馬松亞 ，蔣維昕 ，2，屈林豐 ，曹雪寧 ，譚 玲 ，楊 梅 ，2

（1. 廣西大學 林學院 ，廣西 南寧 530004；2. 廣西林業(yè)科學與工程高校重點實驗室，廣西 南寧 530004）

桉樹無性系葉片蛋白質組雙向電泳體系優(yōu)化

馬松亞1，蔣維昕1，2，屈林豐1，曹雪寧1，譚 玲1，楊 梅1，2

（1. 廣西大學 林學院 ，廣西 南寧 530004；2. 廣西林業(yè)科學與工程高校重點實驗室，廣西 南寧 530004）

為了建立適用于桉樹葉片蛋白質組研究的雙向電泳體系，以尾葉桉Eucalyptus urophyllas廣林4號無性系作為試驗材料，對蛋白質樣品獲取方法、雙向電泳等電聚焦膠條pH范圍、蛋白質上樣量、膠條平衡條件以及染色方法進行了優(yōu)化。結果表明：提取液+酚抽提法最適合桉樹葉蛋白質的提取，電泳圖譜可檢測到850個蛋白質點。7 mol/L尿素+2 mol/L硫脲+4% Chaps+60 mmol DTT 10 μL的蛋白質干粉裂解液，裂解效果較好；使用50 mg蛋白質干粉和600 μL裂解液所獲得的蛋白質濃度較高，為3.97 μg/μL。使用 pH4～7、24 cm IPG膠條，蛋白質上樣量為1 200 μg，并加入375 mg碘乙酰胺，采用考馬斯亮藍染色，獲得的蛋白點清晰，沒有拖尾現(xiàn)象，條紋極少，分布較均勻。

桉樹；葉片；蛋白質組；無性系；雙向電泳

蛋白質組學研究的目的是為了弄清某一生物體中基因編碼的所有蛋白質，建立蛋白質組學數據庫，并著重于尋找和篩選任何有意義的兩個材料之間的差異蛋白質譜，揭示細胞生理和病理狀態(tài)的進程與本質、對外界環(huán)境刺激的反應途徑以及細胞調控機制，同時對某些關鍵蛋白進行定性和功能分析[1]。在植物的生存環(huán)境中，會受到非生物因子脅迫,這些脅迫可以引起大量的蛋白質在種類和表達量上的變化。蛋白質組學可以檢測逆境脅迫下植物體內差異表達的蛋白質，再通過差異蛋白質組學研究，可以使我們更好地了解脅迫的傷害機制以及植物對非生物環(huán)境的適應機制[2]。目前針對特定林木的研究大多關注于基因的克隆鑒定和表達[3-5]，而針對林木在低溫、干旱等脅迫下的差異蛋白鑒定中的應用相對有限。

桉樹Eucalyptus是熱帶亞熱帶地區(qū)，尤其是我國廣西地區(qū)極為重要的造林樹種[6]。然而，為了追求速生、豐產，經營效益最大化，大面積單基因型桉樹人工純林的營造以及集約化經營管理模式的推廣，造成林分結構、樹種組成單一化，林地生態(tài)環(huán)境趨同，導致桉樹林生態(tài)系統(tǒng)生態(tài)環(huán)境惡化，抗逆能力降低，各種桉樹病害頻繁暴發(fā)、種類不斷增加、面積顯著擴大[7-8]。

本試驗以尾葉桉Eucalyptus urophyllas廣林4號無性系為研究對象，對桉樹葉片蛋白質雙向電泳技術中的影響因素進行探討，同時對電泳體系進行條件優(yōu)化，以獲得純度高、分離效果好，清晰度高的桉樹葉蛋白雙向電泳圖譜，為深入研究桉樹在逆境下的適應機制，從蛋白質組水平上探索其蛋白質及基因的表達差異的研究奠定基礎，并為其他水平上的深入研究提供參考。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為廣西林科院提供的尾葉桉4號2月生苗木。鋁處理濃度分別為0 mg/L和120 mg/L Al3+，每個處理設3個重復，每個重復6株苗木，共36株。在Hoagland營養(yǎng)液預培養(yǎng)40 d，轉入55.5 mg/L CaCl2中培養(yǎng)1 d，以55.5 mg/L CaCl2為基本營養(yǎng)液，鋁以分析純AlCl3·6H2O為供源加入，處理24 h。

1.2 試驗方法

1.2.1 葉蛋白質干粉制備方法

方法1：直接提取法

分次稱取桉樹葉片3.0 g左右，加入液氮充分研磨后的粉末快速轉移至2 mL離心管中，加入4倍于葉片粉末體積的提取液（7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，2%CHAPS，1%PMSF，1%蛋白酶抑制劑），置于冰上震蕩3 h后，在4℃下14 000 r/min的條件下離心25 min，吸取上清液至另一2 mL離心管中，加入4倍體積-20℃預冷丙酮（含0.07%巰基乙醇），-20℃過夜后，在4 000 r/min離心25 min，用無水乙醇洗滌蛋白沉淀2次，80%丙酮洗滌沉淀1次，然后將蛋白沉淀置于-20℃至丙酮揮發(fā)干凈。

方法2：改良的TCA丙酮法

取樣及樣品前處理與方法一相同。樣品在-20℃過夜、離心后，向上清液中加入6倍于沉淀體積的-20℃預冷的丙酮溶液（含0.07%巰基乙醇），用槍頭將沉淀搗碎，上下晃動充分混勻，放在-20℃冰箱中沉淀3 h，以充分沉淀蛋白，在4℃下14 000 r/min離心25 min，棄上清。將上一步驟重復兩次直至上清液呈現(xiàn)無色，然后將蛋白沉淀置于-20℃至丙酮揮發(fā)干凈。

方法3：提取液+酚抽提法

此方法采用Saravanan[9]的方法進行改良。

分次稱取桉樹葉片3.0 g左右，放入預冷的研缽中，加入液氮充分研磨，然后加入2 mL提取液（含有2%PVP和2%巰基乙醇）繼續(xù)充分研磨成勻漿狀態(tài)。再加入4 mL Tris-飽和酚，在冰上進行充分研磨，最后加入3 mL預冷提取液繼續(xù)充分研磨，將勻漿快速轉移到冰上的2 mL離心管中，震蕩平衡大約2 h。在4℃，14 000 r/min離心30 min。然后取酚層轉移至新的離心管中，重復上一步驟一次。加入五倍于酚層體積的醋酸銨甲醇溶液，置于-20℃冰箱過夜。在4℃，14 000 r/min的條件下，離心15 min，棄上清，用-20℃預冷甲醇（使用前加入0.07%巰基乙醇）洗滌沉淀，之后4℃，14 000 r/min離心，棄上清，所得沉淀即為桉樹葉的蛋白質粗提樣品。

1.2.2 裂解液成份

裂解液甲加9 mol/L 尿素，裂解液乙加7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲。兩者均加入4%(W/V)CHAPS，用超純水定容，DTT在使用前加入。兩種裂解液在使用之前都分別加入濃度為0 mmoL、20 mmoL、40 mmoL、60 mmoL、80 mmoL、100 mmoL DTT溶液。

稱取50 mg蛋白質干粉，分別加入400 μL、600 μL、800 μL 以及 1000 μL 裂解液乙，對蛋白濃度進行測定。

1.2.3 膠條pH的選擇

本研究選擇非線性膠條pH3～10、24 cm和pH4～7、24 cm兩種規(guī)格。

1.2.4 蛋白質上樣量的比較

本研究選用 600 μg、900 μg、1 200 μg/24 cm 3個不同濃度梯度的IPG膠條進行雙向電泳。

1.2.5 碘乙酰胺用量的確定

本研究對膠條進行了兩次平衡，時間均設置為15 min。第一次平衡液體積為15 mL并加入150 mg DTT；第二次平衡液體積為15 mL，分別加入碘乙酰胺375 mg和150 mg，對不同碘乙酰胺用量的平衡效果進行比較。

1.2.6 染色方法的比較

本研究對硝酸銀染色法與考馬斯亮藍染色法的效果進行對比。

2 蛋白質雙向電泳方法

2.1 第一向等電聚焦

IEF使用IPG非線性膠條，按照Bio-Rad雙向電泳操作手冊操作。定量后計算出的樣品含量，吸取一定體積的樣品溶液，加入IEF上樣緩沖液進行等電聚焦。

2.2 第二向SDS-PAGE電泳

等電聚焦結束后，立即進行膠條平衡，平衡分兩步，每次 15 min。平衡結束后，立即進行第二向電泳。起始時使用220 v，10 μA/根膠條的電流，待蛋白樣品完全進入凝膠之后使用360 v，15 μA/根膠條的電流。電泳結束后, 進行染色。

3 結果與分析

3.1 適合桉樹葉蛋白質雙向電泳的蛋白質干粉制備方法

直接沉淀法得到雙向電泳二維圖譜見圖1A，在圖譜上幾乎沒有看到蛋白質點，在膠條的酸性端橫向和縱向條紋較嚴重，并且凝膠背景色很深。這說明直接沉淀法提取桉樹葉片蛋白質的效率較低，并且去除干擾物質的效果較差，提取蛋白中雜質含量較多。改良的TCA丙酮法得到雙向電泳二維圖譜見圖1B，蛋白點數量相對于丙酮沉淀法有所增多，但是橫向和縱向條紋仍然存在，蛋白拖尾嚴重。提取液+酚抽提法得到雙向電泳二維圖譜見圖1C，橫向和縱向條紋較少，蛋白質點的數目明顯增加，呈現(xiàn)圓形或者橢圓形，分布均勻并且?guī)缀鯖]有拖尾現(xiàn)象，分離效果較好，背景清晰，適合進行雙向電泳。

3.2 適合桉樹葉蛋白質干粉的裂解液成份

分別在裂解液甲和裂解液乙中加入0 mmol、20 mmol、40 mmol、60 mmol、80 mmol、100 mmol濃度的DTT。

從圖2可以看出，裂解液乙較裂解液甲對蛋白質干粉的溶解度明顯較大。DTT濃度的變化對裂解液甲裂解蛋白質的效果不明顯，但是在不同DTT濃度下裂解液乙裂對蛋白質干粉的溶解度呈現(xiàn)出明顯的變化趨勢，伴隨著DTT濃度的上升呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，在DTT濃度達到60 mmol時蛋白溶解度達到最大值，裂解效果最好。

圖1 不同提取方法的雙向電泳凝膠圖譜Fig. 1 2-DE protein pro fi les obtained with different protein extraction methods

圖2 不同裂解液對蛋白裂解的影響Fig. 2 Effect of different lysis buffers on protein lysis

3.3 裂解液劑量對蛋白質干粉溶解效果的影響

50 mg 蛋白質干粉分別加入 400 μL，600 μL，800 μL以及1 000 μL裂解液乙（使用前加入10 μL 60 mmol DTT），所獲得的蛋白濃度分別為2.89μg/μL、3.97 μg/μL、2.23 μg/μL 和 2.04 μg/μL。結果表明，使用600 μL裂解液進行裂解時所獲得的蛋白濃度較高。結果見圖3。

圖3 裂解液劑量對蛋白質濃度的影響Fig. 3 Effect of dosages of lysis buffer on protein concentration

3.4 等電聚焦膠條pH范圍的選擇

采用pH3～10、24 cm的IPG線性膠條，上樣量為1200 μg時，蛋白質點在膠條酸性端分布較多，而在堿性端幾乎沒有被檢出。采用pH4～7的膠條分離的蛋白質點分布均勻，并且清晰，可用于桉樹葉蛋白的雙向電泳圖譜分析。雙向電泳圖譜可見圖4。

圖4 不同膠條pH的雙向電泳圖譜Fig. 4 2-DE protein pro fi les of different pH

3.5 適合雙向電泳的蛋白質上樣量

在圖5A中，上樣量為 600 μg 時，雙向電泳凝膠圖譜并不理想，蛋白點不但分布極不均勻，而且總數較少并且蛋白點亮度和清晰度不夠，尤其是在膠條的堿性端，幾乎沒有檢測到蛋白質點。在圖5B中，上樣量為 900 μg 時，凝膠圖譜比上樣量為600 μg蛋白質點總數有所上升，但是堿性端的蛋白質點數量仍然較少，蛋白質點圓度、亮度和清晰度不夠，分布不均。在圖5C中，上樣量為1 200 μg時，蛋白點總數明顯上升并且多數蛋白質點較大較圓，分布較均勻，沒有出現(xiàn)明顯拖尾和條紋等現(xiàn)象，整張圖譜適合進行雙向電泳圖譜分析以及質譜鑒定。因此，上樣量為1 200 μg較為合適。

圖5 不同上樣量的雙向電泳凝膠圖譜Fig. 5 2-DE protein pro fi les obtained with different sample volumes

3.6 提高IPG膠條平衡效果的碘乙酰胺用量

平衡結果分別如圖6A和6B所示，第二次平衡過程中使用15 mL平衡液加375 mg碘乙酰胺的平衡效果較好，條紋較少并且蛋白點較圓，適合雙向電泳圖譜分析。

3.7 適合蛋白質雙向電泳的凝膠染色方法

本研究采用了硝酸銀染色和考馬斯亮藍染色兩種方法，硝酸銀染色與考馬斯亮藍染色結果分別如圖7A和7B所示。硝酸銀染色背景顏色深、蛋白質點被掩蓋，無法進行凝膠圖譜分析?？捡R斯亮藍染色蛋白點清晰、均勻并且沒有出現(xiàn)拖尾和條紋等現(xiàn)象，是比較適合桉樹葉蛋白質雙向電泳凝膠染色的方法。

4 結論與討論

蛋白質雙向電泳分析中的一個關鍵步驟是蛋白質樣品制備，蛋白質樣品制備主要包括蛋白質干粉的提取和裂解兩個方面。在直接提取法、改良TCA丙酮法和提取液+酚抽提法等3種方法中，提取液+酚抽提法所獲得的蛋白質適合進行桉樹葉蛋白質雙向電泳，提取蛋白質點清晰、條紋少、數量多。增加蛋白質在裂解液中的溶解度和解聚狀態(tài)，避免蛋白質在裂解過程中的降解和丟失是利用雙向電泳技術分析植物蛋白質的核心所在。裂解液的組成中主要包括離液劑、還原劑及各種去污劑等[10]。DTT在蛋白裂解中作為還原劑起到變性作用，硫脲的存在大大提高了桉樹葉蛋白質裂解的效果，這是由于硫脲的高效增溶性從很大程度上增加了蛋白質的溶解性，較適合于植物蛋白質的裂解，Chaps作為兩性電解質可以較好的提高蛋白的溶解效果，目前已在其他試驗研究中應用[11]。

不同長度的 IPG 膠條所需的上樣量也不同，蛋白質樣品上樣量過大或者過小都會影響到雙向電泳圖譜的效果[12]，本研究通過對三種不同上樣量所得結果進行對比，認為上樣量為1 200 μg 時使用pH4～7的24 cm IPG膠條，所獲得的蛋白質點總數明顯上升并且蛋白質點較大較圓，分布比較均勻，沒有出現(xiàn)明顯拖尾和條紋等影響雙向電泳圖譜分析的現(xiàn)象，整張圖譜適合進行雙向電泳圖譜分析以及質譜鑒定。

圖6 碘乙酰胺用量對平衡效果的影響Fig. 6 Effect of dosages of iodoacetamide on equilibrium

圖7 不同染色方法的雙向電泳凝膠圖譜Fig. 7 2-DE protein pro fi les obtained with different staining methods

目前對雙向電泳蛋白質檢測的常用染色方法主要有銀染法和考馬斯亮蘭染色法。考馬斯亮蘭操作容易，藥品毒性較低，成本低，更為重要的是與質譜的兼容性較高[13]，而且操作簡便。硝酸銀染的優(yōu)點是其靈敏度較高，檢測限為 0.1 ng[14]有利于低豐度蛋白的檢出，上樣所需的蛋白質量較少。與銀染方法相比，考馬斯亮蘭染色后，電泳圖譜背景較容易去除，蛋白點清晰，分布均勻，并且沒有出現(xiàn)拖尾和條紋等現(xiàn)象，是比較適合桉樹葉蛋白質雙向電泳的凝膠染色方法。

通過對桉樹無性系葉片雙向電泳體系的優(yōu)化，提取液+酚抽提法較適合桉樹葉蛋白質干粉的提?。皇褂?M尿素，2M硫脲以及4%Chaps，在使用前加入60 mmol的DTT10 μL可以提高蛋白質干粉的裂解效果；含有50 mg蛋白質干粉的600 μL裂解液進行裂解時所獲得的蛋白濃度較高；使用pH4～7的24 cm IPG膠條、上樣量為1 200 μg時，對桉樹葉蛋白的分離效果較好，第二次平衡加入375 mg碘乙酰胺平衡效果較好，考馬斯亮藍染色是較適合桉樹無性系葉雙向電泳凝膠的染色方法，適合軟件分析和質譜鑒定。該優(yōu)化體系為后續(xù)的桉樹葉蛋白質組學及進一步探討桉樹抗逆性的分子響應機制提供了試驗基礎。

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Optimization of two-dimensional electrophoresis for proteome of Eucalyptus clones leaves

MA Song-ya1, JIANG Wei-xin1,2, QU Lin-feng1, CAO Xue-ning1, TAN Ling1, YANG Mei1,2
(1. College of Forestry, Guangxi University, Nanning 530004, Guangxi, China;2. Key Laboratory of Forestry Science and Technology in Guangxi, Nanning 530004, Guangxi, China)

A suitable two-dimensional electrophoresis(2-DE) system for proteomic of Eucalyptus leaves was established ,by selecting the extraction methods， pH gradient of IPG strips and optimizing sample loading, equilibrium and straining methods. The results showed that phenol extraction was suitable forEucalyptusleaves protein extraction by 850 detected protein spots. Using the lysis buffer contained 7M urea, 2M thiourea , 4% Chaps and adding 60 mmol DTT 10 μL may obtain the better lytic effect. When using 600 μL lysis buffer with 50 mg protein powder, protein concentration was up to 3.97μg/μL that met the demand of 2-DE. By loading 1 200 μg proteins on the 24 cm IPG strip with pH4～7 and 375mg iodacetamide for equilibrium, the clear and round protein spots were detected with uniform distribution and less steak on the gel when using blue-silver staining method.

Eucalyptus; leaves; Proteome; clones; two-dimensional gel electrophoresis

S792.39

A

1673-923X(2016)04-0045-06

10.14067/j.cnki.1673-923x.2016.04.009

http: //qks.csuft.edu.cn

2015-04-10

國家自然科學基金：鋁誘導不同耐鋁型速生桉無性系根有機酸分泌特征及調控機理（31070560）

馬松亞，碩士研究生

楊 梅，教授，博士；E-mail：fjyangmei@126.com

馬松亞，蔣維昕，屈林豐，等. 桉樹無性系葉片蛋白質組雙向電泳體系優(yōu)化[J].中南林業(yè)科技大學學報, 2016,36(4):45-50.

[本文編校：吳 彬]