烏林哈德，石瑞麗

(包頭醫(yī)學院生理教研室，內(nèi)蒙古 包頭014060)

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缺血性神經(jīng)元死亡形式及其相關(guān)信號轉(zhuǎn)導通路研究進展*

烏林哈德，石瑞麗

(包頭醫(yī)學院生理教研室，內(nèi)蒙古 包頭014060)

缺血性腦卒中是大腦的某個區(qū)域血流量突然減少或血液循環(huán)出現(xiàn)障礙，包括血栓形成和相對血流灌注不足，導致相應的神經(jīng)功能失活。通常缺血幾秒到數(shù)分鐘內(nèi)，缺血應激模式啟動，隨后發(fā)生一系列生化反應，最終導致梗塞中心的細胞膜崩解直至神經(jīng)元死亡。神經(jīng)細胞死亡過程涉及復雜的時間和空間級聯(lián)反應，細胞自噬(autophagy)、凋亡(apoptosis)和程序性壞死(necroptosis)這幾種不同的細胞死亡形式通常相互誘導。

1細胞自噬

細胞自噬是指自噬前體結(jié)構(gòu)不斷延伸成雙膜囊泡，包裹一些受損蛋白或細胞器，形成自噬體后與酸性溶酶體融合，將內(nèi)吞的胞質(zhì)物質(zhì)降解以重新利用的過程。微管相關(guān)蛋白(microtubule-associated protein light chain 3, LC3)和自噬基因Beclin1均參與自噬體形成，Beclin1是參與自噬調(diào)控的重要基因，而LC3在自噬形成時由LC3-Ⅰ與磷脂酰乙醇胺結(jié)合轉(zhuǎn)變?yōu)長C3-Ⅱ。

1.1細胞自噬與腦缺血生理情況下細胞自噬主要維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，但自噬不足或過剩都會導致細胞死亡，自噬程度是細胞存亡的關(guān)鍵。應用改良Levine/Vannucci小鼠缺氧缺血模型研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)元中出現(xiàn)細胞色素C和凋亡誘導因子的釋放以及半胱氨酸天冬酶-8(caspase-8)和半胱氨酸天冬酶-9(caspase-9)的裂解，而作為各種凋亡通路最終調(diào)節(jié)因子的半胱氨酸天冬酶-3(caspase-3)并未被激活，進一步的電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，受損的神經(jīng)元并沒有表現(xiàn)出凋亡、壞死等形態(tài)學特征，相反卻出現(xiàn)了大量自噬小體[1]。在體外氧糖剝奪/再灌注細胞模型中發(fā)現(xiàn)，LC3和Beclin1表達明顯增加，用Fluoro-Jade C熒光和電子顯微鏡觀察到復氧后的神經(jīng)元死亡比率很高，加入自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine，3-MA)，細胞死亡率顯著減少[2]。觀察新生大鼠不同時間點缺氧缺血性損傷后細胞自噬相關(guān)蛋白LC3和Beclin-1的變化，發(fā)現(xiàn)海馬組織中的Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白質(zhì)表達水平在0 h后開始增加，24 h后達到峰值，隨后開始下降，并且在所有時間點內(nèi)，Beclin-1和LC3-Ⅱ的表達明顯高于假手術(shù)組，低于自噬誘導劑處理組[3]。研究發(fā)現(xiàn)[4]，腦缺血再灌注損傷導致腦微血管內(nèi)皮細胞(brain microvascular endothelial cell, BMVEC)發(fā)生自噬，從而減少血腦屏障的破壞。通過體外培養(yǎng)BMVEC細胞并模擬大腦缺血再灌注損傷模型，分別提前0.5 h給予自噬抑制劑3-MA和自噬誘導劑哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)，發(fā)現(xiàn)3-MA明顯加劇BMVEC凋亡，而且升高活性氧水平。

細胞自噬作用與腦缺血后的時間有相關(guān)性。腦缺血后使用自噬誘導劑mTOR進行再灌注，可能會減弱自噬的神經(jīng)保護作用，相反，在再灌注前使用3-MA會發(fā)現(xiàn)梗死面積明顯減少，并且阻斷了腦水腫的進展[5]。研究高壓氧對腦缺血保護作用時發(fā)現(xiàn)，提前側(cè)腦室注射3-MA再灌注后明顯減弱高壓氧對腦缺血保護作用。而在大腦中動脈閉塞前給3-MA處理會加重腦損傷，使用mTOR處理可觀察到LC3-Ⅱ和Beclin基因表達上調(diào)，出現(xiàn)與高壓氧預處理相似的神經(jīng)保護作用，提示高壓氧預處理可能增加細胞自噬[6]。

1.2mTOR信號通路與細胞自噬細胞自噬涉及多種信號通路，主要包括mTOR信號通路、磷脂酰肌醇-3激酶/絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶(phosphoimsitide-3 killase/serine-threonine kinase，PI3K/Akt)信號通路、活性氧(reactive oxygen species，ROS)信號通路和核轉(zhuǎn)錄因子(nuclear factor-κB，NF-κB)信號通路，其中mTOR信號通路不僅在細胞代謝，細胞生長發(fā)育和細胞存活的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，而且在腦缺血中起著至關(guān)重要的作用。mTOR是一種存在于真核生物、進化上高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，屬于磷脂酰肌醇激酶家族。mTOR包括兩種復合物形式，分別是mTOR復合物1(mTORC1)和mTOR復合物2(mTORC2)，前者主要參與細胞自噬、細胞凋亡和能量代謝的調(diào)節(jié)，后者與細胞骨架重組有關(guān)。與自噬相關(guān)的mTORC1活性受氨基酸水平影響，而氨基酸主要由鳥苷三磷酸和絲裂原蛋白激酶3(mitogen-activated protein kinase 3，MAPK3)介導生成，兩者活性均受亮氨酸調(diào)控。腫瘤抑制基因p53是mTOR的重要調(diào)節(jié)器，利用體外培養(yǎng)原代小鼠神經(jīng)元細胞建立氧糖剝奪/復灌(OGD/R)損傷模型，通過使用p53抑制劑或誘導劑觀察其是否對OGD/R損傷有影響。結(jié)果表明，激活p53基因會抑制mTOR的表達加劇損傷，相反，抑制p53基因表達后mTOR活性上調(diào)，細胞損傷減輕[7]。

研究發(fā)現(xiàn)，自噬可能會在腦缺血中被中斷。許多神經(jīng)變性疾病的一個共同的特征是大量異常的自噬體或自噬溶酶體堆積，或是不規(guī)則的自噬小體頻繁出現(xiàn)?？赡苡袃煞N原因：第一種是自噬信號和自噬流增加，因此檢測到自噬的各個水平的標記物增加；第二種情況是自噬信號本身沒有變化，而是由于自噬小泡不能被溶酶體降解，而使得自噬小泡積累或是溶酶體出現(xiàn)功能障礙[8]。因此通常檢測自噬發(fā)生，除了需要檢測LC3是否有增加，還需要加上氯喹或者蛋白酶抑制劑等化合物阻斷溶酶體的降解途徑，觀察LC3是否增加更加明顯。

2細胞凋亡

細胞凋亡是腦缺血時細胞死亡的另一種重要方式，也稱為程序性死亡，是腦缺血后神經(jīng)功能缺損的主要原因之一。細胞凋亡發(fā)生迅速，其特征主要有核染色質(zhì)固縮成片段，細胞器皺縮和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的膨脹等。凋亡細胞通常與其相鄰細胞脫離，胞膜有小泡形成，將凋亡細胞殘骸分割包裹為凋亡小體，凋亡小體的質(zhì)膜保持完整性防止細胞質(zhì)泄漏引發(fā)炎癥反應。

2.1細胞凋亡與腦缺血 缺血性腦卒中發(fā)生早期，缺血中心區(qū)腦血流急劇下降發(fā)生能量代謝障礙，神經(jīng)細胞死亡以壞死為主；而缺血中心區(qū)周圍(缺血半暗帶)的神經(jīng)細胞在周邊血流供應下仍然具有代謝活力，其后續(xù)的死亡形式以凋亡為主。在大鼠大腦中動脈局灶缺血模型中[9]，活化的半胱天冬蛋白酶可同時介導細胞內(nèi)和細胞外兩條凋亡信號轉(zhuǎn)導通路，外源性途徑(又稱細胞死亡受體途徑)是通過活化的自殺基因(factor associated suicid，F(xiàn)as)受體與配體(Fas ligand，F(xiàn)as-L)結(jié)合后被啟動，在缺血半暗帶可觀察caspase-1、caspase-3、caspase-8、caspase-9以及裂解的caspase-8表達增加。內(nèi)源性途徑(又稱線粒體途徑)激活是指促凋亡蛋白Bax或Bcl-2家族其他成員易位到線粒體膜上形成線粒體跨膜通道，從而引起凋亡誘導因子細胞色素C的釋放，細胞色素C通過凋亡酶激活因子(apoptotic protease activating facter-1，Apaf-1)的多聚化與caspases-9形成凋亡小體，而Bcl-2過度表達會減少梗死面積。caspase-8和caspase-9激活caspase-3后進而切割其它關(guān)鍵底物，包括將DNA修復酶聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase，PARP)切割成89 kDa和28 kDa的片段。相反，抑制caspase-3會縮小梗死面積，減少腦損傷。另外，caspase-8可以裂解Bcl-2家族中的Bid，裂解后的片段易位至線粒體上，增加細胞色素C的釋放能力。另有數(shù)據(jù)顯示線粒體是氧化應激引起細胞凋亡的重要通路。發(fā)生腦缺血時線粒體能量代謝產(chǎn)生障礙，能量合成受阻，導致神經(jīng)元死亡。研究發(fā)現(xiàn)，用氰化物對大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細胞進行氧糖剝奪后，還原型輔酶Ⅰ(nicotinamide adenine dinucleotide hydrogen，NADH)和還原型輔酶Ⅱ(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate hydrogen，NADPH)的含量減少，恢復氧糖供應后，NADH和NADPH的含量有所增加，提示線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeablity transition pore，mPTP)促進NAD(H)釋放，同時PARP被激活使NADP(H)發(fā)生降解[10]。細胞ATP逐漸耗盡，依靠ATP運轉(zhuǎn)的離子泵活性受阻，導致細胞內(nèi)鈣離子和鈉離子超載，使線粒體腫脹和線粒體外膜破裂，引起遲發(fā)性細胞損傷。

2.2絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)信號通路與細胞凋亡細胞凋亡機制復雜，有多種信號轉(zhuǎn)導通路參與介導，主要包括線粒體通路、死亡受體通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路又包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)前凋亡因子CHOP通路、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun NH2-terminal Kinase，JNK)通路和caspase通路。JNK和p38MAPK都屬于MAPKs，是細胞內(nèi)的一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在細胞調(diào)亡過程中具有至關(guān)重要的作用，可被不同生長因子和G-蛋白偶聯(lián)受體激活，腦卒中后通過激活細胞促炎和促凋亡信號加中腦損傷。腦缺血時活化的JNK轉(zhuǎn)移至細胞核內(nèi)并使其下游作用底物c-Jun磷酸化，促進線粒體中細胞色素C向胞漿釋放，進而激活線粒體凋亡信號通路；p38MAPK是MAPK的蘇氨酸和酪氨酸殘基的特定位置發(fā)生雙重磷酸化而被激活，p38MAPK可通過增強Fas/Fas-L的表達促進細胞凋亡[11]，并介導炎癥反應。體外培養(yǎng)小膠質(zhì)細胞及建立氧糖剝奪模型發(fā)現(xiàn)，p38MAPK可激活小膠質(zhì)細胞，腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF-α)和白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)表達增加。小鼠MCAO模型中，敲除小鼠的絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶(Mitogen activated protein kinase phosphatase-1，MKP-1)基因和使用MKP-1抑制劑后發(fā)現(xiàn)，JNK和小膠質(zhì)細胞中p38MAPK被激活，腦梗塞增加，導致神經(jīng)功能障礙和出血量增多，提示MKP-1可使MAPKs快速發(fā)生去磷酸化，抑制其活性[12]。

3程序性細胞壞死

長期以來，細胞壞死被認為是一種不受控制的被動死亡方式，但是越來越多的研究表明細胞壞死并不是完全不受調(diào)控的、被動的死亡方式，在某些情況下，可以通過信號轉(zhuǎn)導通路進行且不依賴caspase激活。2005年Degterev等提出了“程序性細胞壞死”的概念[13]，這種死亡細胞與傳統(tǒng)壞死細胞具有相似的形態(tài)學特點，表現(xiàn)為細胞質(zhì)腫脹，細胞膜破裂，內(nèi)容物釋放，但程序性細胞壞死伴有自噬現(xiàn)象。程序性細胞壞死主要由受體相互作用蛋白激酶1(receptor-interacting protein kinase 1，RIPK1)和受體相互作用蛋白激酶3(receptor-interacting protein kinase 3，RIPK3)控制，RIP1和RIP3有一段特殊的蛋白相互作用區(qū)域，促進RIP1與RIP3相互作用,使兩者相互磷酸化形成壞死復合物[14]。研究表明，程序性細胞壞死在許多疾病模型中加劇病理性損傷。

3.1程序性細胞壞死與腦缺血腦缺血發(fā)生后，缺血中心區(qū)的細胞由于血流中斷能量代謝障礙，發(fā)生壞死，在細胞形態(tài)還未發(fā)生明顯變化時開始產(chǎn)生活性氧，當細胞膜破裂時，產(chǎn)生的活性氧達峰值，大量的活性氧激活NF-κB，使其產(chǎn)生細胞炎癥因子，增加活性氧的毒性和興奮性，促進缺血神經(jīng)元的變性，同時細胞內(nèi)容物泄漏引起炎癥反應，加重腦損傷。

3.2TNF-α受體介導信號通路與程序性壞死當中樞神經(jīng)系統(tǒng)受到各種刺激，包括感染和損傷時，活化的小神經(jīng)膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞可以產(chǎn)生TNF-α，是介導程序性細胞死亡的主要信號通路，發(fā)生過程是TNF-α與受結(jié)合后誘導復合蛋白物I形成，進一步在胞質(zhì)內(nèi)形成蛋白復合物Ⅱ，后者是死亡誘導信號復合物，蛋白復合物2包括去泛化素化的PIP1和caspase-8，當caspase-8活性受抑制時，RIPl/RIP3被磷酸化，磷酸化的RIPl/RIP3及RIP3下游因子形成復合物Ⅱb，即壞死小體(necrosome)，最終誘導細胞壞死。雖然DNA修復酶PARP已被證明是TNF-α介導程序性細胞壞死的一個關(guān)鍵因素。但有實驗證明[15]，TNF-α和PARP通路所誘導的程序性細胞壞死并不完全相同。首先，DNA的烷基化劑如1-甲基-3-硝基-1-亞硝基胍(1-Methyl-3-nitro-1-nitrosoguanidine，MNNG)或甲磺酸甲酯會迅速激活PARP途徑，而在TNF誘導細胞壞死過程中較晚才發(fā)生。第二，抑制PARP通路對TNF誘導的細胞壞死沒有保護作用，如PARP-1抑制劑3-氨基苯酰胺(3-Aminobenzamide，3-AB)可以抑制MNNG，對TNF-α引起的5’-三磷酸腺苷耗竭、凋亡誘導因子易位和細胞壞死沒有影響。第三，用神經(jīng)酰胺干擾TNF-α誘導細胞凋亡，但沒有阻止RIP1或RIP3功能或自由基清除劑丁基羥基苯甲醚PARP引發(fā)程序性細胞壞死。

4自噬、凋亡和壞死的關(guān)系

目前，對細胞自噬、凋亡和壞死之間的具體聯(lián)系和相互作用沒有完全明確，但現(xiàn)有大量證據(jù)顯示，凋亡可以改變自噬。如果自噬無法維持細胞存活，則細胞可以通過激活細胞凋亡途徑以確保它們得到有效控制和消除，避免發(fā)生炎癥反應。因此，自噬和凋亡(反之亦然)之間的調(diào)節(jié)關(guān)系可以表示為細胞進化優(yōu)勢。細胞自噬和凋亡從根本上有著明確不同的生物化學和形態(tài)特征，但是它們的調(diào)節(jié)和執(zhí)行蛋白是緊密相連。凋亡和自噬既可以相互抑制又可以相互誘導。自噬減少細胞凋亡發(fā)生的主要機制是發(fā)生線粒體自噬。在細胞死亡過程中，外膜蛋白會引起線粒體代謝水解酶的釋放和膜電位的消失，引起生物能紊亂。但是一些在自噬中起重要作用的蛋白質(zhì)也可能是促凋亡因子，例如自噬相關(guān)基因ATG12(autophagy related gene 12)和ATG5(autophagy related gene 15)是形成自噬體的重要蛋白質(zhì)，但同時也是激活細胞凋亡的信號因子[16]。程序性細胞壞死與凋亡均是由死亡受體介導的兩種不同的細胞死亡方式，但程序性細胞壞死既不依賴于caspase，也不需線粒體釋放細胞色素C，細胞在caspase活性被抑制而不能發(fā)生凋亡的情況下才會啟動程序性壞死，RIPK3是引起程序性細胞壞死必不可少的因素，也是調(diào)控caspase-8是否活化激活細胞凋亡級聯(lián)反應的關(guān)鍵。

綜上所述，腦缺血損傷后神經(jīng)元的死亡是一個多途徑、多因素的復雜病理過程，雖然自噬、程序性壞死、凋亡都被激活，但呈現(xiàn)不同的時程變化，發(fā)揮的作用也不盡相同。某些作用于信號轉(zhuǎn)導通路的藥物已被證實對缺血性腦損傷發(fā)揮了良好的保護作用。因此，更加透徹地闡明各種死亡形式的作用機制，對于阻礙腦缺血損傷后神經(jīng)元的死亡，尋找新的藥物治療靶點，篩選優(yōu)秀的抗腦缺血藥物具有重要的理論和現(xiàn)實意義。

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*基金項目：國家自然科學基金資助項目(No 81450058)；內(nèi)蒙古自治區(qū)自然科學基金項目(No 2013MS1108)

通訊作者：石瑞麗

(收稿日期：2015-06-15)