陳芳+朱斌++周萍

[摘要]目的 探討母血中胎兒游離DNA進(jìn)行地中海貧血的無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前診斷價(jià)值。方法 選取我院2014年6月～2016年1月的10例地中海貧血妊娠婦女為研究對(duì)象，與傳統(tǒng)的羊水穿刺診斷進(jìn)行比較，采用孕婦外周血血中胎兒游離DNA高通量測(cè)序診斷，分析高通量測(cè)序方法的檢出率、誤診率、漏診率。結(jié)果 胎兒游離DNA高通量測(cè)序的檢出率、誤診率及漏診率分別為90.0%（9/10）、0.0%（0/10）和10.0%（1/10），與金標(biāo)準(zhǔn)比較基本一致，可以用于地中海貧血的診斷。結(jié)論 胎兒游離DNA高通量測(cè)序可以用于地中海貧血的無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前診斷，對(duì)臨床有一定的指導(dǎo)及應(yīng)用意義。

[關(guān)鍵詞]游離DNA；地中海貧血；高通量測(cè)序

[中圖分類(lèi)號(hào)] R556.6+1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2016）10（a）-0111-03

[Abstract]Objective To study the value of non invasive prenatal diagnosis of fetal free DNA in maternal blood.Methods From 2014 January to 2016 January，10 cases of pregnant women with thalassemia patients were selected as the research object.Compared with the traditional diagnosis of amniotic fluid puncture，the detection rate of fetal free DNA in peripheral blood of pregnant women was analyzed，and the detection rate，misdiagnosis rate and missed diagnosis rate of high throughput sequencing method were analyzed.Results Two methods of detection rate，misdiagnosis rate，missed diagnosis rate，fetal free DNA high-throughput sequencing detection rate，the rate of misdiagnosis and missed diagnosis rate were 90.0% （9/10），0.0% （0/10） and 10.0% （1/10），compared with the gold standard was basically consistent，which was used for the diagnosis of Mediterranean anemia.Conclusion High accuracy rate of non invasive prenatal diagnosis of Mediterranean anemia using fetal free DNA sequencing，it can be used for the detection of Mediterranean anemia.

[Key words]Free DNA；Mediterranean anemia；High throughput sequencing

地中海貧血屬于單基因遺傳性的一種慢性溶血病[1]，主要是珠蛋白基因缺失與突變抑制珠蛋白血紅蛋白肽鏈的合成，打破肽鏈平衡[2-3]。在流行病調(diào)查過(guò)程中發(fā)現(xiàn)：α地中海貧血基因的攜帶率為6.0%～7.3%，β地中海貧血基因的攜帶率為1.83%～3.36%，嚴(yán)重影響了新生兒的身體健康，造成患兒嚴(yán)重貧血或夭折[4-5]。筆者收集我院收治的10例妊娠婦女的臨床資料，并抽取孕婦的外周血以進(jìn)行診斷與篩查，分析孕婦外周血胎兒游離DNA應(yīng)用于α地中海貧血產(chǎn)前診斷的效果，并與金標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較，從而確定胎兒游離DNA高通量測(cè)序的準(zhǔn)確性?，F(xiàn)將研究過(guò)程與研究結(jié)果匯報(bào)如下。

1資料與方法

1.1一般資料

納入標(biāo)準(zhǔn)：2014年6月～2016年1月于我院產(chǎn)前診斷遺傳咨詢(xún)門(mén)診就診的妊娠婦女，夫妻雙方地中海貧血基因檢測(cè)結(jié)果顯示為α輕型地中海貧血，均需實(shí)施介入性產(chǎn)前診斷明確胎兒地中海貧血基因。排除合并其他疾病的患者，排除患有嚴(yán)重其他器官疾病者?；颊咧椴⒃敢鈪⒓颖敬窝芯俊Ｆ渲心挲g20～40歲，平均（29.7±2.5）歲，孕齡13～22周，平均（16.2±1.2）周。

1.2方法

知情告知后，采取孕婦靜脈血5 ml，并進(jìn)行EDTA抗凝，通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行基因DNA的提取，并在50 μl TE溶液的輔助下進(jìn)行DNA提取，利用PCR-RDB法判斷α地中海貧血基因與突變位點(diǎn)。

1.2.1胎兒游離DNA的提取 靜脈血收集后，進(jìn)行離心，并將分離后血漿存在離心管中，以13 000 r/min再次進(jìn)行離心，去除上清，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，通過(guò)采樣柱分離法提取DNA，洗脫液選擇天根生化科技（北京）有限公司提供的1%瓊脂糖凝膠，并對(duì)低于300 bp的DNA進(jìn)行回收[6]。

1.2.2高通量測(cè)序中PCR擴(kuò)增法 引物為F：5′-TATCATGCCTCTTTGCACCATTC-3′；5′-GGCCTAGC？鄄TTGGACTCAGA-3′，211 bp是產(chǎn)物長(zhǎng)度，其中涵蓋α珠蛋白基因（HBA1，HBA2）中的突變位點(diǎn)。在反應(yīng)體系中，上游引物2 μl，下游引物2 μl，buffer 5 μl×10，Taq DNA酶1 μl，DNTP 4 μl，模板5 μl，雙蒸水50 μl，于94℃環(huán)境中實(shí)施5 min預(yù)變性，然后以94℃變性30 s，56℃處理30 s，72℃處理1 min的模式進(jìn)行循環(huán)，結(jié)束后再于72℃處理5 min。待聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)結(jié)束后，模板選擇3 μl產(chǎn)物，實(shí)施擴(kuò)增，與首次保持一致，最后體積為50 μl[7-8]。

1.2.3高通量測(cè)序信息分析 原始數(shù)據(jù)去掉公共測(cè)序接頭序列，使用SOAP2進(jìn)行全目標(biāo)區(qū)域比對(duì)，并評(píng)價(jià)捕獲特異性及覆蓋度；去除重復(fù)區(qū)域；使用SOAPsnp對(duì)基因組測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行SNP信息分析；通過(guò)2+1核心家系組合，得到父親及母親的單體型信息；通過(guò)父親及母親都是純合但基因型不同的位點(diǎn)計(jì)算血漿中胎兒DNA濃度；通過(guò)父母單體型信息，根據(jù)血漿中的堿基分布，計(jì)算得到胎兒的單體型重組信息；通過(guò)比較胎兒的單體型是否攜帶致病基因，確定胎兒是否患病或攜帶致病基因[9]。

1.2.4羊膜腔穿刺法 孕婦術(shù)前知情告知，排空膀胱，常規(guī)消毒鋪巾，于B超引導(dǎo)下抽取羊水15 ml送檢胎兒地中海貧血基因。獲取胎兒地中海貧血基因結(jié)果。

1.3評(píng)價(jià)指標(biāo)

以羊水穿刺結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算高通量測(cè)序方法的檢出率、誤診率、漏診率。

2結(jié)果

羊水穿刺結(jié)果提示：3例水腫胎，3例HbH病，2例輕型地貧攜帶者，2例地中海貧血基因完全正常。以羊水穿刺結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，胎兒游離DNA高通量測(cè)序的結(jié)果中有9例與羊水穿刺結(jié)果相同，其中1例羊水穿刺結(jié)果提示AA/aa，而高通量測(cè)序結(jié)果顯示為正常。故其檢出率、誤診率及漏診率分別為90.0%（9/10）、0.0%（0/10）和10.0%（1/10），與傳統(tǒng)的羊水穿刺診斷比較，胎兒游離DNA高通量測(cè)序診斷地中海貧血的檢出率較高，對(duì)臨床有一定的指導(dǎo)意義及應(yīng)用意義，且高通量測(cè)序方法具有無(wú)創(chuàng)性。

3討論

α地中海貧血具有危害大、發(fā)病率高等特征[10]，輕型地中海貧血無(wú)需治療，重型患者需要長(zhǎng)期輸血，且多在幼年夭折，因此α地中海貧血的產(chǎn)前篩查極為重要[11-12]。我國(guó)醫(yī)療技術(shù)不斷發(fā)展，產(chǎn)前診斷技術(shù)較為完善，但仍有風(fēng)險(xiǎn)。羊膜腔穿刺、臍帶穿刺等有影響胎兒正常生長(zhǎng)發(fā)育的風(fēng)險(xiǎn)，且會(huì)加重孕婦的心理壓力[13-14]。

在早期，通過(guò)孕婦外周血胎兒游離DNA高通量測(cè)序檢測(cè)β地中海貧血的相關(guān)文獻(xiàn)資料較少，其已被報(bào)道的機(jī)制如下[15-18]：①胎兒細(xì)胞利用胎盤(pán)進(jìn)入母血中，受母體免疫系統(tǒng)的影響，胎兒細(xì)胞DNA會(huì)進(jìn)入母體血漿；②胎兒細(xì)胞發(fā)生凋亡；③胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞發(fā)生凋亡。孕婦外周血進(jìn)行胎兒DNA的分離具備快速、簡(jiǎn)易、經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn)，在保證檢測(cè)方法高效性、特異度與敏感度等的同時(shí)，簡(jiǎn)化操作技術(shù)的條件，可在臨床檢測(cè)中大范圍地推廣應(yīng)用。但是該方法無(wú)法避免母體DNA對(duì)孕婦外周血胎兒游離DNA檢測(cè)結(jié)果的干擾，導(dǎo)致PCR技術(shù)假陽(yáng)性、假陰性等問(wèn)題的存在。

研究報(bào)道指出，妊娠超過(guò)6周后，就可實(shí)施胎兒游離DNA的檢測(cè)，且其濃度隨著孕周的增加而上升，但是在孕婦分娩幾小時(shí)后消失[19-22]。因此孕婦外周血胎兒游離DNA檢測(cè)屬于一種新型的產(chǎn)前診斷無(wú)創(chuàng)技術(shù)，能夠有效提高α地中海貧血胎兒游離DNA高通量測(cè)序的準(zhǔn)確率。本研究結(jié)果顯示，采用胎兒游離DNA高通量測(cè)序得到檢出率為90.0%，1例患者發(fā)生漏診，漏檢率為10.0%，發(fā)生漏診的原因可能是在樣品采集、建庫(kù)及上機(jī)分析等過(guò)程中出現(xiàn)，從而導(dǎo)致胎兒游離DNA高通量測(cè)序的漏診，且在實(shí)際的操作中也可能出現(xiàn)誤差，從而出現(xiàn)誤診的幾率也會(huì)升高，因此在診斷檢測(cè)過(guò)程中進(jìn)行5個(gè)以上的平行分析，可以減少誤差，在今后的研究中注意在檢測(cè)的整個(gè)過(guò)程中漏診情況的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)因經(jīng)費(fèi)情況，納入病例較少，如果增加樣本量，應(yīng)可以大大降低其漏診率。胎兒游離DNA高通量測(cè)序是一種無(wú)創(chuàng)技術(shù)，對(duì)胎兒無(wú)損傷，對(duì)臨床有一定的指導(dǎo)意義，望以后能行大樣本的研究以證實(shí)方法學(xué)的穩(wěn)定性。

綜上所述，采用胎兒游離DNA高通量測(cè)序進(jìn)行地中海貧血的無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前診斷具有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Qu JZ，Leung TY，Jiang P，et al.Noninvasive prenatal determination of twin zygosity by maternal plasma DNA analysis[J].Clin Chem，2013，59（2）：427-435.

[2]侯巧芳，吳東，楚艷，等.孕婦外周血中游離胎兒DNA檢測(cè)在無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前診斷中的臨床應(yīng)用[J].中華婦產(chǎn)科雜志，2012，47（11）：813-817.

[3]汪淑娟，高志英，盧彥平，等.孕婦外周血中游離胎兒DNA檢測(cè)在診斷胎兒染色體異常中的應(yīng)用價(jià)值[J].中華婦產(chǎn)科雜志，2012，47（11）：808-812.

[4]林曉容，尤柳霞，陳勇.孕婦血漿游離胎兒DNA中地中海貧血突變的基因診斷[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志，2013，21（5）：1215-1219.

[5]Yin X，Tan K，Vajta G，et al.Massively parallel sequencing for chromosomal abnormality testing in trophectoderm cells of human blastocysts[J].Biol Reprod，2013，88（3）：69.

[6]王青青，張媛，章鈞，等.通過(guò)富集母血漿中胎兒游離DNA無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前診斷β地中海貧血[J].中國(guó)病理生理雜志，2014，30（10）：1861-1867.

[7]楊麒巍，于杉.孕婦外周血中游離胎兒DNA富集與分離方法及在無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2014，18（2）：345-348.

[8]Lau TK，Chen F，Pan X，et al.Noninvasive prenatal diagnosis of common fetal chromosomal aneuploidies by maternal plasma DNA sequencing[J].J Matern Fetal Neonatal Med，2012，25（8）：1370-1374.

[9]無(wú).高通量測(cè)序聚焦疾病醫(yī)學(xué)研究[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2014， 11（34）：I0001.

[10]黃肯，潘紅飛.肽核酸夾提高孕婦血漿胎兒父源性β珠蛋白突變基因檢出率的研究[J].中華血液學(xué)雜志，2013， 34（3）：233-236.

[11]趙娟，李輝，張成芳，等.孕婦小片段段游離胎兒DNA進(jìn)行β-地中海貧血無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前基因診斷[J].中醫(yī)臨床研究，2016，8（12）：49-51.

[12]Ge H，Huang X，Li X，et al.Noninvasive prenatal detection for pathogenic C′N(xiāo)Vs：the application in alpha-thalassemia[J].PLoS One，2013，8（6）：e67464.

[13]趙愛(ài)玲，楊躍煌，劉煒，等.地中海貧血的基因診斷及DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶在地中海貧血發(fā)病機(jī)制中作用的研究[J].醫(yī)學(xué)研究雜志，2013，42（4）：41-44.

[14]米陽(yáng)，李志斌，賀同強(qiáng)，等.孕婦外周血漿中小片段游離胎兒DNA在無(wú)創(chuàng)性唐氏綜合征檢測(cè)中的應(yīng)用[J].中國(guó)婦幼保健，2014，29（30）：4997-4998.

[15]Zhou W，Wang G，Zhao X，et al.A multiplex qPCR gene dosage assay for rapid genotyping and large-scale population screening for deletional α-thalassemia[J].J Mol Diagn，2013，15（5）：642-651.

[16]段發(fā)紅.平均紅細(xì)胞體積測(cè)定在孕前檢查地中海貧血篩查中的應(yīng)用價(jià)值[J].中國(guó)當(dāng)代醫(yī)藥，2016，23（10）：120-122.

[17]王媛，師曉艷.孕婦血漿中游離胎兒DNA對(duì)檢測(cè)胎兒ABO血型40例分析[J].昆明醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，32（1）：140-141.

[18]王文博，張毅，孫樹(shù)漢，等.孕婦外周血中胎兒游離DNA在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用[J].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，30（4）：442-446.

[19]楊濰嘉，黃開(kāi)明，申琰軍，等.地拉羅司治療2～6歲重型β-地中海貧血鐵過(guò)載一年安全性觀察[J].臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2014，13（9）：708-710.

[20]趙婧，張艷芳，梁少霞.產(chǎn)前基因診斷預(yù)測(cè)地中海貧血胎兒的價(jià)值分析[J].中國(guó)當(dāng)代醫(yī)藥，2015，22（10）：4-6.

[21]Ordo？觡ez E，Rueda L，Ca？觡adas MP，et al.Evaluation of sample stability and automated DNA extraction for fetal sex determination using cell-free fetal DNA in maternal plasma[J].Biomed Res Int，2013，2013（12）：2547-2551.

[22]Torres B，Stoffel TJ，Oro D，et al.Early non-invasive fetal RHD genotyping and sex determination by conventional and multiplex PCR performing a rapid and low-cost cell-free fetal DNA extraction method[J].Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol，2012，165（2）：370.

（收稿日期：2016-07-25 本文編輯：王紅雙）