Fig.1 Influence of activated carbon concentration on decoloring effect

2.1.2 脫色時間對脫色效果的影響 活性炭與色素分子接觸需要一定的時間,但由于本實驗中考察脫色時間因素時,溫度定為50 ℃較高,分子運動加劇,由圖2可知,作用時間超過20 min后,活性炭吸附可能發(fā)生解析[21]。但結合多肽回收率指標,40 min時脫色效果較好,脫色率68.97%、多肽回收率90.11%,因此選擇脫色時間為40 min,這與戴麗君[22]等在正交實驗優(yōu)化大豆多肽脫色工藝中活性炭脫色時間40 min相同。

圖2 脫色時間對脫色效果的影響Fig.2 Influence of time on decoloring effect

2.1.3 脫色溫度對脫色率和肽回收率的影響 由圖3可知,20～40 ℃內,脫色率緩慢升高,這是由于溫度升高,分子運動加劇,色素分子更易于擴散到活性炭的空隙結構中,有利于吸附。當溫度升高到50 ℃時,脫色率達62.56%,此時多肽回收率89.66%也相對較高,因此選擇50 ℃作為最佳脫色溫度,這與徐曼[15]等粉末活性炭脫色豆粕蛋白酶解液的條件優(yōu)化中粉末活性炭脫色溫度50 ℃相同。當溫度達到50 ℃以上,脫色率先基本不變后反而降低,可能原因為溫度過高,導致活性炭吸附發(fā)生解析,已吸附的色素分子又被釋放出來。

圖3 脫色溫度對脫色效果的影響Fig.3 Influence of temperature on decoloring effect

2.1.4 pH對脫色率和肽回收率的影響 活性炭吸附色素的過程需要H+的參與,適當提高樣品中H+的濃度,可以提高脫色率[17]。由圖4可知,pH對脫色效果影響較大,隨著pH的增大,脫色率整體呈逐漸減小的趨勢,在pH為2時脫色效果最佳,脫色率達78.97%,但此時多肽回收率85.08%,均較pH為3時(多肽回收率90.81%)低,綜合脫色率、多肽回收率二因素考慮選擇pH為3為最佳脫色pH,這與呂振雷[23]等在活性炭對紫貽貝蛋白酶解液脫色效果的影響中脫色pH為3相同。

2.2 響應面法優(yōu)化魚籽多肽脫色工藝

2.2.1 響應面優(yōu)化實驗結果 響應面優(yōu)化實驗結果見表3,方差分析結果見表4。由表4可知,以活性炭用量、時間、溫度、pH為考察因素,以脫色率、多肽回收率為指標的響應面優(yōu)化模型中,Y1、Y2差異極顯著(p<0.01),其決定系數R2分別為0.9115、0.8254,且模型失擬項均無顯著性差異(p>0.01),表明魚籽多肽酶解液的脫色效果的實驗值與擬合值之間的擬合度較好,Y1、Y2的二次模型合適。

表3 響應面優(yōu)化實驗結果Table 3 Results of response surface experiments

表4 回歸模型的方差Table 4 Variance analysis of regression model

注:**:差異極顯著(p<0.01);*:差異顯著(p<0.05);Y1:脫色率;Y2:多肽回收率。 由方差分析結果(表4)可知,Y1的A、B、D、AD、BC、BD、B2、D2對魚籽多肽酶解液的脫色率影響顯著,其中一次項中對脫色率影響顯著的順序為D>B>A;Y2的A、C、D、AD、CD、A2、B2、C2、D2對魚籽多肽酶解液的多肽回收率影響顯著,其中一次項中對多肽回收率影響顯著的順序為C>D>A。

擬合后,可以建立關于活性炭用量、時間、溫度以及pH的二次多項式回歸模型,分別為:

Y1(%)=75.22+2.68A+3.34B+1.57C-6.72D+0.96AB+0.060AC+3.35AD+3.55BC+3.85BD+0.038CD-0.95A2-3.00B2-1.49C2-7.17D2

Y2(%)=83.83+2.78A+0.07B+3.08C+2.78D-3.63AB+0.50AC-6.24AD-0.37BC+0.80BD-4.73CD-7.06A2-5.83B2-4.94C2-6.08D2

2.2.2 雙因素間交互作用影響 由表4可知,活性炭用量與pH、時間與溫度、時間與pH之間的交互作用對脫色率的影響顯著,分別見圖5a及5b、5c及5d、5e及5f。由圖5a和5b可知,當時間與溫度處于最佳水平時,固定pH,隨著活性炭用量的增加,脫色率緩慢增加,但增幅不是很明顯;固定活性炭用量,隨著pH的增加,脫色率呈減小趨勢,降幅明顯。由圖5c和5d可知,當活性炭用量和pH處于最佳水平時,固定其中一個因素,隨著各一個因素的增加,脫色率均呈增加趨勢,但增幅不是很明顯。由圖5e和5f可知,當活性炭用量和溫度處于最佳水平時,固定脫色時間,隨著pH的增大,脫色率逐漸減小;固定pH,隨著脫色時間的增加,脫色率呈增加趨勢,但增幅不明顯。

圖5 脫色率響應曲面圖和等高線圖Fig.5 The response surface and contour plots of the decoloring rate

由表4可知,活性炭用量與pH,溫度與pH之間的交互作用對多肽回收率的影響顯著,分別見圖6a和6b、6c和6d。由圖6a和6b可知,當時間與溫度處于最佳水平時,固定活性炭用量,隨著pH的增加,多肽回收率呈增加趨勢,整體呈先大幅增加,后趨于平緩;固定pH時,隨著活性炭用量的增加,多肽回收率先增加,后趨于平緩。由圖6c和6d可知,當活性炭用量和時間處于最佳水平時,固定溫度,隨著pH的增加,多肽回收率呈逐漸增加趨勢,后趨于平緩;固定pH,隨著溫度的增加,多肽回收率呈增加趨勢,后趨于平緩。

圖6 多肽回收率響應曲面圖和等高線圖Fig.6 The response surface and contour plots of the peptide retention rate

2.2.3 魚籽多肽酶解液脫色條件的確定及優(yōu)化工藝條件驗證 經Box-Behnken實驗設計,Design Expert 8.0.6對實驗數據進行分析處理后,得到魚籽多肽溶液脫色的最優(yōu)工藝條件為:活性炭用量10.75%、時間41.47 min、溫度55.02 ℃、pH2.75,此條件下,脫色率為78.02%、多肽回收率為84.01%。為方便實際操作,將最佳脫色條件調整為活性炭用量10.5%、時間41 min、溫度55 ℃、pH2.8,在此最優(yōu)條件下進行三次平行驗證實驗,結果為脫色率為77.51%±1.49%、多肽回收率為82.26%±2.82%,可以證明模型可靠。

3 結論

采用響應面法優(yōu)化魚籽多肽脫色工藝,以魚籽多肽酶解液為原液,以脫色率、多肽回收率為檢測指標,考察活性炭用量、時間、溫度、pH對魚籽多肽酶解液脫色效果的影響,以得到魚籽多肽最佳脫色工藝。在單因素實驗的基礎上,采用Box-Behnken實驗設計方法對魚籽多肽溶液脫色進行4因素3水平設計,并采用Design Expert 8.0.6對實驗數據進行分析處理。實驗結果表明,活性炭用量、pH對脫色率、多肽回收率均具有顯著影響,脫色時間對脫色率具有顯著影響,脫色溫度對多肽回收率具有顯著影響;活性炭用量與pH之間的交互作用對兩者均具有顯著影響,脫色時間與溫度、脫色時間與pH之間的交互作用對脫色率具有顯著影響,溫度與pH之間的交互作用對多肽回收率具有顯著影響。響應面法優(yōu)化脫色工藝最有條件為活性炭用量10.5%、時間41 min、溫度55 ℃、pH2.8,此條件下,脫色率、多肽回收率理論值分別為78.02%、84.01%。三次平行驗證實驗結果為脫色率77.51%±1.49%、多肽回收率82.26%±2.82%,與理論值接近,模型可靠。該脫色工藝簡單可靠,脫色效果好,多肽回收率高,為魚籽多肽產品后期研發(fā)提供依據。

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Optimization of decoloring process of enzymatic hydrolysate of fish roes peptide by response surface methodology

HU Qing-ping1,2,3,WEI Jian-teng2,3,PEI Dong2,3,WANG Ning-li2,3,LIU Ye-wei1，*,DI Duo-long2,3

(1.Institute of Nutrition and Food Hygiene,faculty of Public Health,Lanzhou University,Lanzhou 730000,China;2.Key Laboratory of Chemistry of Northwestern Plant Resources and Key Laboratory for Natural Medicine of Gansu Province,Lanzhou Institute of Chemical Physics,Chinese Academy of Sciences,Lanzhou 730000,China;3.Center of Resource Chemical & New Material,Qingdao,Qingdao 266100,China)

Enzymatichydrolysateoffishroespeptidewasdecoloredbyactivatedcarbon.Theeffectofthedoseofactivatedcarbon,time,temperatureandpHonthedecoloringwasinvestigatedbydecoloringrateandpeptideretentionratedetected.Basedontheresultsofsinglefactorexperiments,thedecoloringprocesswasoptimizedbyresponsesurfacemethodology.Theresultsshowedthattheoptimalconditionswereasfollows:theamountofactivatedcarbon10.5%(m/m),time41min,temperature55 ℃,pH2.8.Underthisoptimalconditions,thedecoloringratewas77.51%±1.49%,thepeptideretentionratewas82.26%±2.82%whichwasnotsignificantwiththetheoreticalvalue.Thedecoloringprocesswassimple,reliable,highpeptideretentionrateandhighdecoloringrate.Theresultswouldprovideatheoreticalfoundationforthedevelopmentoffishroespeptide.

fishroespeptide;decoloring;responsesurfacemethodology;thedecoloringrate;thepeptideretentionrate

2016-05-30

胡慶蘋(1989-)，女，碩士研究生，研究方向：天然產物研究與開發(fā)，E-mail:huqp14@lzu.edu.cn。

*通訊作者:劉曄瑋(1962-)，女，碩士，教授，研究方向：天然產物研究與開發(fā)，E-mail:liuyw@lzu.edu.cn。

國家高技術研究發(fā)展計劃(863計劃)(2014AA022203)；國家自然科學基金(21505143)；青島市民生計劃(15-8-2-6-hy)。

TS254.9

B

1002-0306(2016)21-0189-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.21.028