劉俊良，劉欣雨，梁天宇

（西北民族大學化工學院，甘肅蘭州730030）

微生物固定化法降解含油廢水研究

劉俊良，劉欣雨，梁天宇

（西北民族大學化工學院，甘肅蘭州730030）

在相同的環(huán)境條件下，研究以聚乙烯醇（PVA）與海藻酸鈉（SA）以及聚丙烯酰胺（PAM）與海藻酸鈉為材料制成的固定化微生物小球對水中石油的降解效果.結果表明；在七天的培養(yǎng)實驗中，以PVA為主要材料制成的固定化微生物小球對石油的降解率為80.09%；以PAM為主要材料對石油的降解率為74.40%.以聚乙烯醇與海藻酸鈉制成的微生物小球對石油的降解效果要優(yōu)于聚丙烯酰胺與海藻酸鈉.

微生物固定化；微生物數量；降油率

石油是一種重要的能源物質，隨著國內經濟的快速發(fā)展，石油的需求量越來越大.但是在其運輸、儲存和使用的過程中，往往因為發(fā)生意外事故造成泄漏而污染環(huán)境.水與人類的生活息息相關，被石油污染后水體功能退化、質量下降，將會對人類健康及自然環(huán)境造成持久性的破壞［1－2］.微生物修復技術是一種新興實用的污染物治理技術［3］，具有成本低、簡便高效、環(huán)境影響小等優(yōu)點，適用于石油污染的治理，因而具有廣闊的發(fā)展前景.

近年來，微生物固定化技術由于其使用原料易得、價格低廉、操作簡單、對微生物毒副作用小而得到人們的關注.廖澤君［4］使用海藻酸鈉-聚丙烯酰胺為固定化材料固定嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌進行微生物活性的研究；劉曉偉［5］使用活性炭為固定化材料固定氧化亞鐵硫桿菌脫除SO2.從固定化技術現狀來看，聚乙烯醇和海藻酸鈉是微生物固定化技術中使用最為廣泛的材料，多用于微生物活性的增效研究或用于脫硫等的實驗室研究，在使用對象和現場應用方面均需要進一步擴展［6－9］.

本文用聚乙烯醇與海藻酸鈉以及聚丙烯酰胺與海藻酸鈉為包埋材料固定石油降解菌，制作兩種固定化微生物小球對含油廢水進行降解研究，并對比兩種小球成型效果和微生物活性，探討兩種材料固定化在含油廢水中的應用，對今后固定化微生物降解含油廢水的研究應用提供重要的參考依據.

1 實驗材料

1.1 油樣來源

所用原油來自蘭州石化廠油料，將原油溶于正己烷，在水浴鍋中于68℃下加熱，正己烷蒸發(fā)完全后得到標準油樣品，于干燥環(huán)境中保存?zhèn)溆?

1.2 菌種來源

所用4株菌株均由西北民族大學實驗中心微生物實驗室前期實驗分離純化而得［9－10］，分別為：A6銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、AL魯菲不動桿菌（Acinetobacter lwoffii）、BS芽孢桿菌（Bacillus）、BSS枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），對石油都具有一定的降解作用［10－11］.

1.3 試劑與培養(yǎng)基

正己烷：色譜純（國藥集團化學試劑有限公司）；硼酸、無水氯化鈣：分析純（煙臺市雙雙化工有限公司）；海藻酸鈉：化學純（天津市光復精細化工研究所）；聚乙烯醇（1750±50）、聚丙烯酰胺（1750±50）：分析純（山東西亞化學工業(yè)有限公司）；營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（杭州微生物試劑有限公司）.

1.4 儀器與設備

S·SW-CJ-ZF超凈工作臺（上海躍進醫(yī)療器械廠）、DHP-9160B智能型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上?，槴\實驗設備有限公司）；ZWY-200D全溫震蕩培養(yǎng)箱（上海智誠分析儀器制造有限公司）；立式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠）；HH-6恒溫水浴鍋（金壇市恒豐儀器制造有限公司）；TU-1901紫外分光光度計（北京普析通用儀器責任有限公司）；ZJL-200菌落計數分析儀（北京先驅威鋒技術開發(fā)公司）.

2 實驗方法

2.1 混合菌劑的制備

把A6、AL、BS、BSS這四株菌分別使用營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基在37℃下恒溫振蕩培養(yǎng)24h［13］，將菌液按1︰1︰1︰1的體積混合制成混合菌液，置于5℃的環(huán)境中保存?zhèn)溆?

2.2 固定化微生物小球的制備

稱取1.0g聚乙烯醇與0.5g海藻酸鈉于100mL燒杯中，加入50mL蒸餾水浸泡12h，經過高壓蒸汽滅菌后制成凝膠劑［14］.待凝膠劑冷卻至35℃左右時，加入10mL預先制備好的混合菌液，攪拌均勻后，逐滴滴入飽和氯化鈣硼酸溶液中成球，浸泡10h后取出固定化微生物小球，用無菌水沖洗藥劑后收集備用.稱取0.5g聚丙烯酰胺與海藻酸鈉1g，采用相同方法制成含有混合菌液的凝膠劑后滴入氯化鈣溶液成球.

2.3 標準油標準曲線的繪制

準確稱取0mg、2mg、4mg、6mg、8mg、10mg的標準油，分別使用正己烷溶解后移入6個標記好的100mL容量瓶中，添加正己烷定容至刻度線后得到系列的油含量分別為0mg·L－1、20mg·L－1、40mg·L－1、60mg·L－1、80mg·L－1、100mg·L－1.使用紫外分光光度法，在225nm波長處以正己烷作為參比［15］，測定出系列油的吸光度，即可繪制出標準油的標準曲線.

2.4 降油率的測定

首先取四個100mL錐形瓶，分別加入10g由聚乙烯醇與海藻酸鈉制成的固定化微生物小球、20 mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、20mL無菌水和0.1g標準油，置于37℃的恒溫搖床中培養(yǎng).然后將聚丙烯酰胺和海藻酸鈉制得的固定化微生物小球作同樣的處理.培養(yǎng)第一天分別取樣測定兩種材料的初始油濃度.在培養(yǎng)的第三天、第五天、第七天取樣測定兩種材料的剩余油濃度.

將錐形瓶中的小球過濾后剩余的液體倒入分液漏斗，再加入正己烷，靜置12h萃取.萃取結束后液體分層，培養(yǎng)基及細菌代謝物等物質于下層，溶有石油的正己烷于上層.取上層液體于100mL容量瓶，加入正己烷定容后，使用紫外可見分光光度計測定其吸光度.根據所測得的吸光度和標準曲線，計算出培養(yǎng)至第三天、第五天、第七天時的剩余油濃度，再根據公式計算出降油率.

降油率及油濃度計算公式如下：

公式（1）中c為油濃度，c0為初始油濃度，單位為mg·L－1，計算公式如下：

公式（2）中y為吸光度值；單位為Abs.

2.5 微生物數量的測定

用移液管吸取萃取后的下層液體1mL，移入已經滅菌的試管中，再加入9mL無菌水震蕩混勻.取10－4～10－7的稀釋倍數進行梯度稀釋，使用稀釋液涂已標記好稀釋倍數的平板［13］，置于37℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，次日取出測定微生物數量.

3 結果與分析

3.1 油的標準曲線

用紫外分光光度計在225nm波長處測定系列標準油后得到的吸光度值繪制的標準油標準曲線見圖1.得到相關關系式為y＝0.0184x＋0.0371，其中y表示不同油濃度所測得吸光度Abs，x表示所測得不同吸光度所對應的油濃度mg·L－1；相關系數R2＝0.9904，線性關系良好.

圖1 油標準曲線

3.2 兩種材料制成的小球

圖2 由PVA與SA制成的固定化微生物小球

圖3 由PAM與SA制成的固定化微生物小球

兩種不同材料所制成的固定化微生物小球見圖2、圖3.圖2中所示為以PVA與SA為材料制成的固定化微生物小球，圖3所示為以PAM與SA為材料制成的固定化微生物小球.從兩個圖中可以看出，以PVA為主要材料的固定化微生物小球相比于PAM，球的形狀飽滿圓潤且稍有透明，成型后大小幾乎一致.以PAM為主要材料制成的固定化微生物小球則存在成型狀態(tài)不好、大小不一、易粘連的問題.3.3 兩種材料的降油率及微生物數量關系

通過在錐形瓶中模擬降解環(huán)境，得到七天內兩種不同材料的降油率對比見表1.同時測定的微生物數量隨著培養(yǎng)天數的變化曲線見圖2所示.

從表1中可以看出，兩種材料的降油率隨著培養(yǎng)天數的增加也隨之增長，增長趨勢相接近.在前三天兩種材料的降油率都能增長至60%以上，隨后增長趨勢放緩.至第七天為止，以PVA與SA為包埋材料制成固定化微生物小球的降油率為80.09%.另一組包埋材料為PAM與SA，降油率為74.40%.兩種材料相對比，以PVA為主的固定化材料制成的固定化微生物小球在模擬環(huán)境中的降油率要高于以PAM為主的固定化材料［9］.

表1 兩種不同材料的降油率

通過圖4可知，在加入兩種不同材料制作的固定微生物小球的模擬環(huán)境中，微生物的數量變化趨勢表現為PVA＋SA，顯著較PAM＋SA高21%，表現出更強的生物活性.微生物生長趨勢前三天中，微生物的數量快速增長，其原因為新加入的細菌在沒有競爭和其他干擾的情況下，大量通過石油作為碳源和能源大量繁殖［12］.后四天，由于前期微生物大量繁殖產生了大量代謝物質，加之石油被降解成其他次級產物后微生物的碳源與能源不足，影響了微生物的繁殖，微生物數量開始緩慢地下降，反映了三天后降油率的緩慢提高趨勢.

圖4 微生物數量

4 結論

以PVA與PAM為主要材料制成的兩種固定化微生物小球為研究對象，初步探討了在七天的模擬環(huán)境中對石油的降解效果.結果表明，以PVA為主要材料制成的固定化微生物小球在成型以及大小形狀上要優(yōu)于PAM；其第七天的降油率為80.09%，也要高于PAM的74.40%.從微生物的數量方面進行分析，雖然它們增長減少的趨勢相接近，但是PVA小球的微生物數量一直高于PAM，表現出更強的生物活性，這也解釋了其在七天的實驗中降油效果優(yōu)于PAM［13］.可見，PVA與PAM雖然都能作為包埋材料對微生物進行固定用于降解水中的石油，但PVA的降油效果優(yōu)于PAM，對進一步研究固定化微生物降解水中石油提供了參考依據.

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X703.1

A

1009-2102（2016）03-0016-05

2016-08-02

西北民族大學國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃資助項目（項目編號：201610742058）.

劉俊良（1994—），男，廣西南寧人.