侯海軍，張文釗，沈建林，王聰，秦紅靈*

1. 中國(guó)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)過程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410125；2. 中國(guó)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所桃源農(nóng)業(yè)生態(tài)試驗(yàn)站，湖南 桃源 415700

水分管理對(duì)稻田細(xì)菌豐度與群落結(jié)構(gòu)的影響

侯海軍1,2，張文釗1,2，沈建林1,2，王聰1,2，秦紅靈1,2*

1. 中國(guó)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)過程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410125；2. 中國(guó)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所桃源農(nóng)業(yè)生態(tài)試驗(yàn)站，湖南 桃源 415700

目前，不同水分管理?xiàng)l件下，從DNA和RNA水平探究長(zhǎng)期淹水和間歇灌溉對(duì)稻田土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的研究還較少。為探明不同水分管理方式下土壤細(xì)菌數(shù)量和群落結(jié)構(gòu)特征，以長(zhǎng)沙縣金井長(zhǎng)期定位試驗(yàn)為平臺(tái)，提取土壤微生物 DNA和RNA，應(yīng)用熒光定量和限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)和方法分析了兩種水分管理方式——間歇灌溉（稻草和無稻草）和長(zhǎng)期淹水（稻草和無稻草）對(duì)稻田土壤細(xì)菌豐度和群落結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果表明，間歇灌溉稻田細(xì)菌數(shù)量高于長(zhǎng)期淹水稻田。在DNA水平上，間歇灌溉稻田干土細(xì)菌數(shù)量達(dá)到3.9×1010copiesg-1，是長(zhǎng)期淹水稻田干土的2.18倍；有稻草添加時(shí)，間歇灌溉條件下稻田干土細(xì)菌數(shù)量達(dá)到6.1×1010copiesg-1，是長(zhǎng)期淹水稻田干土的2.21倍。在表達(dá)水平上，間歇灌溉條件下稻田干土細(xì)菌數(shù)量達(dá)到2.1×108copiesg-1，是長(zhǎng)期淹水稻田干土的2.58倍；有稻草添加時(shí)，間歇灌溉條件下稻田干土細(xì)菌數(shù)量達(dá)到2.8×108copiesg-1，是長(zhǎng)期淹水稻田干土的1.13倍。間歇灌溉稻田與長(zhǎng)期淹水稻田的細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)存在差異。在DNA水平上，盡管間歇灌溉稻田多樣性指數(shù)與長(zhǎng)期淹水稻田相近，但優(yōu)勢(shì)細(xì)菌種群存在差異。而在表達(dá)水平上，不僅優(yōu)勢(shì)細(xì)菌種群存在差異，而且間歇灌溉稻田土壤細(xì)菌的多樣性顯著高于長(zhǎng)期淹水稻田。在有稻草添加情況下，間歇灌溉稻田多樣性指數(shù)為2.49，而長(zhǎng)期淹水稻田多樣性指數(shù)為0.28?？傊?，水分管理方式對(duì)稻田土壤細(xì)菌豐度和群落影響顯著，間歇灌溉能夠提高水田土壤細(xì)菌的數(shù)量和細(xì)菌的多樣性，從細(xì)菌的豐度和多樣性角度考慮，間歇灌溉是稻田較適宜的水分管理方式。

間歇灌溉；長(zhǎng)期淹水；稻草還田；細(xì)菌豐度；群落結(jié)構(gòu)

我國(guó)亞熱帶地區(qū)稻米產(chǎn)量占全國(guó)的80%，是最為主要的水稻產(chǎn)區(qū)（Wu，2011）。亞熱帶地區(qū)稻田水分管理采用多種方式并存，其中季節(jié)性持續(xù)淹水和間歇灌溉是最為主要的兩種方式。傳統(tǒng)的水稻淹水灌溉耗水量大，中國(guó)每公頃稻田耗水量達(dá)13500 m3左右，且灌溉水利用率低，每立方米水稻谷生產(chǎn)量?jī)H0.7 kg，而以色列每立方米水作物生產(chǎn)量是中國(guó)的 3～4倍（段愛旺等，2000）。目前，中國(guó)水稻生產(chǎn)推廣“淺濕干”灌溉技術(shù)，耗水量已減至9000 m3hm-2（李陽生等，2002）。間歇灌溉在水稻分蘗期能有效抑制水稻無效分蘗，減少有毒物質(zhì)產(chǎn)生，有利于提高根系活力和根系對(duì)土壤養(yǎng)分的利用效率（Kirk et al.，1990）以及水稻植株的光合效率（林賢青等，2004），因此，間歇灌溉在中國(guó)當(dāng)前的水稻生產(chǎn)中被廣泛應(yīng)用。稻田不同水分管理方式對(duì)水稻用水量、產(chǎn)量和肥料利用率的影響存在差異。間歇灌溉模式與傳統(tǒng)的淹灌方式相比，可節(jié)水31.7%～49.6%（Belder，2004；Belder et al.，2005；吳端普等，1995）。間歇灌溉相比長(zhǎng)期淹水，能夠適當(dāng)提高水稻產(chǎn)量（楊麗敏，2008；廖國(guó)厚，1998），減少水分使用（黃英華等，1986；李遠(yuǎn)華等，1998）和田間的氮肥損失，有利于土壤 TN、有機(jī)質(zhì)的保持，減緩耕層TP下滲，從而促進(jìn)稻田土壤肥力的可持續(xù)發(fā)展（余雙等，2016）。

已有研究表明，水分管理方式可影響稻田土壤化學(xué)性質(zhì)和微生物性質(zhì)（Yang et al.，2005；Uhlírová et al.，2005；Drenovsky et al.，2004；Chen et al.，2007；Williams et al.，2007）。在單施化肥處理、化肥秸稈處理和化肥豬糞處理中，間歇灌溉水稻田相比長(zhǎng)期淹水田，土壤微生物量碳和礦質(zhì)態(tài)碳積累量均較高（Yang et al.，2005）。土壤水分不僅影響土壤的化學(xué)性質(zhì)，也影響土壤的微生物種群。Pan et al.（2016）采用磷脂脂肪酸（PFLA）法進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)稻田土壤水分對(duì)土壤真菌生長(zhǎng)和微生物群落活性影響顯著。長(zhǎng)期淹水土壤的真菌/細(xì)菌比值較低，而干濕交替土壤真菌比例較高（Drenovsky et al.，2004）。目前，有關(guān)稻田土壤細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)在DNA和RNA水平上對(duì)不同水分管理方式的響應(yīng)尚缺乏系統(tǒng)研究。土壤細(xì)菌是土壤微生物的重要組成部分（陳婭婷等，2016），是土壤生態(tài)功能的重要參與者（李娜等，2013），因此對(duì)間歇灌溉和長(zhǎng)期淹水條件下細(xì)菌群落變化特征進(jìn)行探究，以期為評(píng)價(jià)兩種水分管理措施下土壤的健康狀況和稻田水分科學(xué)管理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

田間試驗(yàn)地處于湖南省長(zhǎng)沙縣金井鎮(zhèn)中國(guó)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所長(zhǎng)沙農(nóng)業(yè)環(huán)境觀測(cè)研究站（113°19′52″E，28°33′04″N）。海拔為80 m，平均溫度為17.5 ℃，降雨量為1330 mm，無霜期約為274 d，屬亞熱帶季風(fēng)氣候區(qū)。試驗(yàn)田土壤為花崗巖風(fēng)化物發(fā)育而來的麻沙泥。0～20 cm耕層土壤基本理化性質(zhì)：全氮1.98 gkg-1，全磷0.38 gkg-1，全鉀 34.38 gkg-1，有機(jī)質(zhì) 31.8 gkg-1，CEC 8.47 cmolkg-1，pH 5.31。土壤機(jī)械組成：＜0.01 mm的物理性粘粒含量為40.20%，＞0.01 mm的物理性砂粒含量為59.80%。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法

田間試驗(yàn)始于 2012年。田間小區(qū)試驗(yàn)設(shè)置 4個(gè)處理：全生育期淹水（簡(jiǎn)稱淹灌，以CFS0表示）、全生育期淹水+稻草還田（CFS）、“淹水-烤田-淹水”干濕交替（即間歇灌溉，以IFS0表示）、“淹水-烤田-淹水”干濕交替+稻草還田（IFS）。早稻季和晚稻季稻草用量均為6.0 thm-2，稻草均切至5～7 cm長(zhǎng)，分別在翻耕前施入，通過翻耕進(jìn)入土壤耕作層。試驗(yàn)處理設(shè)置和各處理施肥量見表1。每處理3次重復(fù)，小區(qū)面積為5 m×7 m，隨機(jī)區(qū)組排列。過磷酸鈣（以P2O5計(jì)）、氯化鉀（以K2O計(jì)）和硫酸鋅（以ZnSO4計(jì)）以基肥一次性施入；尿素（以N計(jì)）基肥、追肥比例為5∶5，追肥在水稻生長(zhǎng)的分蘗中期、抽穗期按 3∶2的比例（追肥部分）追施。試驗(yàn)小區(qū)病蟲害防治和雜草清除及其他田間管理措施均采用常規(guī)管理模式，且各小區(qū)完全一致。

1.3 樣品采集

于2014年9月上旬，晚稻分蘗末期采集土壤樣品。使用3 cm×20 cm土鉆在試驗(yàn)處理小區(qū)采用五點(diǎn)法（S形）采集水稻株間0～20 cm耕層土壤，每次采集的鮮土樣儲(chǔ)存于冰盒后帶回實(shí)驗(yàn)室并及時(shí)分析土壤微生物量碳（MBC）、微生物量氮（MBN）、可溶性有機(jī)碳（DOC）、銨態(tài)氮（NH4+-N）、硝態(tài)氮（NO3--N）。同時(shí)取100 g左右土壤樣品儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱中，用于提取土壤脫氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）。

1.4 土壤理化性質(zhì)測(cè)定

測(cè)定指標(biāo)為土壤MBC、MBN、DOC、NH4+-N、NO3--N。土壤 MBC和 MBN采用氯仿熏蒸-0.5 molL-1K2SO4直接提取法測(cè)定（Wu et al.，1990）。土壤常規(guī)理化指標(biāo)分析參考《土壤農(nóng)業(yè)化學(xué)分析方法》。土壤全氮含量先采用硒粉-硫酸銅-硫酸消化法得到消煮液，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶定容，最后使用流動(dòng)注射儀（FIAStar 5000）分析測(cè)定；土壤全磷采用 NaOH熔融-鉬銻抗比色法測(cè)定；全鉀采用NaOH熔融-原子吸收光譜法測(cè)定；土壤有機(jī)碳采用重鉻酸鉀容量法（外加熱法）測(cè)定；土壤機(jī)械組成采用比重計(jì)法測(cè)定；土壤有機(jī)碳含量采用重鉻酸鉀外加熱法測(cè)定（鮑士旦，2000）。

1.5 土壤DNA和RNA提取及cDNA合成

參照Chen et al.（2010）和楊建等（2006）的方法，采用SDS-GITC-PEG法，并作適當(dāng)改進(jìn)。稱取0.5 g土樣于2 mL離心管中，試劑添加量均為文獻(xiàn)數(shù)據(jù)的 1/20，加入氯仿-異戊醇后離心速度改為15000 g（重力加速度），離心10 min。土壤樣品中細(xì)菌的RNA提取參照Griffiths et al.（2000）方法。利用RQ1 RNase-free DNase（Promega）去除提取液中的DNA。純化的RNA產(chǎn)物通過兩步酶學(xué)反應(yīng)合成DNA，第一步為逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，以RNA為模板通過M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA第一鏈；第二步為PCR反應(yīng)，以cDNA第一鏈為模板通過DNA聚合酶合成雙鏈DNA。在反轉(zhuǎn)錄過程中插入兩個(gè)對(duì)照，其中一個(gè)不加mRNA，另一個(gè)加mRNA但是不加反轉(zhuǎn)錄酶以便檢測(cè)在純化及反轉(zhuǎn)錄過程中是否有DNA污染。反轉(zhuǎn)錄使用隨機(jī)引物，PCR檢測(cè)反轉(zhuǎn)錄是否成功。得到的DNA和cDNA直接用于后續(xù)的分析。

表1 田間小區(qū)試驗(yàn)處理設(shè)置和各處理晚稻的施肥量Table 1 field plot experiment and late rice fertilizer applied kghm-2

1.6 細(xì)菌基因豐度和群落結(jié)構(gòu)和分析

實(shí)時(shí)定量 PCR：儀器為 ABI 7900（applied Biosystem），引物為 16S通用引物 341f/515r。質(zhì)粒DNA經(jīng)過NdeⅠ酶切后（線性化），用T7體外反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermo）反轉(zhuǎn)錄為RNA，再用DnaseⅠ（Promega）降解多余的 DNA，并用RNeasyMinEluteTM Cleanup Kit（Qiagen，Germany）純化RNA。純化后的RNA用RevertAidTM First strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas）反轉(zhuǎn)錄為cDNA，10倍梯度稀釋，作為 cDNA標(biāo)準(zhǔn)樣品于-20 ℃保存?zhèn)溆?。質(zhì)粒 DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線的獲取參照文獻(xiàn)（秦紅靈等，2011）。DNA水平標(biāo)準(zhǔn)曲線為Ct=-3.31lg C+31.31（R2=0.996），RNA水平的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Ct=-3.23lg C+41.31（R2=0.992）。DNA稀釋至5 ngμL-1，mRNA稀釋至10 ngμL-1后反轉(zhuǎn)錄為cDNA樣品作為模板進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。

T-RFLP試驗(yàn)：PCR儀器為 Eppendorf-6321，采用通用引物16S rDNA（8f/1492r）（Saikaly et al.，2005），正向引物 5’端用 6-羧基二乙酸熒光素（FAM）標(biāo)記。PCR反應(yīng)體系、反應(yīng)程序參照文獻(xiàn)（秦紅靈等，2011）。末端FAM標(biāo)記的PCR純化后產(chǎn)物用MspⅠ酶切，酶切產(chǎn)物的T-RFLP分析由上海桑尼生物技術(shù)有限公司完成，分析儀器為 ABI Prism3100Genetic Analyzer。利用 PC-ORD（5.0）軟件計(jì)算 T-RFLP圖計(jì)算香農(nóng)多樣性指數(shù)。利用Canoca for windows（4.5）軟件進(jìn)行主成分分析（principal components analysis，PCA）和冗余分析（redundancy analysis，RDA），以此研究土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)以及土壤環(huán)境因子對(duì)群落結(jié)構(gòu)的影響。

1.7 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），差異顯著性水平通過最小顯著差數(shù)法（LSD）進(jìn)行檢驗(yàn)，偏相關(guān)法分析相關(guān)關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品總DNA和RNA提取及cDNA合成

土壤樣品總基因組片段大小均約為 20 kb，獲得的DNA樣品可進(jìn)行進(jìn)一步的分子生物學(xué)分析，DNA產(chǎn)量和質(zhì)量如表2所示。以16S通用引物（7f，1492r）擴(kuò)增的16S rDNA基因序列為單一條帶，長(zhǎng)度約為1500 bp，擴(kuò)增產(chǎn)物特異性較好。土壤樣品RNA電泳23S和16S rRNA帶型清晰明亮，RNA產(chǎn)量和質(zhì)量如表3所示。經(jīng)去除DNA的RNA樣品經(jīng)過Fermentas逆轉(zhuǎn)錄試劑盒能夠擴(kuò)增到目的基因的片段。

表2 DNA的產(chǎn)量和質(zhì)量Table 2 DNA yield and concentration of the soils

表3 RNA的產(chǎn)量和質(zhì)量Table 3 RNA yield and concentration of the soils

2.2 不同水分管理下稻田細(xì)菌的豐度變化

如表4所示，在DNA水平上，間歇灌溉（IFS0）處理土壤細(xì)菌數(shù)量與長(zhǎng)期淹水（CFS0）處理間有顯著差異，間歇灌溉和長(zhǎng)期淹水稻田干土細(xì)菌數(shù)量分別為3.91×1010copiesg-1和1.79×1010copiesg-1，前者是后者的2.18倍。當(dāng)有稻草還田時(shí)，間歇灌溉和長(zhǎng)期淹水稻田干土細(xì)菌數(shù)分別為6.05×1010copiesg-1和2.74×1010copiesg-1，前者是后者的2.21倍。間歇灌溉稻田細(xì)菌數(shù)量顯著高于長(zhǎng)期淹水稻田。

表4 不同處理16S rDNA和16S rRNA豐度Table 4 The abundance of 16S rDNA and 16S rRNA

細(xì)菌數(shù)量在基因表達(dá)水平上，間歇灌溉與長(zhǎng)期淹水稻土之間差異顯著，前者是后者的2.6倍。當(dāng)有稻草還田時(shí)，間歇灌水稻田與長(zhǎng)期淹水稻土細(xì)菌數(shù)量差異不顯著。

2.3 不同水分管理下稻田細(xì)菌的種類

在DNA水平上，間歇灌溉和長(zhǎng)期淹水稻土細(xì)菌種類存在顯著差異，如圖1所示。114 bp片段只出現(xiàn)在間歇灌溉水田中，而76、188 bp片段只出現(xiàn)在長(zhǎng)期淹水稻田中；同時(shí)，DNA水平上，間歇灌溉和長(zhǎng)期淹水對(duì)細(xì)菌的影響在有無稻草添加處理間存在差異。404 bp片段只出現(xiàn)在有稻草的間歇灌溉稻田中，而190、210 bp片段只出現(xiàn)在有稻草的長(zhǎng)期淹水田中。添加稻草后，間歇灌溉稻田土壤細(xì)菌多樣性指數(shù)與長(zhǎng)期淹水稻田相近。

圖1 不同處理對(duì)16S rRNA基因群落組成（a）和表達(dá)組成（b）的影響Fig. 1 Effects of water management and straw return on the community composition of 16S rRNA gene and gene transcripts

在基因表達(dá)水平上，間歇灌溉和長(zhǎng)期淹水稻土細(xì)菌群落組成也存在顯著差異，如圖2所示。74、118、126、174 bp片段只存在于間歇灌溉水田中。加入稻草后，62、102 bp片段在長(zhǎng)期淹水田中豐度極低，而在間歇灌溉田中為5%左右。148 bp片段在4個(gè)處理中都存在，但是在稻草添加的情況下，在長(zhǎng)期淹水處理中的占比高達(dá)98%。水分顯著改變了細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)。在基因表達(dá)水平上，間歇灌溉稻田土壤細(xì)菌的多樣性顯著高于長(zhǎng)期淹水稻田，在有稻草添加的處理中，間歇灌溉稻田0.28多樣性指數(shù)為2.49，而長(zhǎng)期淹水處理稻田0.28多樣性指數(shù)僅為0.28。

2.4 稻田細(xì)菌的豐度和種類與土壤理化性質(zhì)之間的相關(guān)分析

2.4.1 土壤細(xì)菌豐度與土壤理化性質(zhì)之間的相關(guān)性

如表5所示，稻田土壤細(xì)菌16S rDNA的豐度與 MBC呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為 0.715。細(xì)菌

16S rRNA豐度與NH+4-N、DOC和MBC呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為 0.635、0.591和 0.591。土壤MBC含量與土壤細(xì)菌及活性細(xì)菌豐度都呈顯著正相關(guān)。

2.4.2 土壤群落結(jié)構(gòu)與土壤理化性質(zhì)之間的相關(guān)性

間歇灌溉和長(zhǎng)期淹水稻田土壤細(xì)菌群落組成在RDA分析圖上明顯分離，見圖2a。第一軸（橫軸）對(duì)物種數(shù)據(jù)的解釋量達(dá)到95.2%，其中硝態(tài)氮含量與物種軸的相關(guān)系數(shù)達(dá)到-0.786，說明不同水分處理導(dǎo)致土壤硝態(tài)氮含量的差異，可能是造成種群差異的主要因子。在基因表達(dá)水平上，間歇灌溉和長(zhǎng)期淹水稻田土壤細(xì)菌群落組成在RDA分析圖上明顯分離，見圖2b。第一軸（橫軸）對(duì)物種數(shù)據(jù)的解釋量達(dá)到81.0%，其中硝態(tài)氮含量與物種軸的相關(guān)系數(shù)達(dá)到 0.838，說明不同水分處理導(dǎo)致土壤硝態(tài)氮含量的差異，可能是造成細(xì)菌種群表達(dá)差異的主要因子。

圖2 不同處理16S rRNA基因群落組成（a/c）和表達(dá)組成（b/d）結(jié)構(gòu)的RDA分析Fig. 2 RDA analysis of the composition (a/c) of 16S rRNA gene and gene transcripts (b/d)

表5 16S rDNA和16S rRNA豐度與土壤化學(xué)性質(zhì)間的相關(guān)性Table 5 The relationship between soil chemical properties with the abundance of 16SrDNA and 16SrRNA

加入稻草后土壤細(xì)菌群落組成在 RDA分析圖上明顯分離，見圖2c。第一軸（橫軸）對(duì)物種數(shù)據(jù)的解釋量達(dá)到94.8%，其中MBC含量與物種軸的相關(guān)系數(shù)達(dá)到-0.914。在基因表達(dá)水平上，加入稻草后土壤細(xì)菌群落組成在RDA分析圖上明顯分離，見圖2d。第一軸（橫軸）對(duì)物種數(shù)據(jù)的解釋量達(dá)到99.6%，其中MBC含量與物種軸的相關(guān)系數(shù)達(dá)到-0.935。說明添加稻草后不同水分處理導(dǎo)致土壤 MBC含量的差異，可能是造成種群差異的主要因子。

3 討論

3.1 水分管理對(duì)土壤細(xì)菌數(shù)量和群落結(jié)構(gòu)的影響

水分管理對(duì)農(nóng)田土壤細(xì)菌數(shù)量影響顯著。王月容等（2010）研究表明洞庭湖流域的錢糧湖垸旱地土壤細(xì)菌數(shù)量均高于水田不同利用方式下耕作層土壤細(xì)菌數(shù)量，旱地精細(xì)管理改善了土壤的通氣透水性能，有利于改善其繁育條件，增加微生物數(shù)量，而土壤水分狀況對(duì)土壤微生物數(shù)量有顯著影響。同一利用類型的土地，如種植黃瓜，當(dāng)土壤水分為田間持水量 80%～90%時(shí)，土壤細(xì)菌數(shù)量最多，而當(dāng)土壤水分為田間持水量 70%～80%和 90%～100%時(shí)土壤細(xì)菌數(shù)量較少（杜社妮等，2005），適宜的水分有利于土壤細(xì)菌的繁殖，水分過多和過少都不利于土壤細(xì)菌生長(zhǎng)。亞熱帶區(qū)間歇灌溉水稻田相對(duì)于長(zhǎng)期淹水稻田來說，土壤通氣透水性能明顯優(yōu)越，水分差異導(dǎo)致土壤理化性狀改變，這可能是本研究中間歇灌溉水稻田土壤細(xì)菌數(shù)量在DNA水平和基因表達(dá)水平都顯著高于長(zhǎng)期淹水稻田的主要原因。

農(nóng)田土壤細(xì)菌群落受土壤水分管理制度的影響（Drenovsky et al.，2010；Drenovsky et al.，2004；Zhang et al.，2013）。劉岳燕（2009）研究表明干濕交替和交互作用使水稻移栽后50 d內(nèi)的細(xì)菌、放線菌、好氧細(xì)菌、革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌的生物量顯著增加。干濕交替及其交互作用導(dǎo)致嗜甲烷菌在整個(gè)生育期內(nèi)的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于長(zhǎng)期淹水田。Ma et al.（2000）研究表明同一地域不同利用類型（草地、人工草場(chǎng)、放牧草場(chǎng)、農(nóng)地、退耕地、林地和稻田）土壤細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)與土壤水分關(guān)系密切，水分對(duì)細(xì)菌群落組成變異的解釋度達(dá)到31%。含水量低的土壤中革蘭氏陰性菌和真菌較多，而濕潤(rùn)土壤中的革蘭氏陽性菌較豐富。不同類型草原土壤細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)變異因素中，水分與土壤細(xì)菌的多樣性呈顯著的正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.506（Zhang et al.，2013）。本研究中，盡管間歇灌水和長(zhǎng)期淹水稻田土壤細(xì)菌群落多樣性指數(shù)在DNA水平上差異不顯著，但是在RDA分析圖上兩種水分管理方式處理明顯分離，土壤優(yōu)勢(shì)菌群也發(fā)生了顯著變化。而在RNA水平上，不同處理土壤細(xì)菌多樣性指數(shù)差異十分顯著，尤其在稻草添加的條件下，長(zhǎng)期淹水稻田土壤細(xì)菌多樣性顯著降低，導(dǎo)致這種現(xiàn)象的原因有待進(jìn)一步研究。

農(nóng)田土壤細(xì)菌豐度和群落受到水分管理制度的影響。一方面，在不同水分條件下，水分脅迫導(dǎo)致土壤細(xì)菌豐度和優(yōu)勢(shì)菌群發(fā)生變化。另一方面，水分管理制度的差異導(dǎo)致稻田土壤氧化還原電位（劉艷麗等，2008）、pH（劉艷麗等，2008）、土壤無機(jī)氮含量、土壤微生物量碳含量、土壤微生物量氮含量、可溶性有機(jī)氮含量、可溶性有機(jī)碳含量（湯宏等，2013）等的變化，這些因素都可能導(dǎo)致土壤細(xì)菌的豐度和群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生差異（Karasu et al.，2009；Rinklebe et al.，2006）。本研究發(fā)現(xiàn)不同水分管理制度稻田土壤細(xì)菌豐度與土壤MBC呈顯著正相關(guān)，土壤細(xì)菌群落與土壤硝態(tài)氮含量呈顯著相關(guān)。這充分說明，不同水分管理制度下，土壤的理化性狀改變可能是影響土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化的重要驅(qū)動(dòng)因子。

3.2 土壤細(xì)菌數(shù)量和群落結(jié)構(gòu)在DNA和RNA水平上對(duì)稻田水分管理的響應(yīng)

利用細(xì)菌DNA研究細(xì)菌與土壤之間的生態(tài)關(guān)系報(bào)道較多（Cheneby et al.，2000；Mummey et al.，2003；Yang et al.，2016），由于基因的表達(dá)水平更能反應(yīng)功能微生物在土壤中的活性，越來越多的學(xué)者利用 RNA研究細(xì)菌在土壤生態(tài)系統(tǒng)中的特征（Poretsky et al.，2005；Bulow et al.，2008；Freitag et al.，2009；Henderson et al.，2010；Ahn et al.，2014）。水田土壤在干濕交替過程中，反硝化化基因 narG和 nosZ數(shù)量增加，群落結(jié)構(gòu)也發(fā)生了顯著變化。narG基因數(shù)量與土壤的氧化還原電位和水分含量關(guān)系密切，nosZ基因數(shù)量與干濕交替過程中水分含量相關(guān)（Liu et al.，2012）。在高氮肥投入下，相比長(zhǎng)期淹水，間歇灌溉顯著增加了全生育期硝化細(xì)菌的數(shù)量和乳熟期反硝化細(xì)菌的數(shù)量（Liang et al.，2016）。以上結(jié)果充分說明水田土壤在不同水分狀態(tài)下細(xì)菌的數(shù)量會(huì)發(fā)生顯著的變化，與本研究結(jié)果相似。不同的水分管理方式對(duì)基因表達(dá)活性也有影響（Noll et al.，2005；Watanabe et al.，2007）。相比常規(guī)灌溉，節(jié)水灌溉增加了厭氧粘細(xì)菌和甲基孢囊菌相關(guān)的功能基因轉(zhuǎn)錄的數(shù)量，其中與甲烷的產(chǎn)生相關(guān)的微生物基因mcrA的豐度在不同的水分制度下出現(xiàn)差異（Ahn et al.，2014）。本研究發(fā)現(xiàn)，間歇灌溉稻田土壤細(xì)菌的多樣性在轉(zhuǎn)錄水平上顯著高于長(zhǎng)期淹水稻田，在有稻草添加的條件下，間歇灌溉稻田細(xì)菌多樣性指數(shù)為2.49，而長(zhǎng)期淹水處理稻田細(xì)菌多樣性指數(shù)僅為0.28。綜合比較DNA水平和轉(zhuǎn)錄水平上細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化特征可知，若要真實(shí)反映土壤中行使功能細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)，則有必要研究土壤中的細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)。

4 結(jié)論

（1）稻田間歇灌溉和長(zhǎng)期淹水土壤細(xì)菌數(shù)量存在顯著差異，間歇灌溉稻田細(xì)菌數(shù)量顯著高于長(zhǎng)期淹水稻田。在DNA水平上，間歇灌溉細(xì)菌數(shù)量是長(zhǎng)期淹水土壤細(xì)菌數(shù)量的 2.18倍。當(dāng)有稻草還田時(shí)，間歇灌細(xì)菌數(shù)量是長(zhǎng)期淹水稻田的2.21倍。在基因表達(dá)水平上，間歇灌溉與長(zhǎng)期淹水稻田之間細(xì)菌數(shù)量差異顯著，前者是后者的2.6倍。當(dāng)有稻草還田時(shí)，間歇灌溉細(xì)菌數(shù)量與長(zhǎng)期淹水間差異不顯著。稻田間歇灌溉和長(zhǎng)期淹水土壤細(xì)菌豐度及細(xì)菌表達(dá)豐度與MBC呈顯著正相關(guān)。

（2）稻田間歇灌溉和長(zhǎng)期淹水土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在顯著差異。在DNA和基因表達(dá)水平上，間歇灌溉和長(zhǎng)期淹水細(xì)菌優(yōu)勢(shì)種群存在差異；間歇灌溉稻田土壤細(xì)菌的多樣性顯著高于長(zhǎng)期淹水稻田；稻田間歇灌溉和長(zhǎng)期淹水土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性與硝態(tài)氮含量呈顯著相關(guān)。在有稻草還田時(shí)，土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性與MBC含量顯著相關(guān)。

（3）從土壤細(xì)菌豐度和群落結(jié)構(gòu)評(píng)估水稻水分管理方式，稻田間歇灌溉優(yōu)于長(zhǎng)期淹水。

AHN J H, CHOI M Y, KIM B Y, et al. 2014. Effects of water-saving irrigation on emissions of greenhouse gases and prokaryotic communities in rice paddy soil [J]. Microbial Ecology, 68(2): 271-283.

BELDER P, SPIERTZ J, BOUMAN B, et al. 2005. Nitrogen economy andwater productivity of lowland rice under watersaving irrigation [J]. Field Crop Research, 93(2-3): 169-185.

BELDER P. 2004. Effect of water-saving irrigation on rice yield and water use in typical lowland conditions in Asia [J]. Agric Water Manag, 65(3): 193-210.

BULOW S E, FRANCIS C A, JACKSON G A, et al. 2008. Sediment denitrifier community composition and nirS gene expression investigated withfunctional gene microarrays [J]. Environmental Microbiology, 10(11): 3057-3069.

CHEN M M, ZHU YG, SU Y H, et al. 2007. Effects of soil moisture and plant interactions on the soil microbial community structure [J]. European Journal of Soil Biology, 43(1): 31-38

CHEN Z, LUO X Q, HU R G, et al. 2010. Impact of long-term fertilization on the composition of denitrifier communities based on nitrite reductase analyses in a paddy soil [J]. Microbial Ecology, 60(4): 850-861.

CHENEBY D, PHILIPPOT L, HARTMANN, et al. 2000. 16S rDNA analysis for characterization of denitrifying bacteria isolated from three agricultural soils [J]. Fems Microbiology Ecology, 34(2): 121-128.

DRENOVSKY R E, VO D, GRAHAM K J, et al. 2004. Soil water content and organic carbon availability are major determinants of soil microbial community composition [J]. Microbial Ecology, 48(3): 424-430.

DRENOVSKY R E, STEENWERTH K L, JACKSON L E, et al. 2010. Land use and climatic factors structure regional patterns in soil microbial communities [J]. Global Ecology and Biogeography, 19(1): 27-39.

FREITAG T E, PROSSER J I. 2009. Correlation of methane production and functional gene transcriptional activity in a peat soil [J]. Applied and Environmental Microbiology, 75(21): 6679-6687.

GRIFFITHS R I, WHITELEY A S, O'DONNELL A G, et al. 2000. Rapid method for coextraction of DNA and RNA from natural environments for analysis of ribosomal DNA- and rRNA-based microbial community composition [J]. Applied and Environmental Microbiology, 66(12): 5488-5491.

HENDERSON S L, DANDIE C E, PATTEN C L, et al. 2010. Changes in denitrifier abundance, denitrification gene mRNA levels, nitrous oxide emissions, and denitrification in anoxic soil microcosms amended with glucose and plant residues [J]. Applied and Environmental Microbiology, 76(7): 2155-2164.

KARASU A, DOGAN M Z. 2009. The effect of bacterial inoculation and different nitrogen doses on yield and yield components of some chickpea genotypes (Cicer arietinum L.) [J]. African Journal of Biotechnology, 8(1): 59-64.

KIRK G J D, AHMAD A R, NYE P H. 1990. Coupled diffusion and oxidation of ferrous iron in soils. II. A model of the diffusion and reaction of O2, fe2+, H+and Hco3-in soils and a sensitivity analysis of the model [J]. Journal of Soil Science, 41(3): 411-431.

LAL R. 1999. Soil management and soil biotic processes [M] //REDDY M V. Management of Tropical Agroecosystems and the Beneficial Soil Biota. Enfield: Science Publishers: 67-81.

LIANG Y F, LI F S, NONG M L, et al. 2016. Microbial activity in paddy soil and water-use efficiency of rice as affected by irrigation method and nitrogen level [J]. Communications in Soil Science and Plant Analysis, 47(1): 19-31.

LIU J B, HOU H J, SHENG R, et al. 2012. Denitrifying communities differentially respond to flooding drying cycles in paddy soils[J]. Applied Soil Ecology, 62: 155-162.

MA K, CONRAD R, LU Y. 2012. Responses of methanogen mcrA genes and their transcripts to an alternate dry/wet cycle of paddy field soil [J]. Applied and Environmental Microbiology, 78(2): 445-454.

MA L, GUO C, LU X, et al. 2000. Soil moisture and land use are major determinants of soil microbial community composition and biomass at a regional scale in northeastern China [J]. Biogeosciences, 12(8): 2585-2596.

MUMMEY D L, STAHL P D. 2003. Spatial and temporal variability of bacterial 16S rDNA-based T-RFLP patterns derived from soil of two Wyoming grassland ecosystems [J]. Fems Microbiology Ecology, 46(1): 113-120.

NOLL M, D MATTHIES, P FRENZEL, et al. 2005. Succession of bacterial community structure and diversity in a paddy soil oxygen gradient [J]. Environmental Microbiology, 7(3): 382-395.

PAN F X, LI Y Y, CHAPMAN S J, et al. 2016. Effect of rice straw application on microbial community and activity in paddy soil under different water status [J]. Environmental Science and Pollution Research, 23(6): 5941-5948.

PORETSKY R S, BANO N, BUCHAN A, et al. 2005. Analysis of microbial gene transcripts in environmental samples [J]. Applied and Environmental Microbiology, 71(7): 4121-4126.

RINKLEBE J, LANGER U. 2006. Microbial diversity in three floodplain soils at the Elbe River (Germany) [J]. Soil Biology & Biochemistry, 38(8): 2144-2151.

SAIKALY P E, STROOT P G, OERTHE D B. 2005. Use of 16S rRNA gene terminal restriction fragment analysis to assess the impact of solids retention time on the bacterial diversity of activated sludge [J]. Applied and Environmental Microbiology, 71(10): 5814-5822.

UHLíROVá E, ELHOTTOVá D, TRíSKA J, et al. 2005. Physiology and microbial community structure in soil at extreme water content [J]. Folia Microbiologica, 50(2): 161-166.

WALL, LYNCH J. 2000. Soil Biodiversity and Ecosystem Functioning [M]. Berlin Heidelberg: Springer.

WATANABE T, KIMURA M, ASAKAWA S. 2007. Dynamics of methanogenic archaeal communities based on rRNA analysis and their relation to methanogenic activity in Japanese paddy field soils [J]. Soil Biology & Biochemistry, 39: 2877-2887.

WILLIAMS M A, RICE C W. 2007. Seven years of enhanced water availability influences the physiological, structural, and functional attributes of a soil microbial community [J]. Applied Soil Ecology, 35(3): 535-545.

WU J, JOERGENSEN R G, POMMERENING B, et al. 1990. Measurement of soil microbial biomass C by fumigation extraction-an automated procedure [J]. Soil Biology & Biochemistry, 22(8): 1167-1169.

WU J. 2011. Carbon accumulation in paddy ecosystems in subtropical China: evidence from landscape studies [J]. European Journal of Soil Science, 62(1): 29-34.

YANG C M, YANG L Z, YAN T M. 2005. Chemical and microbiological parameters of paddy soil quality as affected by different nutrient and water regimes [J]. Pedosphere, 15(3): 369-378.

YANG H C, SHENG R, ZHANG Z X, et al. 2016. Responses of nitrifying and denitrifying bacteria to flooding-drying cycles in flooded rice soil [J]. Applied Soil Ecology, 103: 101-109.

ZHANG X F, ZHAO L, XU S J, et al. 2013. Soil moisture effect on bacterial and fungal community in Beilu river (Tibetan Plateau) permafrost soils with different vegetation types [J]. Journal of Applied Microbiology, 114(4): 1054-1065.

鮑士旦. 2000. 土壤農(nóng)化分析[M]. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社.

陳婭婷, 李芳柏, 李曉敏. 2016. 水稻土嗜中性微好氧亞鐵氧化菌多樣性及微生物成礦研究[J]. 生態(tài)環(huán)境學(xué)報(bào), 25(4): 547-554.

杜社妮, 梁銀麗, 徐福利, 等. 2005. 溫室黃瓜產(chǎn)量和土壤微生物隨土壤水分的變化特征研究[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào), 21(5): 300-303.

段愛旺, 張寄陽. 2000. 中國(guó)灌溉農(nóng)田糧食作物水分利用效率的研究[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào), 16(4): 41-44.

黃英華, 王昌翼, 陳興官. 1986. 間歇灌溉和濕潤(rùn)灌溉是水稻增產(chǎn)省水的好方式[J]. 中國(guó)農(nóng)村水利水電, (3): 26-27.

李娜, 韓曉增, 尤孟陽, 等. 2013. 土壤團(tuán)聚體與微生物相互作用研究[J].生態(tài)環(huán)境學(xué)報(bào), 22(9): 1625-1632.

李陽生, 李紹清, 李達(dá)模, 等. 2002. 雜交稻與常規(guī)稻對(duì)澇漬環(huán)境適應(yīng)能力的比較研究[J]. 中國(guó)水稻科學(xué), 16(1): 46-52.

李遠(yuǎn)華, 張祖蓮. 1998. 水稻間歇灌溉的節(jié)水增產(chǎn)機(jī)理研究[J]. 中國(guó)農(nóng)村水利水電, (11): 12-15.

廖國(guó)厚. 1998. 間歇灌溉對(duì)稻田蚊幼孳生作用初探[J]. 廣西植保, (3): 16-19.

林賢青, 周偉軍, 朱德峰, 等. 2004. 稻田水分管理方式對(duì)水稻光合速率和水分利用效率的影響[J]. 中國(guó)水稻科學(xué), 18(4): 55-60.

劉艷麗, 張斌, 胡鋒, 等. 2008. 干濕交替對(duì)水稻土碳氮礦化的影響[J].土壤, 40(4): 554-560.

劉岳燕. 2009. 水分條件與水稻土壤微生物生物量、活性及多樣性的關(guān)系研究[D]. 杭州: 浙江大學(xué).

秦紅靈, 袁紅朝, 張慧, 等. 2011. 紅壤坡地利用方式對(duì)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響[J]. 土壤學(xué)報(bào), 48(3): 594-602.

湯宏, 沈健林, 張楊珠, 等. 2013. 秸稈還田與水分管理對(duì)稻田土壤微生物量碳、氮及溶解性有機(jī)碳、氮的影響[J]. 水土保持學(xué)報(bào), 27(1): 240-246.

王月容, 周金星, 周志翔, 等. 2010. 洞庭湖退田還湖區(qū)不同土地利用方式下土壤微生物數(shù)量與酶活性特征[J]. 生態(tài)學(xué)雜志, 29(5): 910-916.

吳端普, 吳天恩, 吳亞雄. 1995. 水稻需水規(guī)律與灌溉技術(shù)試驗(yàn)研究[J].農(nóng)田水利與小水電, (11): 11-15.

楊建, 洪葵. 2006. 紅樹林土壤總DNA不同提取方法比較研究[J]. 生物技術(shù)通報(bào), 增刊: 366-371.

楊麗敏. 2008. 間歇灌溉對(duì)水稻生長(zhǎng)發(fā)育及產(chǎn)量性狀的影響[J]. 北方水稻, 38(3): 68-69.

余雙, 崔遠(yuǎn)來, 王力, 等. 2016. 水稻間歇灌溉對(duì)土壤肥力的影響[J]. 武漢大學(xué)學(xué)報(bào)(工學(xué)版), (1): 46-53.

Effect of Water Management on Soil Bacterial Abundance and Community in the Rice Paddy Field

HOU Haijun1,2, ZHANG Wenzhao1,2, SHENG Jianlin1, WANG Cong1, QIN Hongling1,2*

1. Key Laboratory of Agro-Ecological Processes in Subtropical Region, Institute of Subtropical Agriculture, Chinese Academy of Sciences, Changsha 410125, China; 2. Taoyuan Agro-ecosystem Research Station, Taoyuan 415700, China

A field plot experiment was conducted on studying the influence of water management on soil bacterial abundance and community in a rice paddy field during the late rice season in Changsha, Hunan Province. The study included four treatments, that were intermittent flooding without straw (IFS0), intermittent flooding with straw (IFS), continuous flooding without straw (CFS0) and continuous flooding with straw (CFS). The results showed that: the density of bacteria in IF soil was higher than that in CF soil at DNA level. The abundance of bacteria was 3.9×1010copiesg-1dry soil in IFS0, which was 2.18 times of that in CFS0. The abundance of bacteria was 6.1×1010copiesg-1dry soil in IFS, which was 2.21 times of that in CFS. At RNA level, the bacteria was more abundant in IF soil than in CF soil. The abundance of bacteria in IFS0 was 2.1×108copiesg-1dry soil, which was 2.58 times of that in CFS0. The abundance of bacteria in IFS0 was 2.8×108copiesg-1dry soil, which was 1.13 times of that in CFS0. The bacterial structure differed between intermittent flooding (IFS0 and IFS) and continuous flooding (CFS0 and CFS) at both DNA and RNA levels. The diversity index in intermittent flooding (IFS0 and IFS) was similar to that in continuous flooding (CFS0 and CFS) at DNA level, however, the predominant species were different. At RNA level, the diversity index in intermittent flooding (IFS0) was higher than that in continuous flooding (CFS0), it was even more obvious when straw was added. The diversity index in IFS was 2.49, which was higher than that in CFS, which was 0.28. In general, water management dramatically affected bacterial abundance and community structure in paddy soils and intermittent flooding was a better strategy than continuous flooding for rice cultivation.

intermittent flooding; continuous flooding; rice straw returning; bacterial abundance bacterial community

10.16258/j.cnki.1674-5906.2016.09.002

S154.3; X17

A

1674-5906（2016）09-1431-08

侯海軍, 張文釗, 沈建林, 王聰, 秦紅靈. 2016. 水分管理對(duì)稻田細(xì)菌豐度與群落結(jié)構(gòu)的影響[J]. 生態(tài)環(huán)境學(xué)報(bào), 25(9): 1431-1438.

HOU Haijun, ZHANG Wenzhao, SHENG Jianlin, WANG Cong, QIN Hongling. 2016. Effect of water management on soil bacterial abundance and community in the rice paddy field [J]. Ecology and Environmental Sciences, 25(9): 1431-1438.

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（41271280）；湖南省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（2016JJ3133）

侯海軍（1980年生），男，工程師，博士，研究方向?yàn)橥寥郎鷳B(tài)學(xué)。E-mail: houhaijun1980@126.com *通信作者。E-mail: huniu@isa.ac.cn

2016-08-03