王新玲，李昭昭，古扎麗努爾·阿不力孜，夏 鳴

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院婦外四科，烏魯木齊 830011；2.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院婦外五科，烏魯木齊 830011;3.重慶醫(yī)科大學(xué)第一臨床學(xué)院，重慶400046)

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·論 著·

維吾爾族宮頸病變中VEGF-C與HPV相關(guān)性研究*

王新玲1，李昭昭1，古扎麗努爾·阿不力孜2△，夏 鳴3

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院婦外四科，烏魯木齊 830011；2.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院婦外五科，烏魯木齊 830011;3.重慶醫(yī)科大學(xué)第一臨床學(xué)院，重慶400046)

目的 探討血管內(nèi)皮生長因子C(VEGF-C)在維吾爾族宮頸病變[宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)Ⅰ～Ⅲ及早期宮頸癌]組織中的表達(dá)及其與人乳頭瘤病毒(HPV)載量相關(guān)性。方法 采用實時熒光定量PCR(Real-timePCR)法測定140例維吾爾族婦女(慢性宮頸炎30例，CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ各20例,早期宮頸癌50例)宮頸石蠟切片組織中VEGF-C的水平；術(shù)前用第2代雜交捕獲(HC-Ⅱ)方法測定同一患者術(shù)前宮頸HPV載量；比較2個指標(biāo)同宮頸病變的關(guān)聯(lián)。結(jié)果CINⅡ、CINⅢ及早期宮頸癌組織VEGF-C水平、宮頸病變程度及HPV載量均高于慢性宮頸炎組織(P<0.05)；組織中VEGF-C水平與HPV載量呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 新疆維吾爾族婦女宮頸組織中VEGF-C水平、HPV載量均與宮頸病變嚴(yán)重程度相關(guān)，且二者存在協(xié)同作用。

宮頸腫瘤；宮頸疾??；血管內(nèi)皮生長因子；人乳頭瘤病毒

宮頸癌在女性惡性腫瘤中發(fā)病率排第4位[1]，是維吾爾族婦女高發(fā)的惡性腫瘤，總生存率排第7位[2-3]。據(jù)報道，宮頸癌發(fā)病人數(shù)約有50萬/年，死亡人數(shù)將近3萬/年。在中國，新疆是宮頸癌高發(fā)的地區(qū)。目前已經(jīng)確定人乳頭瘤病毒 (human pappilomavirus,HPV)的持續(xù)感染是宮頸癌前病變發(fā)生及進(jìn)展為宮頸癌的病因，但并不是全部HPV持續(xù)感染的女性都會罹患宮頸癌，這表明在宮頸癌發(fā)病過程中尚存其他協(xié)同因素[4-5]。本研究通過采用實時熒光定量PCR(Real-time PCR)和HPV DNA第2代雜交捕獲((hybrid captureⅡ,HC-Ⅱ)法分別檢測140例維吾爾族宮頸病變患者組織中血管內(nèi)皮生長因子C(vascular endothelial growth factor C,VEGF-C)的RNA表達(dá)水平及HPV病毒載量，以明確VEGF-C在新疆維吾爾族婦女宮頸病變發(fā)生、發(fā)展中的作用，及VEGF-C的RNA表達(dá)水平與HPV載量的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013年12月到2015年6月符合納入標(biāo)準(zhǔn)的新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院住院患者的病理標(biāo)本。石蠟標(biāo)本：慢性宮頸炎30例(作為正常對照組)、宮頸上皮內(nèi)瘤變 (cervical intraepithelial neoplasia CIN) Ⅰ20例、CINⅡ 20例、CINⅢ20例、早期宮頸癌 50例并取同一患者治療前的宮頸HPV(定量)標(biāo)本。標(biāo)本納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)所有患者均為維吾爾族婦女；(2)慢性宮頸炎標(biāo)本均為子宮肌瘤行全子宮切除術(shù)后標(biāo)本，均未合并任何宮頸疾病或其他影響試驗結(jié)果的疾??；(3)CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ均為初治錐切大體標(biāo)本；(4)早期宮頸癌FIGO 2009分期ⅠB1～ⅡA1期均為鱗癌術(shù)后大體標(biāo)本，術(shù)前未經(jīng)過輔助放化療。

1.2 方法

1.2.1 儀器與試劑 RNAprep Pure FFPE Kit(DP439，天根，北京)；FastQuant RT Kit (KR106-02，天根，北京)；SYBR Select Master Mix (4472920，ABI，USA);梯度PCR儀(MyCycler Thermal Cycler,Bio-Rad,USA);Real-time PCR 儀器 (7500,ABI,USA)。

表1 宮頸病變與HPV載量相關(guān)性分析[n(%)]

1.2.2 總RNA抽提和cDNA合成 石蠟樣品切成5～10 μm厚的片狀，取出2～8張切片放置于1.5 mL RNase-Free離心管中，向離心管中加入1.0 mL二甲苯劇烈渦旋10 s，室溫15～25 ℃，12 000 r/min 離心2 min。加入1.0 mL無水乙醇渦旋混勻，室溫15～25 ℃，12 000 r/min 離心2 min。37 ℃放置10 min。加入200 μL裂解液RF，10 μL Proteinase K徹底渦旋混勻55 ℃孵育15 min，80 ℃孵育15 min，室溫15～25 ℃，12 000 r/min離心5 min。加入220 μL的緩沖液RB，660 μL的無水乙醇，12 000 r/min 離心1 min。加入80 μL的DNase Ⅰ工作液，室溫15 min。加入500 μL去蛋白液RW1，室溫15～25 ℃，12 000 r/min 離心30～60 s。加入500 μL漂洗液RW，室溫靜置2 min，12 000 r/min離心30～60 s；室溫15～25 ℃，12 000 r/min離心2 min。懸空滴加30～100 μL RNase-Free雙蒸水(ddH2O)，室溫12 000 r/min離心2 min，得到RNA溶液。核酸蛋白定量儀檢測RNA濃度、A260/A280，電泳檢測RNA完整性。RNA樣本按照5×g DNA Buffer 2 μL、Total RNA、RNase-Free ddH2O補(bǔ)足到 10 μL配置好體系簡短離心(42 ℃，孵育3 min)。 將反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中的Mix(10×Frist-Strand Buffer 2 μL，RT Primer Mix 1 μL，F(xiàn)Q-RT Primer Mix 2 μL，RNase-Free ddH2O補(bǔ)足到 10 μL)加入反應(yīng)液混勻(42 ℃，15 min；95 ℃，孵育3 min)，得到的cDNA。

1.2.3 Real-time PCR檢測 引物由歐易生物公司設(shè)計合成，反應(yīng)體系：Forward primer (10 μmol/L)0.4 μL，Reverse primer(10 μmol/L) 0.4 μL，SYBRR Select Master Mix (2X) 10.0 μL，cDNA template 1.0 μL，RNase-Free water加至20.0 μL。上游引物：5′-GGC TGG CAA CAT AAC AGA GAA-3′，引物長度21 bp，下游引物： 5′-CCC CAC ATC TAT ACA CAC CTC C-3′， 引物長度22 bp。每個樣品重復(fù)3次實驗，通過觀察樣品擴(kuò)增曲線和熔解曲線，了解實驗情況。同時進(jìn)行內(nèi)參基因β-Actin檢測。將標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行l(wèi)0倍梯度稀釋拷貝5個梯度后，進(jìn)行Real-time PCR，將陽性梯度的模板濃度和對應(yīng)的CT值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的計算，相對表達(dá)量=2-ΔΔCt。

1.2.4 高危型HPV的檢測 手術(shù)前采用HC-Ⅱ法檢測患者宮頸HPV載量。用專用HPV取樣器,插入宮頸外口,順/逆時針(同方向)轉(zhuǎn)動5～8圈,取出后放入含有保存液的配套試管中，隨后送至該院檢驗科進(jìn)行檢測。HPV試劑購于上海凱杰企業(yè)管理有限公司(Qiagen Gaithersburg,MD20878,Inc)。HC-Ⅱ檢測樣本中HPV-DNA水平。具體操作步驟由檢驗科的檢驗專業(yè)醫(yī)師操作，按試劑盒說明的詳細(xì)步驟進(jìn)行檢測。

2 結(jié) 果

2.1VEGF-C的表達(dá) 各組組織中VEGF-C基因的相對表達(dá)量不同，其中CINⅡ[(1.158±0.144)pg/mL]、CINⅢ[(2.161±0.288)pg/mL]及早期宮頸癌[(2.929±0.600)pg/mL]組織中VEGF-C水平比慢性宮頸炎[(1.009±0.135)pg/mL]組織明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；CINⅢ及早期宮頸癌組織中VEGF-C水平比CINⅠ[(1.071±0.124)pg/mL]、CINⅡ均明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；早期宮頸癌組織中VEGF-C水平比慢性宮頸炎、CINⅠ～Ⅲ組織均明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.2HPV的感染情況HPV在慢性宮頸炎、CINⅠ～Ⅲ和早期宮頸癌中的感染情況(HPV載量大于1為感染)分別為 3/30(10%)、16/20(80%)、17/20(85%)、19/20(95%)和50/50(100%)，病變程度越高，HPV感染率亦明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1；HPV載量同宮頸病變程度有相關(guān)性，呈中度正相關(guān)(r=0.59，P<0.01)。

2.3VEGF-C和HPV載量的關(guān)系 經(jīng)Spersman等級相關(guān)分析,VEGF-C在宮頸病變的表達(dá)水平與HPV載量有相關(guān)性，呈正相關(guān)(r=0.179，P=0.035)。

3 討 論

3.1VEGF-C與宮頸病變的關(guān)系VEGF在目前已知的各種淋巴管內(nèi)皮生長刺激因子中特異性最高，其中VEGF-C最為顯著。VEGF-C是目前公認(rèn)的淋巴管生成因子，可以導(dǎo)致淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、分化、遷移，在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)移過程中起重要作用。有研究表明,VEGF-C在正常宮頸組織中不表達(dá)，在CINⅡ～Ⅲ及宮頸鱗癌組織中表達(dá)均增高[6]。Inamine等[7]研究證明，VEGF-C是宮頸癌變的早期標(biāo)志物，并與CIN級別呈正相關(guān)。也有研究證明，VEGF-C可促進(jìn)腫瘤直徑增大、原發(fā)腫瘤進(jìn)展，從而導(dǎo)致局部浸潤、淋巴結(jié)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，最終可在一定程度上影響腫瘤預(yù)后[8-10]。本研究結(jié)果顯示，高級別宮頸病變(CINⅡ～Ⅲ及宮頸癌)組織中VEGF-C水平比慢性宮頸炎組織明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；在慢性宮頸炎、CINⅠ～Ⅲ和宮頸癌發(fā)展過程中水平逐漸增高,在宮頸癌中最高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。說明VEGF-C與維吾爾族宮頸癌發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，可能在CIN發(fā)展為宮頸癌并繼續(xù)進(jìn)展轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮一定作用，本研究與其他研究結(jié)果相符。

3.2HPV載量與宮頸病變的關(guān)系HPV主要侵犯皮膚和黏膜的上皮細(xì)胞。HPVE基因編碼的蛋白具有多種調(diào)控功能，E6、E7是最重要的調(diào)控蛋白，可促使腫瘤發(fā)生、發(fā)展。研究已經(jīng)確定，高危型HPV病毒的持續(xù)感染可以導(dǎo)致宮頸癌前病變發(fā)生并最終發(fā)展為宮頸癌。呂倩靈等[11]認(rèn)為宮頸癌及其癌前病變的發(fā)生、發(fā)展與高危型HPV的感染及其病毒載量高低密切相關(guān)。高玉華等[12]針對各級別宮頸病變中HPV病毒載量的分布研究發(fā)現(xiàn)，HPV病毒載量與宮頸病變的嚴(yán)重程度具有密切相關(guān)性，HPV病毒較高載量的持續(xù)感染預(yù)示著宮頸高級別病變發(fā)生率增高。本研究的結(jié)果表明，維吾爾族各級別宮頸病變與慢性宮頸炎組織相比，HPV感染率明顯升高，且宮頸HPV感染率與宮頸上皮細(xì)胞損傷嚴(yán)重程度呈正比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(r=0.59，P<0.01)。

3.3VEGF-C和HPV的關(guān)系HPV致癌機(jī)制尚不完全明確，目前關(guān)于HPV載量和VEGF-C相關(guān)性的研究尚不多見。Huang等[13]通過PCR的方法將HPV-16E6陽性的細(xì)胞同HPV-16E6陰性的比較，發(fā)現(xiàn)HPV的原癌基因可能通過直接作用于VEGF-C的基因啟動子區(qū)促進(jìn)腫瘤血管生成，提示VEGF-C的表達(dá)與HPV密切相關(guān)。還有研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)HPV-16E6原癌蛋白可以激活缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)，增強(qiáng)了VEGF-C的釋放，同時，HPV-16E5的原癌蛋白還通過激活多條信號通路上調(diào)了VEGF-C的表達(dá)[14-16]。目前試驗結(jié)果表明，HPV、VEGF-C在細(xì)胞周期調(diào)控之間可能存在著極其復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)化的相互聯(lián)系，二者在宮頸癌前病變及宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展及腫瘤血管生成過程中發(fā)揮協(xié)同作用，因此認(rèn)為HPV的免疫表達(dá)同VEGF-C的密度顯著相關(guān)，HPV感染可能刺激了宮頸癌中腫瘤血管生成，這是HPV引發(fā)宮頸癌的重要機(jī)制之一。本研究結(jié)果顯示，維吾爾族婦女各級別宮頸病變組織中VEGF-C表達(dá)水平和高危HPV載量呈正相關(guān)(r=0.18，P<0.01)，提示二者之間存在一定的內(nèi)在聯(lián)系，但相關(guān)性較弱?？紤]可能為本研究樣本量較小，需前瞻性大樣本試驗進(jìn)一步證實維吾爾族患者HPV是否通過提高VEGF-C水平而導(dǎo)致惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展及播散。還有研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)HPV-16E6原癌蛋白可以激活HIF-1α，增強(qiáng)了VEGF-C的釋放，同時，HPV-16E5的原癌蛋白還通過激活多條信號通路上調(diào)了VEGF-C的表達(dá)[12-14]。因此有理由認(rèn)為HPV的免疫表達(dá)同VEGF-C的水平顯著相關(guān)，HPV感染可能刺激了宮頸癌中腫瘤血管生成，這是HPV引發(fā)宮頸癌的重要機(jī)制之一。目前試驗結(jié)果表明，HPV、VEGF-C在細(xì)胞周期調(diào)控之間可能存在著極其復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)化的相互聯(lián)系，二者在宮頸癌前病變及宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展及腫瘤血管生成過程中發(fā)揮協(xié)同作用。

高危型HPV的感染可促進(jìn)VEGF-C表達(dá)增加，進(jìn)一步引起宮頸癌組織的血管生成，是宮頸癌發(fā)生、侵襲及轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制之一。但目前高危型HPV感染如何促進(jìn)血管內(nèi)皮生長因子C在腫瘤血管及淋巴管形成中的作用和具體機(jī)制尚不完全明確，需要進(jìn)一步的研究，若明確其作用，則可以通過阻斷該途經(jīng)，從而防止CIN向?qū)m頸癌發(fā)展。

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Correlation between the expression of VEGF-C and HPV load in cervical disease of Vighur population*

WangXinling1,LiZhaozhao1,Guzalnur·Abuliz2△，XiaMing3

(1.4thDepartmentofGynecologicSurgery，XinjiangMedicalAffiliatedTumorHospital，Urumqi，theXinjiangUygurAutonomousRegion830011，China;2.5thDepartmentofGynecologicSurgery，XinjiangMedicalAffiliatedTumorHospital，Urumqi，theXinjiangUygurAutonomousRegion830011，China;3.theFirstClinicalCollegeofChongqingMedicalUniversity，Chongqing400046，China)

Objective To study the relations between the expression of VEGF-C and HPV load in cervical disease in Uighur population of Xinjiang.Methods A total of 140 cases including 30 cases of normal cervical tissues,60 cases of CINⅠ-Ⅲ and 50 cases of cervical cancer tissues were selected in this experiment.The expression of VEGF-C of all cases were detected by Real-time PCR assay;HPV load were detected by HC-Ⅱ before operation.And we compared the relationship between cervical lesions and these two index.Results VEGF-C and HPV load were both over-expressed in cervical cancer and CINⅡ-Ⅲ tissues,compared with normal cervical tissues(P<0.05).In cervical cancer samples and CIN samples,the expression level of VEGF-C and the degree of cervical diseases were positive associated with HPV load(P<0.05).Conclusion The expression level of VEGF-C and HPV load are both related to the degree of cervical lesions.

uterine cervical neoplasms；uterine cervical diseases；vascular endothelial growth factor；human pappilomavirus

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.23.002

新疆維吾爾自治區(qū)自然基金(2013211A071)。作者簡介：王新玲(1966-)，主任醫(yī)師，碩士，主要從事婦科腫瘤方面研究?！?/p>

Email：gzlnr@qq.com。

R

A

1671-8348(2016)23-3173-03

2016-04-15

2016-06-30)

*qq.com。