趙東海 ， 黃建玉 ， 唐際蘭 ， 何金林 ， 畢蓮茹

(1.吉林醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理教研室 ， 吉林吉林132013 ； 2.吉林醫(yī)藥學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院 ， 吉林吉林132013)

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淫羊藿多糖對醋酸鉛致生精障礙小鼠的治療作用

趙東海1， 黃建玉2， 唐際蘭2， 何金林2， 畢蓮茹2

(1.吉林醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理教研室 ， 吉林吉林132013 ； 2.吉林醫(yī)藥學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院 ， 吉林吉林132013)

為觀察淫羊藿多糖對生精障礙BALB/c小鼠的治療作用，將60只BALB/c雄性小鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、陽性藥物組、淫羊藿多糖高、中、低劑量組，每組10只；除空白組外，其余各組小鼠腹腔注射醋酸鉛制備小鼠生精障礙模型。通過灌胃不同濃度淫羊藿多糖及陽性藥物維生素E，研究了淫羊藿多糖對生精障礙小鼠精子數(shù)量、畸形率、活率，生殖激素水平及睪丸形態(tài)的影響。結(jié)果：淫羊藿多糖各劑量組能夠升高生精障礙小鼠精子密度和精子活率，降低精子畸形率,降低血清卵泡雌激素和黃體生成素水平，升高睪丸組織睪酮含量(P<0.01)，且各劑量組對生精功能改善作用呈劑量依賴性。形態(tài)學(xué)觀察，淫羊藿多糖可改善小鼠睪丸組織的病理學(xué)損害。表明淫羊藿多糖對醋酸鉛所致小鼠生精功能的損傷具有治療作用，作用機(jī)制可能與改善或恢復(fù)生殖內(nèi)分泌激素水平有關(guān)。

淫羊藿多糖 ； 醋酸鉛 ； 生精障礙 ； 生殖激素

近年來，因各種損傷因素的作用導(dǎo)致男性精液質(zhì)量呈不斷下降趨勢。研究表明，我國育齡夫婦不孕、不育發(fā)生率為12.5%。其中,因男性生育能力缺陷所致的不育者約占50%左右[1]，少精癥和(或)弱精癥等精子質(zhì)量異常是導(dǎo)致男性不育的主要原因[2]。傳統(tǒng)中藥方劑在改善男性生殖功能方面具有較好的效果[3-4]，但由于藥物種類多，成分復(fù)雜，使得中藥生精的藥理作用和相關(guān)機(jī)制尚未闡明，研究中藥有效成分在生精障礙中的作用和機(jī)制，對男性不育藥物的研發(fā)具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

淫羊藿為小檗科淫羊藿屬植物,其莖葉入藥,辛溫?zé)o毒,有堅(jiān)筋骨、益精氣、補(bǔ)腰腎、強(qiáng)心力等作用[5],為傳統(tǒng)補(bǔ)益中藥。本試驗(yàn)，制備獲得淫羊藿有效成分淫羊藿多糖，通過腹腔注射醋酸鉛制備BALB/c小鼠生精障礙模型，，探討淫羊藿多糖對生精損傷小鼠生精功能的治療作用，為淫羊藿多糖在生精障礙中的開發(fā)和應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 60只SPF級雄性BALB/c小鼠，體重20±2 g，購自吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，合格證號:SCXK(吉)2008-0005。

1.2 藥物與試劑 淫羊藿，購自吉林大藥房(批號：20140913)。醋酸鉛：上?；瘜W(xué)試劑廠。卵泡刺激素(FSH)、黃體生成素(LH)和睪丸組織勻漿睪酮(T)檢測試劑盒，購自北京科美東雅生物技術(shù)有限公司。其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.3 淫羊藿多糖的制備 淫羊藿100 g，洗凈剪碎并研磨成粉，，按參考文獻(xiàn)[6]方法并加以改進(jìn)，以水提醇沉法制備淫羊藿多糖。料水比為1∶25，提取溫度為90 ℃，提取時(shí)間為1.5h,提取次數(shù)為3次,醇沉濃度為700mL/L，得粗多糖。用氯化鈣除蛋白，加活性炭脫色，透析除去無機(jī)鹽，獲得淫羊藿多糖。用苯酚-硫酸比色法測定多糖含量，以葡聚糖溶液為對照品做標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品含糖量約為58.2 mg/g。

1.4 模型制備及動物分組處理 60只BALB/c小鼠以單純隨機(jī)抽樣法分為正常組、模型組、陽性藥物組以及淫羊藿多糖低、中、高劑量組，每組10只。除正常組外，給予其余5組BALB/c小鼠腹腔注射醋酸鉛20 mg/(kg·d)，連續(xù)7 d，制備生精障礙模型。造模后，淫羊藿多糖低、中、高劑量組分別給予淫羊藿多糖50、100、200 mg/(kg·d)灌胃，陽性藥物組維生素E 10 mg/(kg·d)灌胃，正常組和模型組均灌胃等體積生理鹽水，均每天1次，連續(xù)30 d。

1.5 檢測指標(biāo)與方法

1.5.1 取材 末次給藥24 h后全部小鼠稱體重，腹主動脈取血并分離血清。右側(cè)睪丸放入4%福爾馬林固定行組織形態(tài)學(xué)檢測。左側(cè)取附睪和睪丸，其中睪丸制成勻漿，以3000 r/min離心10 min，取上清液。附睪進(jìn)行精子密度、精子畸形率及精子活率檢測。

1.5.2 精子密度、畸形率及活率檢測 取單側(cè)附睪，剪碎組織并放入預(yù)熱至37 ℃精子營養(yǎng)液[7]中，37 ℃靜止10 min，使精子充分游離釋放，按照細(xì)胞計(jì)數(shù)法計(jì)算精子密度；另取5 μL 精子懸液與等量伊紅- Y 混勻，室溫下放置10 min，加蓋玻片，光鏡下觀察，死精子呈粉紅色，活精子不著色而呈胞質(zhì)透明，每份標(biāo)本計(jì)數(shù)200 個(gè)精子，計(jì)算精子活率；另從試管中取5 μL 精子懸液，甲醇固定5 min，2%伊紅水溶液染色1 h，用高倍鏡按順序檢查精子形態(tài)，頭部無鉤、香蕉形、胖頭等形態(tài)精子判定為畸形，每只小鼠檢查完整的精子1 000 個(gè)，計(jì)算精子畸形率。

1.5.3 生殖激素測定 取分離后血清及睪丸組織勻漿液，利用酶聯(lián)免疫試劑盒測定血清FSH 和LH 及睪丸組織勻漿T 水平，試驗(yàn)步驟和方法按照試劑盒說明書完成。

1.5.4 睪丸組織形態(tài)學(xué)檢測 取小鼠睪丸石蠟切片，H.E.染色，光鏡觀察睪丸組織形態(tài)結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 淫羊藿多糖對小鼠精子密度、畸形率及活率的影響 由表1可見，模型組小鼠精子密度和精子活率均低于正常對照組，精子畸形率高于正常組(P<0.01)。與模型組相比，淫羊藿多糖劑量組精子密度、精子活率增高，精子畸形率降低(P<0.01)。淫羊藿多糖對精液質(zhì)量的改善隨藥物濃度的增高，作用效果也更明顯，存在劑量依賴關(guān)系。陽性藥物組對精子功能改善作用與200 mg/kg 淫羊藿多糖劑量組相似。

表1 淫羊藿多糖對各組小鼠精子密度、活率及畸形率影響 ±s,n=10)

注：與正常對照組比較，*P<0.01,#P<0.05,；與模型組比較△P<0.01；與50 mg/kg組比較▽P<0.01;與100 mg/kg組比較▲P<0.01

2.2 淫羊藿多糖對小鼠生殖激素的影響 由表2可見，模型組小鼠血清FSH和LH含量均高于正常組，睪丸組織勻漿T含量低于正常組(P<0.01)。與模型組相比，淫羊藿多糖各劑量組FSH和LH含量降低，睪丸組織勻漿T含量升高(P<0.01)。淫羊藿多糖對生殖激素含量的影響隨藥物濃度的增高，作用效果也更明顯，存在劑量依賴關(guān)系。

表2 淫羊藿多糖對小鼠血清FSH、LH和睪丸組織T含量的影響

組別(mg/kg)劑量mg/kgFSH(U/L)LH(U/L)T(nmol/L)正常對照組-3.32+0.584.87+0.969.58+0.84模型組-6.44+0.87*8.29+0.83*2.98+0.65*淫羊藿多糖組505.94+0.63*△7.72+0.61*△3.68+0.84*△1004.82+1.38*△▽6.19+0.36*△▽5.52+0.54*△▽2003.73+0.21#△▽▲5.13+0.68#△▽▲7.23+0.34#△▽▲陽性藥物組103.87+0.69#△▽▲5.29+0.34#△▽▲7.88+0.62#△▽▲

注：與正常對照比較，*P<0.01,#P<0.05,；與模型組比較△P<0.01；與100 mg/kg組比較▽P<0.01;與200 mg/kg組比較▲P<0.01

2.3 淫羊藿多糖對小鼠睪丸形態(tài)影響 結(jié)果見中插彩版圖1，與正常對照組相比，模型組小鼠睪丸生精小管排列紊亂，生精上皮層數(shù)明顯變少，生精細(xì)胞數(shù)量變少，排列紊亂，腔內(nèi)成熟精子少。淫羊藿多糖各劑量組睪丸組織形態(tài)有不同程度改善，生精小管逐漸密集，生精上皮數(shù)量不斷增多，淫羊藿多糖對受損睪丸形態(tài)學(xué)改善作用隨藥物濃度的增高，效果也更明顯，存在劑量依賴關(guān)系。

3 討論

鉛是重金屬之一，長期接觸鉛而導(dǎo)致的中毒是我國慢性職業(yè)中毒的主要原因[8]。鉛不僅對神經(jīng)系統(tǒng)、造血系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等具有毒性作用，而且對生殖系統(tǒng)也會造成損傷[9]，鉛可以通過血-睪丸屏障沉積在睪丸生精小管及管周組織，進(jìn)而對睪丸產(chǎn)生損傷毒害作用[10]。本研究結(jié)果證實(shí)，20 mg/kg 醋酸鉛連續(xù)腹腔注射7 d可導(dǎo)致小鼠精子密度減少、活率降低及畸形率的增高，小鼠睪丸也出現(xiàn)組織學(xué)改變，導(dǎo)致睪丸損傷的發(fā)生。

淫羊藿是傳統(tǒng)的藥用植物，具有補(bǔ)腎壯陽的作用，主治陽萎早泄，腰酸腿痛，神經(jīng)衰弱等，是改善男性生殖功能常用的組方藥[11]。淫羊藿多糖是淫羊藿的重要有效成分，藥理學(xué)研究表明，淫羊藿多糖具有抗病毒、抗腫瘤、抗氧化應(yīng)激損傷、延緩衰老及調(diào)節(jié)免疫的作用[12-14]。本研究利用水提醇沉法制備獲得淫羊藿多糖，并檢測了不同濃度淫羊藿多糖對醋酸鉛致生精障礙小鼠的治療作用。結(jié)果證實(shí)：淫羊藿多糖各劑量組均可不同程度升高精子密度，增加精子活率并降低精子畸形率，表明淫羊藿多糖對小鼠受損傷睪丸和精子的形成具有明顯的治療作用。睪丸形態(tài)學(xué)檢測證實(shí)，淫羊藿多糖作用后可改善睪丸生精小管損傷的作用。提示，淫羊藿多糖具有治療和恢復(fù)損傷生精上皮的作用。

精子的發(fā)生和正常發(fā)育是保證精子數(shù)量和質(zhì)量前體條件。睪丸生精小管內(nèi)保持較高濃度的T對促進(jìn)精子發(fā)生具有重要作用[15]。在人體的內(nèi)分泌系統(tǒng)中，下丘腦-垂體-性腺軸內(nèi)分泌激素水平尤其是雄性生殖激素的含量，調(diào)控著精子的發(fā)生過程及睪丸局部T含量，這其中FSH、LH的含量及變化對精子的發(fā)生及質(zhì)量的影響最為重要。FSH、LH 為垂體分泌的糖蛋白類激素，F(xiàn)SH可與其位于生精小管的支持細(xì)胞膜上的受體結(jié)合，促進(jìn)或增加性激素結(jié)合蛋白的產(chǎn)生，使睪丸組織中T濃度維持在較高水平。LH則具有刺激睪丸間質(zhì)細(xì)胞合成和分泌T的作用，不僅可提高睪丸局部T含量，而且可與FSH協(xié)同作用促進(jìn)精子的成熟，并與精子的活動力有關(guān)[16]。有研究證實(shí)，F(xiàn)SH和LH水平可作為睪丸生精功能的預(yù)測指標(biāo)，如果FSH明顯增高，提示睪丸生精功能嚴(yán)重受損，如果LH升高越明顯提示睪丸受損可逆性越差[17]。

本試驗(yàn)中，模型組小鼠睪丸組織勻漿T含量降低，結(jié)合精液質(zhì)量結(jié)果，提示鉛中毒后可影響精子產(chǎn)生，造成生精功能障礙。同時(shí)，血清FSH、LH含量增高，提示T含量降低可通過負(fù)反饋機(jī)制作用于丘腦-垂體-性腺軸，進(jìn)而促進(jìn)FSH、LH分泌增多，使血中兩種生殖內(nèi)分泌激素含量升高。淫羊藿多糖干預(yù)后，睪丸組織T含量增高，而且睪丸形態(tài)損傷也明顯好轉(zhuǎn)，血中FSH、LH含量降低。提示，淫羊藿多糖可刺激生精上皮再生，減輕睪丸組織損傷，升高睪丸局部T含量，恢復(fù)丘腦-垂體-性腺軸的內(nèi)分泌調(diào)控作用而提高精子數(shù)量和質(zhì)量，從而治療因鉛中毒引發(fā)的生精障礙。

綜上所述，淫羊藿多糖能有效治療因醋酸鉛導(dǎo)致的生精障礙，提高精子數(shù)量和活率，降低精子畸形率，提高睪丸局部T含量，降低血清FSH、LH含量，并能夠減輕或恢復(fù)受損睪丸組織形態(tài)，從而改善生精功能。

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2015-09-09

趙東海(1975-),男,副教授，博士，從事生殖病理研究工作，E-mail：zdh1027@sina.com

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0529-6005(2016)10-0029-03