皇甫和平 ， 許文博 ， 石冬梅

(河南牧業(yè)經(jīng)濟學(xué)院動物醫(yī)學(xué)院 ， 河南鄭州450046)

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奶牛蜂窩織炎奇異變形桿菌的分離鑒定及藥敏試驗

皇甫和平 ， 許文博 ， 石冬梅

(河南牧業(yè)經(jīng)濟學(xué)院動物醫(yī)學(xué)院 ， 河南鄭州450046)

從奶牛蜂窩織炎病變組織中分離出1株細菌，通過菌落形態(tài)觀察、染色鏡檢，以及16S rRNA 基因的PCR 擴增和序列分析，證實分離到的細菌為奇異變形桿菌(Proteus mirabilis，PM)。藥敏試驗結(jié)果顯示，該菌株對慶大霉素、左氧氟沙星、氨芐西林、阿米卡星、氯霉素和磺胺甲氧嘧啶敏感，但同時也產(chǎn)生了一定的耐藥性，對頭孢曲松、頭孢噻肟和四環(huán)素耐藥。提醒今后在奶牛外科感染的治療中，應(yīng)注意耐藥性問題。

奶牛 ； 蜂窩織炎 ； 奇異變形桿菌 ； 分離鑒定 ； 藥敏試驗

蜂窩織炎是機體疏松結(jié)締組織內(nèi)發(fā)生的一種急性彌漫性化膿性感染，屬于一種嚴重的外科感染。引起蜂窩織炎的病原菌種類很多，常見的有金黃色葡萄球菌、溶血性鏈球菌和大腸桿菌等。

奇異變形桿菌(Proteusmirabilis，PM)是一種條件致病菌，屬于腸桿菌科變形桿菌屬，能引起人、禽、羊和豬等多種動物感染。近幾年國內(nèi)變形桿菌引起奶牛感染的病例陸續(xù)增多，其可引起子宮內(nèi)膜炎、乳腺炎、關(guān)節(jié)炎和呼吸道感染等[1-4]。但奶牛蜂窩織炎中奇異變形桿菌的分離未見報道。筆者在2014 年的奶牛疾病臨床診療中，見1例典型的蜂窩織炎病例。病牛腹壁皮下發(fā)生大范圍蜂窩織炎，病牛表現(xiàn)精神沉郁，食欲不振，體溫升高，臥地不愿行走，腫脹由乳腺前部的腹壁皮下至胸壁部皮下，剖檢在相應(yīng)部位可見大量化膿肉芽組織。本實驗室從蜂窩織炎病料中分離出1 株細菌，通過形態(tài)觀察、顯微鏡鏡檢、16SrRNA 基因的PCR 擴增及序列分析，鑒定為奇異變形桿菌。隨后利用11 種藥物對分離菌株進行了敏感性試驗。

1 材料

1.1 主要試劑TaqPCR Master Mix、DNA Mark.er、4S Green 核酸染料、SanPrep 柱式DNA 膠回收試劑盒，均購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；藥敏紙片由英國OXOID 公司生產(chǎn)；營養(yǎng)瓊脂、營養(yǎng)肉湯，購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.2 儀器 ETC-811 PCR 儀由北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司生產(chǎn)；Universal Hood II 凝膠成像系統(tǒng)由美國伯樂(BIO-RAD)公司生產(chǎn)；HR40-IIB2 生物安全柜由青島海爾特種電器有限公司生產(chǎn)；3-30K 高速冷凍離心機由德國Sigma 公司生產(chǎn)；900 系列超低溫冰箱由美國賽默飛世爾科技有限公司生產(chǎn)。1.3 病料及參考菌株 病變?nèi)庋拷M織由河南牧業(yè)經(jīng)濟學(xué)院臨床獸醫(yī)實驗室收集。參考菌株信息見表1。

1.4 引物 根據(jù)Weisburg[12]介紹的方法合成16SrRNA基因引物，委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，序列如下：16S-F(5′-CCG AATTCG TCG ACA ACA GAG TTT GAT CAT GGC TCAG-3′)、16S-R(5′-CCC GGG ATC CAA GCT TACGGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3′)。

2 方法

2.1 細菌分離培養(yǎng) 無菌方法采集化膿性肉芽組織，直接劃線接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落生長情況。再挑取直徑1～3mm 的單克隆菌落劃線接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h，進行純化。再次挑取單克隆菌落進行革蘭染色鏡檢觀察菌體形態(tài)，同時接種營養(yǎng)肉湯，37 ℃ 180 r/min震蕩培養(yǎng)18 h，4 ℃存放備用。

2.2 菌體DNA制備 水煮法：取1 000 μL菌液于1.5 mL 離心管中，10 000 r/min 離心5 min，棄去上清液，加入600 μL TE 緩沖液(10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，pH 值8.0)重懸沉淀，100 ℃沸水浴10 min，立即冰浴2 min，1 2 000 r/min 離心10 min，上清液即為DNA 溶液，立即使用或-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

2.3 PCR 反應(yīng) 反應(yīng)體系(50 μL)：Tap PCR Mas.ter Mix 25 μL，ddH2O 20 μL，16S-F 2 μL，16S-R 2μL，模板DNA 1 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5min；95 ℃預(yù)變性45 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸2min，30 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。將PCR 產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠在1×TAE 電泳液中電泳，用4SGreen Nucle Acid 染色，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察PCR結(jié)果。

2.4 DNA 測序及序列分析 PCR 產(chǎn)物電泳檢測后，直接提交上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序，將序列進行BLAST 比對。以多殺性巴氏桿菌Kobe6 為外群，將分離株和表1 中其他變形桿菌的16S rRNA 基因序列，利用DNAStar 軟件中的MegAlign 計算種間相似性(Jotun hein 法)。最后利用phylip3.67 進行系統(tǒng)發(fā)育分析，使用1 000個重復(fù)。

表1 菌株序列信息

-：信息不詳

2.5 藥敏試驗 選取11種藥敏紙片，根據(jù)美國臨床和實驗室標(biāo)準協(xié)會(CLSI)抗菌藥物敏感性試驗標(biāo)準(M100-S23)，對分離到的細菌進行藥敏試驗。測量抑菌圈后，根據(jù)抑菌圈的大小判定細菌對藥物的耐藥與敏感情況。

3 結(jié)果

3.1 細菌分離培養(yǎng)結(jié)果 經(jīng)過24 h 培養(yǎng)，在普通瓊脂平板上形成中等大小、圓形微凸起、表面光滑濕潤、灰白色的菌落。在普通肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)18 h 后，呈均勻渾濁，管底可見絮狀沉淀物。細菌涂片染色鏡檢，可見兩端鈍圓，有的近似球桿狀，多數(shù)散在排列的革蘭陰性短桿菌。

3.2 16S rRNA 基因PCR結(jié)果 以分離株基因組DNA 為模板，進行16S rRNA 基因的PCR 擴增，獲得約1 400 bp的電泳條帶(圖1)，與預(yù)期擴增片段大小相符。分離株的序列已經(jīng)提交GenBank，收錄號為KP973965。

圖1 16S rRNA基因PCR產(chǎn)物檢測

B：空白對照； 1：分離菌株； P：陽性對照； M：DL-2 000 DNA Marker

3.3 測序結(jié)果分析 分離菌株16S rRNA 基因序列的BLAST 比對結(jié)果顯示，與分離株親緣關(guān)系最近的3 株參考菌株均為奇異變形桿菌，相似性為100%?；?6S rRNA 基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)顯示，分離株與奇異變形桿菌親緣關(guān)系最近，明顯位于同一分支中；與奇異變形桿菌關(guān)系最近的為彭氏變形桿菌(Proteuspenneri)，位于同一分支內(nèi)，而豪氏變形桿菌(Proteushauseri)和普通變形桿菌(Proteusvulgaris)則位于更高一級的分支；基于16S rRNA 基因序列進行的同源性分析結(jié)果見圖3，由表2 可知，分離菌株與奇異變形桿菌參考株的相似性介于99.4%～100%，彭氏桿菌參考株與奇異變形桿菌的相似性為98.8%～99.3%，分離株與另外兩種變形桿菌的相似性分別為98.5%和98.6%。

圖2 16S rRNA 基因遺傳進化樹

圖3 基于16S rDNA序列的同源性關(guān)系

3.4 藥敏試驗結(jié)果 藥敏試驗結(jié)果見表2，結(jié)果顯示分離菌株對慶大霉素、左氧氟沙星、氨芐西林、阿米卡星、氯霉素和磺胺甲氧嘧啶敏感；對頭孢曲松、頭孢噻肟和四環(huán)素耐藥；對妥布霉素和環(huán)丙沙星中度敏感。

表2 藥敏試驗結(jié)果

S：敏感； I：中介； R：耐藥

4 小結(jié)與討論

根據(jù)細菌分離培養(yǎng)結(jié)果、顯微鏡鏡檢特征，以及16S rRNA 基因序列比對結(jié)果，初步證實分離到的細菌為奇異變形桿菌，命名為PMYU3?；?6S rRNA 基因的序列分析結(jié)果顯示，分離菌株與奇異變形桿菌參考株的相似性介于99.4%～100%，符合判定標(biāo)準，即細菌的16S rRNA基因序列相似性大于99%時，判定為一個種[13]；同時，進化樹結(jié)果表明，分離株與所有奇異變形桿菌參考株位于一個分支。因此可以判定分離菌株屬于奇異變形桿菌。這是國內(nèi)首例在奶牛蜂窩織炎中分離出奇異變形桿菌的報道，應(yīng)引起臨床獸醫(yī)工作者的重視。

因為rRNA 基因保守性極強，進化緩慢，其被認為是細菌的“活化石”，通過該基因的序列分析來對細菌進行分類和鑒定也已得到公眾的認可。相較于傳統(tǒng)的細菌鑒定方法，16S rRNA 基因的序列分析簡單快速，更適合于普通獸醫(yī)實驗室對臨床分離菌株的快速鑒定，尤其是細菌16SrRNA 通用型PCR 引物的使用[6]，極大方便了該基因的體外擴增，值得在普通獸醫(yī)實驗室推廣應(yīng)用。

耐藥性試驗結(jié)果表明，分離的奇異變形桿菌對11 種藥物的3 種產(chǎn)生了耐藥性，這也解釋了奶牛臨床中有些外科感染病例不易控制的原因，提醒獸醫(yī)工作者今后應(yīng)更加重視外科感染病原菌耐藥性的問題，加強獸醫(yī)外科感染致病菌種類的調(diào)查和耐藥性問題的研究。

在當(dāng)代規(guī)?；曫B(yǎng)模式下，奶牛發(fā)生外科感染的幾率更大。規(guī)?；翀鲋幸鹉膛Ｍ饪聘腥镜闹饕∫蛉缦拢侯l繁的防疫注射，針頭消毒不嚴引起感染；飼養(yǎng)管理中的外傷：刮糞板、臥床擋板、固定前擋板的螺絲等對皮膚的損傷；糞道污穢不潔等引起蹄部的感染。因此，蜂窩織炎等外科感染的預(yù)防，首先要加強牛舍衛(wèi)生管理，保持牛體、臥床等的衛(wèi)生干燥；其次，嚴格注射時的無菌操作；再次，對于老化的刮糞板、鋼絲繩要及時更換；最后，對于手術(shù)后的病牛要加強護理。

相較于其他普通外科感染，蜂窩織炎感染發(fā)展迅速、范圍廣泛，具有明顯的全身癥狀。因此，針對該病，在局部治療的同時，應(yīng)注重全身治療，選用敏感的抗菌藥物，嚴重的病牛靜脈輸液增強體質(zhì)及對癥治療。

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2015-03-23

河南省教育廳科技攻關(guān)計劃項目(13B230335)；河南牧業(yè)經(jīng)濟學(xué)院博士科研啟動資金項目(5040610)；河南牧業(yè)經(jīng)濟學(xué)院第五批學(xué)術(shù)帶頭人培養(yǎng)項目

皇甫和平(1977-)，男，講師，博士，主要從事動物疾病發(fā)病機理研究，E-mail：hepinghf@163.com

石冬梅，E-mail：dongmeishi126@126.com

S858.23

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0529-6005(2016)10-0032-03