金 笛，何 麗，張海鋒

(1.湖北中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校內(nèi)科教研室，湖北荊州 434020；2.湖北省荊州市中心醫(yī)院呼吸內(nèi)科 434020；3.湖北省荊州市第二人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科 434000)

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內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白與CXCL12蛋白在特發(fā)性肺纖維化中的表達(dá)及意義

金 笛1，何 麗2，張海鋒3△

(1.湖北中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校內(nèi)科教研室，湖北荊州 434020；2.湖北省荊州市中心醫(yī)院呼吸內(nèi)科 434020；3.湖北省荊州市第二人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科 434000)

目的 探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白及CXCL12在特發(fā)性肺纖維化中的表達(dá)及意義。方法 收集荊州市中心醫(yī)院2004～2014年診斷為特發(fā)性肺纖維化且存有活檢或手術(shù)標(biāo)本的患者共18例，并收集正常肺組織20例作為對(duì)照，通過蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白(GRP78、CHOP)及CXCL12蛋白(SDF-1)的表達(dá)，通過逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)檢測(cè)肺組織中GRP78mRNA及CXCL12mRNA的表達(dá)。結(jié)果 與對(duì)照相比，肺纖維化患者肺泡上皮中GRP78、CHOP、CXCL12蛋白表達(dá)均上調(diào)，且GRP78mRNA及CXCL12mRNA也表達(dá)上調(diào)。 結(jié)論 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白及CXCL12在特發(fā)性肺纖維化的發(fā)病過程中起重要作用，可能參與了特發(fā)性肺纖維化的發(fā)生與發(fā)展。

特發(fā)性肺纖維化；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；GRP78；CHOP；CXCL12

特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是一組由多種病因所致的慢性肺間質(zhì)纖維化疾病，是臨床中最常見的特發(fā)性間質(zhì)性肺炎(idiopathic interstitial pneumonia，IIP)，組織病理學(xué)表現(xiàn)為普通型間質(zhì)性肺炎(usual interstitial pneumonia，UIP)。其發(fā)病率隨年齡的增加而明顯上升，但其發(fā)病機(jī)制仍不清楚，且對(duì)傳統(tǒng)治療方法反應(yīng)性差，大多數(shù)患者中位生存時(shí)間僅為3年，患者往往死于漸進(jìn)性呼吸困難和呼吸衰竭[1-3]。近年來研究顯示氧化應(yīng)激、基因突變、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、TGF-β激活可能均參與了肺纖維化的發(fā)病過程[4-6]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是十分重要的細(xì)胞器，和高爾基體共同參與了分泌蛋白和膜蛋白的生成、折疊和包裝。當(dāng)細(xì)胞對(duì)蛋白合成的需求與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白生成能力不平衡時(shí)就會(huì)發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplas-mic reticulum stress，ERS)，當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能持續(xù)紊亂，細(xì)胞將最終啟動(dòng)Caspase12依賴的細(xì)胞凋亡程序，最終參與疾病的發(fā)生、發(fā)展。已有研究顯示其在心血管、肝臟及癌癥等疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要作用，但ERS在IPF中的研究較少[7]。CXCL12是一種小分子的細(xì)胞因子，屬于CXC趨化因子家族，纖維細(xì)胞可表達(dá)細(xì)胞因子受體CXCR4和CCR2，CXCL12是CXCR4的配體，通過配體結(jié)合可以募集纖維細(xì)胞并參與纖維化的進(jìn)程[8]。本研究收集臨床及病理診斷為IPF的患者標(biāo)本，觀察肺組織中ERS相關(guān)蛋白及CXCL12的表達(dá)情況，探討其在IPF中的作用及可能的機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 (1)樣本獲得：收集荊州市中心醫(yī)院病理科2004～2014年檔案中由臨床及病理學(xué)診斷為IPF的病例18例(IPF組)，并收集正常肺組織20例作為對(duì)照組。診斷結(jié)果采用單盲法，由兩名高級(jí)職稱病理醫(yī)師進(jìn)行復(fù)核，實(shí)驗(yàn)材料安全可靠。(2) 試劑和儀器：GRP78及CXCL12抗體購自武漢博士德生物工程有限公司，CHOP抗體購自Santa Cruz公司；與一抗相對(duì)應(yīng)的二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)生物技術(shù)有限公司。石蠟組織蛋白提取試劑盒購自上海信裕生物科技公司，ECL顯色試劑盒購自GE公司，mRNA提取及逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增采用試劑盒購自Invitrogen Life Technology公司。其余采用試劑均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品并按相應(yīng)配方規(guī)范配制。紫外分光光度計(jì)及梯度PCR儀購自德國Eppendorf公司，電泳儀及電泳槽購自美國Bio-Rad公司，凝膠成像系統(tǒng)購自美國Thermo Fisher公司。

1.2 方法

1.2.1 組織總蛋白制備 復(fù)診篩選后病例石蠟包埋組織按7μm厚切取10張石蠟切片，置于1.5mL EP管內(nèi)；加入1.2mL二甲苯脫蠟3次，用1.2mL無水乙醇清洗3次，棄去上層液體后開蓋置于37℃溫箱內(nèi)干燥20min。用超聲波勻漿器在冰浴中間歇?jiǎng)驖{至離心管中混合液無明顯沉淀。按石蠟組織蛋白提取試劑盒說明書提取蛋白并測(cè)定濃度。

1.2.2 蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測(cè) 按測(cè)定濃度取50μg蛋白通過10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酸胺凝膠電泳(SDS-PAGE)(恒定電壓100V)，將蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上(恒定電流200mA,120min)。一抗為兔抗GRP78多克隆抗體、兔抗CHOP多克隆抗體、兔抗CXCL12多克隆抗體；二抗為HRP-羊抗兔抗體，ECL試劑盒顯色。內(nèi)參為GAPDH。

1.2.3 RNA提取[9]所用實(shí)驗(yàn)玻璃器皿常規(guī)清洗浸泡后，置于180℃烤箱中烘烤8h，塑料制品置于0.1%DEPC溶液中浸泡12h后高壓消毒(121℃，30min)以去除RNA酶干擾。切片機(jī)用0.1% DEPC溶液充分清潔，取用0.1% DEPC溶液浸泡的一次性刀片，按5μm厚切取10張石蠟切片，置于RNA酶滅活后的1.5mL EP管內(nèi)；加入1.2mL二甲苯脫蠟3次，每次離心(9000r/min，10min)后均棄去上層液體，用1.2mL無水乙醇清洗3次(離心9000r/min，10min)，棄去上層液體后開蓋置于37℃溫箱內(nèi)干燥20min。加入組織裂解液250μL混勻，加入蛋白酶K(終濃度300mg/L)，置于58℃水浴搖床中消化。消化后的組織在95℃水浴中滅活蛋白酶K(10min)。組織處理完成后，按照試劑盒說明提取總RNA。

1.2.4 RNA濃度測(cè)定及逆轉(zhuǎn)率擴(kuò)增 紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度，取1μg總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)，以GAPDH作為內(nèi)對(duì)照，逆轉(zhuǎn)錄過程按試劑盒說明進(jìn)行。引物序列如下，GRP78正義鏈5′-AAG GTG AAC GAC CCC TAA CAA A-3′,反義鏈5′-GTC ACT CGG AGA ATA CCA TTA ACA TCT-3′；CXCL12正義鏈 5′-CAC CAT TGA GAG GTC GGA AG-3′,反義鏈5′-AAT GAG ACC CGT CTT TGC AG-3′;GAPDH 正義鏈 5′-GGC ATG GAC TGT GGT CAT GA-3′，反義鏈5′-TTC ACC ACC ATG GAG AAG GC-3′。產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖電泳，溴化乙錠染色后置于凝膠成像分析系統(tǒng)內(nèi)觀察。

2 結(jié) 果

2.1 GRP78、CHOP表達(dá) 與對(duì)照組相比，IPF組患者肺纖維化區(qū)域表達(dá)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白相關(guān)蛋白CHOP、GRP78表達(dá)上調(diào)，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

2.2 CXCL12表達(dá) 與正常肺組織相比，特發(fā)性纖維化患者中肺泡上皮CXCL12蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

2.3 GRP78mRNA及CXCL12mRNA表達(dá) 與對(duì)照組相比，IPF組區(qū)域GRP78mRNA及CXCL12mRNA表達(dá)增加，且二者均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。

圖1 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)

圖2 CXCL12蛋白表達(dá)

圖3 GRP78mRNA及CXCL12mRNA表達(dá)

3 討 論

IPF是以肺泡上皮損傷、成纖維細(xì)胞灶形成、細(xì)胞外基質(zhì)聚集為病理特征的一組肺間質(zhì)性疾病。其發(fā)病機(jī)制尚不清楚，可能與感染、藥物、理化刺激、自身免疫性疾病有誘因有關(guān)。IPF目前沒有特異性的治療方法，預(yù)后很差。近年的研究顯示，IPF患者病灶區(qū)域肺泡上皮的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激啟動(dòng)的凋亡途徑是一種新的細(xì)胞凋亡途徑，這一點(diǎn)也和IPF發(fā)病假說中上皮細(xì)胞/間質(zhì)細(xì)胞假說相互印證[10]。本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，IPF患者病灶區(qū)域肺泡上皮內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白CHOP及GRP78表達(dá)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。這也提示了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在IPF發(fā)病過程中發(fā)揮了相應(yīng)的作用。

在IPF發(fā)病過程，纖維細(xì)胞起到了較為重要的作用，纖維細(xì)胞可以直接產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)(如Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原)，可以分化為纖維母細(xì)胞和肌纖維母細(xì)胞，可以產(chǎn)生促膠原沉積的細(xì)胞因子，這些均參與了纖維化的發(fā)病過程。在IPF患者的血液循環(huán)及肺實(shí)質(zhì)內(nèi)中可以發(fā)現(xiàn)纖維細(xì)胞。血液循環(huán)中纖維細(xì)胞的數(shù)量和患者的預(yù)后呈相關(guān)性。在纖維細(xì)胞募集過程中，肺泡上皮細(xì)胞可能起到了關(guān)鍵作用。纖維細(xì)胞表面表達(dá)細(xì)胞因子受體CXCR4，而CXCL12作為CXCR4的配體可以參與纖維細(xì)胞的募集[11]。以往的研究主要集中在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、造成組織損傷，促進(jìn)肺纖維化發(fā)病這一方面。本研究探討了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)上調(diào)時(shí)CXCL12的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，IPF組病灶內(nèi)肺泡上皮CXCL12表達(dá)明顯上調(diào)，這一結(jié)果顯示肺泡上皮細(xì)胞可能通過CXCR4/CXCL12軸募集纖維細(xì)胞參與特發(fā)性肺纖維化的發(fā)病過程。

此外，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白和CXCL12共同表達(dá)上調(diào)也提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能刺激了趨化因子的表達(dá)，進(jìn)一步促進(jìn)肺纖維化的發(fā)生、發(fā)展。有研究顯示，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可以促進(jìn)乳腺癌MCF-7細(xì)胞CCL5表達(dá)上調(diào)，增加腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)、侵襲和轉(zhuǎn)移能力，但具體機(jī)制尚不清楚[12]。通過RT-PCR檢測(cè)肺組織中GRP78mRNA及CXCL12mRNA的表達(dá)結(jié)果顯示，肺纖維化區(qū)域GRP78mRNA及CXCL12mRNA表達(dá)增高，這說明GRP78、CXCL12蛋白的表達(dá)提高，同時(shí)編碼該蛋白的mRNA也升高，可能是由于GRP78、CXCL12的轉(zhuǎn)錄活性被激活所致。

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Expression and significance of endoplasmic reticulum stress associated protein and CXCL12protein in the pathogenesis of idiopathic pulmonary fibrosis

Jin Di1，He Li2，Zhang Haifeng3△

(1.Teaching and Research Division of Internal Medicine，Hubei College of Chinese Medicine，Jingzhou，Hubei 434020,China；2.Department of Respiratory Medicine，Jingzhou Central Hospital，Jingzhou，Hubei 434020，China；3.Department of Respiratory Medicine，the Second Hospital of Jingzhou，Jingzhou，Hubei 434000，China)

Objective To investigate the expression and role of endoplasmic reticulum stress associated protein and CXCL12protein in the pathogenesis of idiopathic pulmonary fibrosis(IPF).Methods From 2004to 2014,lung tissues from idiopathic pulmonary fibrosis patients(n=18) and normal persons(n=20,control) of Jingzhou Central Hospital， were used for detecting the expression of GRP78,CHOP and CXCL12protein by Western blot,and used for detecting the expression of GRP78mRNA and CXCL12mRNA by RT-PCR.Results The expression of GRP78,CHOP and CXCL12protein was up-regulated in idiopathic pulmonary fibrosis patients,also the expression of GRP78mRNA and CXCL12mRNA were higher in patients than normal tissue.Conclusion Endoplasmic reticulum stress related proteins and CXCL12play an important role in the pathogenesis of idiopathic pulmonary fibrosis,which may be involved in the occurrence and development of idiopathic pulmonary fibrosis.

idiopathic pulmonary fibrosis；endoplasmic reticulum stress；GRP78，CHOP；CXCL12

金笛(1974-)，副教授,碩士，主要從事哮喘、肺纖維化研究?！?/p>

論著·臨床研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.29.012

R563.9

A

1671-8348(2016)29-4068-03

2016-02-20

2016-04-08)