邢建宏，潘德灼，宋曉敏，陳偉

（1.福建省資源環(huán)境監(jiān)測與可持續(xù)經(jīng)營利用重點實驗室，福建三明365004；2.三明學(xué)院資源與化工學(xué)院，福建三明365004；3.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建福州350002）

短期NaCl脅迫對秋茄根系生理指標的影響

邢建宏1,2,3，潘德灼3，宋曉敏3，陳偉3

（1.福建省資源環(huán)境監(jiān)測與可持續(xù)經(jīng)營利用重點實驗室，福建三明365004；2.三明學(xué)院資源與化工學(xué)院，福建三明365004；3.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建福州350002）

以霍格蘭完全營養(yǎng)液沙培60 d的秋茄幼苗為供試材料，測定了不同濃度NaCl（0，200，400，600 M Mol）處理72 h時根系中超氧陰離子(O2)-合成速率，POD、SOD、CAT、PAL活性以及H2O2、MDA、可溶性糖、可溶性蛋白含量，初步探討了短期NaCl脅迫對秋茄幼苗根系生理活性的影響。結(jié)果表明：在NaCl濃度≤400 M Mol時秋茄根系中O2-合成速率、H2O2和MDA含量與對照相比變化不明顯，而當NaCl濃度達到600 M Mol時，三者明顯上升。SOD和PAL活性隨NaCl濃度的增大而增強，CAT和POD活性隨著NaCl濃度的增加呈先上升后下降趨勢，但處理組均顯著高于對照?？扇苄蕴窍壬吆蠼档?，但處理組均顯著高于對照。可溶性蛋白含量隨NaCl濃度增加而升高。研究結(jié)果證明短期NaCl脅迫下，秋茄根系通過高效的活性氧清除系統(tǒng)和合成大量滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來抵抗鹽脅迫對根系細胞的傷害。

秋茄；短期；NaCl脅迫；生理指標

秋茄（Kandelia candel.）是生長于熱帶海岸潮間帶的木本鹽生植物[1]，有很強的耐鹽能力，深入研究其耐鹽機理有重要理論與實際意義。根系是植物體鹽脅迫中最先受到傷害的器官，研究根系在鹽脅迫下的生理變化對于弄清其耐鹽機理有重要意義。有關(guān)秋茄耐鹽的生理生化研究已有一些報道，所關(guān)注的科學(xué)問題主要為環(huán)境污染[2-4]和水淹脅迫下的生理指標變化[5-6]，有關(guān)鹽脅迫引起秋茄生理變化的研究較少，且主要集中在中長期脅迫下的變化研究[7-8]。植物在分子層面對環(huán)境應(yīng)答一般在處理短期就會產(chǎn)生明顯效果[9]。因此，研究短期脅迫下秋茄根系生理指標的變化可以為今后進一步從分子層面揭示秋茄耐鹽的機理提供前期基礎(chǔ)。本文以秋茄幼苗為供試材料，通過測定短期（72 h）NaCl脅迫下其根系中活性氧、抗氧化酶及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)等生理指標的變化，探討秋茄幼苗根系耐鹽的生理機制，為今后深入的分子生物研究提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

供試秋茄胚軸采自福建省漳州市漳江口紅樹林自然保護區(qū)內(nèi)的秋茄林，生長區(qū)域鹽度為0.8%～2%。挑選大小與成熟度相近、無損傷和病蟲害的胚軸植于塑料盆中，加入霍格蘭完全營養(yǎng)液沙培，3 d更換一次營養(yǎng)液。培養(yǎng)60 d后，用霍格蘭營養(yǎng)液配成含不同濃度的NaCl（0、200、400、600 M Mol）溶液處理秋茄幼苗，72 h后采集根系，蒸餾水洗凈，液氮冷凍后置-80℃冰箱保存，進行各項指標的測定。每個處理選10株以上苗混合取樣，以消除個體差異對結(jié)果的影響。

1.2方法

參考相關(guān)資料進行生理指標測定[10-11]，測定方法如下：羥胺氧化法測定O2-產(chǎn)生速率，四氯化鈦比色法測定H2O2含量，愈創(chuàng)木酚比色法測定過氧化物酶（POD）活性；紫外吸收法測定過氧化氫酶（CAT）活性；硫代巴比妥酸（TBA）法測定MDA含量；氮藍四唑（NBT）法測定超氧化物歧化酶（SOD）活性；考馬斯亮藍（G-250）染色法測定可溶性蛋白含量；蒽酮比色法測定可溶性糖含量；反式肉桂酸比色法測定苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性。每個指標測3次重復(fù)。

1.3數(shù)據(jù)分析與圖表制作

運用Excel 2007進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，SPSS 19.0進行單因素方差分析，用最小顯著差數(shù)法（LSD）進行數(shù)據(jù)的差異性檢驗，采用Graph Pad PrisM5.01軟件作柱狀圖。

2結(jié)果與分析

2.1 NaCl脅迫下秋茄根系O2-產(chǎn)生速率、H2O2及MDA含量的變化

不同濃度NaCl短期脅迫下秋茄根系中O2-產(chǎn)生速率、H2O2與MDA含量的變化如圖1所示。

圖1 NaCl脅迫對秋茄根系O2-產(chǎn)生速率、H2O2和MDA含量的影響（平均值+標準差，n=3）

從圖1可以看出，隨著NaCl脅迫濃度的增大，O2-產(chǎn)生速率、H2O2與MDA含量均呈不同程度的升高。在200 M Mol脅迫下，O2-產(chǎn)生速率和H2O2含量與對照相比略有升高，但沒有達到顯著差異。當NaCl濃度達到400 M Mol時，產(chǎn)生速率比對照高出29.6%，差異達到了顯著水平，而H2O2與MDA含量與對照相比略有升高，但未達到顯著水平。當NaCl濃度增加到600 M Mol時，O2-產(chǎn)生速率、H2O2與MDA含量分別高出對照151.3%、101.3%和85.6%，達到了顯著差異。MDA為活性氧對細胞膜質(zhì)過氧化傷害的最終產(chǎn)物之一，其含量變化可以反映出組織受氧化脅迫的傷害程度。自然環(huán)境中秋茄一般生長在0.8%～2.5%的海水中，對鹽分有一定的適應(yīng)性。本研究結(jié)果表明，中低濃度鹽脅迫下，秋茄根系內(nèi)活性氧維持在較低水平，脂膜受過氧化傷害不明顯。高濃度脅迫下，秋茄根系細胞內(nèi)O2-和H2O2大量積累，脂膜受到過氧化傷害，MDA含量也隨之升高。

2.2 NaCl脅迫下秋茄根系抗氧化酶活性的變化

植物體內(nèi)的抗氧化酶可以清除活性氧，將其維持在一個較低的水平，從而保護鹽脅迫下的植物免受氧化脅迫。為了證明NaCl脅迫下秋茄根系中抗氧酶清除活性氧的能力，我們測定了不同濃度NaCl處理下秋茄根系中SOD、POD、CAT 3種抗氧化酶的活性，結(jié)果如圖2所示。

圖2 NaCl脅迫對秋茄根系3種抗氧化酶活性的影響（平均值+標準差，n=3）

從圖2可以看出，與對照相比不同濃度NaCl脅迫下3種酶活性均有升高，但變化趨勢各異。SOD活性隨NaCl濃度的升高而增強，在400 M Mol和600 M Mol時，其活性分別高于對照37.59%和62.69%，達到顯著差異。POD活性隨NaCl濃度增加先呈升高趨勢，在400 M Mol NaCl濃度下達到最大值，比對照高出172.6%，在600 M Mol NaCl濃度時有所下降，但仍高出對照70.8%。CAT活性在200 M Mol時與對照無明顯差異，在400 M Mol是達到最大值，高于對照189.6%，在600 M Mol時有所降低，但仍與對照有顯著差異，高出對照104.2%。研究結(jié)果表明，3種抗氧化酶在鹽脅迫下活性明顯升高，特別是在中等鹽脅迫下（400 M Mol）維持了細胞內(nèi)活性氧產(chǎn)生和清除的動態(tài)平衡，避免了鹽脅迫引發(fā)的氧化脅迫對細胞的傷害。這可能是秋茄耐鹽的重要原因之一。

2.3 NaCl脅迫下秋茄根系3種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的變化

滲透脅迫是植物遭受鹽脅迫時最先發(fā)生的傷害，植物體常通過積累大量滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，降低細胞滲透式，從而緩解這種傷害。為了分析NaCl脅迫下秋茄根系中滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的變化，我們測定了不同濃度NaCl處理下秋茄根系中的可溶性糖、可溶性蛋白的含量，3種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量變化如圖3所示。

從圖3可以看出，與對照相比，NaCl處理下3中滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)都有不同程度的增加?？扇苄蕴呛侩SNaCl濃度的升高先增加后降低，在400 M Mol時達到最高值，比對照增加了140.8%，在600 M Mol脅迫下，含量比400 M Mol時有所下降，但仍然高于對照110.2%。降低的原因可能是高鹽脅迫影響了光合作用和碳水化合物向根系的運輸。可溶性蛋白含量隨NaCl濃度的增加而升高，200 M Mol下，分別高于對照2.6%和22.6%，400 M Mol下，高于對照52.4%和65.3%，600 M Mol下高于對照118.6%和90.9%。這表明秋茄自身抵抗?jié)B透脅迫的能力較高，這也是秋茄耐鹽脅迫有一個重要原因。

圖3 NaCl脅迫下秋茄根系中2種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量變化（平均值+標準差，n=3）

2.4 NaCl脅迫下秋茄幼苗根系PAL活性變化

苯丙氨酸解氨酶(PAL)是植物體中由初級代謝向次生代謝轉(zhuǎn)變的重要酶與限速酶，PAL通過調(diào)控次生代謝的速率而參與植物對逆境的抵抗。為了證明NaCl脅迫對秋茄根系中PAL活性的影響，分別測定了4種鹽濃度下根系中PAL的活性。結(jié)果如圖4所示。

從圖4可以看出，PAL活性總體上隨鹽濃度的升高而增加。在200 M Mol處理下，秋茄根系中PAL活性與對相比無顯著差異，而當Na-Cl濃度達到400 M Mol時，PAL活性顯著增強，比對照高出了36.9%，當NaCl濃度達到600 M Mol時，與對照相比，PAL活性提高了88.8%。上述結(jié)果表明，鹽脅迫引發(fā)了秋茄根系中PAL活性的增強。這暗示著秋茄可能通過次生代謝調(diào)節(jié)來抵御鹽脅迫的傷害。

圖4 NaCl脅迫下秋茄幼苗根系PAL活性變化（平均值+標準差，n=3）

3結(jié)論與討論

鹽脅迫破壞了植物細胞內(nèi)離子平衡，產(chǎn)生離子毒害，從而引發(fā)活性氧的大量積累，使細胞膜脂、蛋白、核酸等大分子受到傷害，從而產(chǎn)生氧化脅迫。MDA是細胞膜脂過氧化的一個重要產(chǎn)物，可以用來衡量植物在逆境中遭受傷害的程度。為了抵御活性氧對細胞的傷害，維持細胞內(nèi)活性氧產(chǎn)生和消除的動態(tài)平衡，植物自身存在這活性氧清除系統(tǒng)，保護酶在其中起了很大的作用。已有研究證明，鹽生植物在遭受鹽脅迫時，保護酶的活性明顯增強，通過幾種酶之間的協(xié)同作用使體內(nèi)活性氧維持在一個較低水平，從而達到抵御鹽脅迫引發(fā)的氧化脅迫[12]。本研究顯示，在中低鹽濃度NaCl（≤400 M Mol）的短期脅迫下，秋茄根系中3種主要保護酶活性顯著增強，而O2-產(chǎn)生速率和H2O2含量以及MDA含量均與對照無顯著差異，這表明根系中的保護酶體系將組織內(nèi)活性氧產(chǎn)生維持在一個較低的水平，減少了其對細胞膜脂的過氧化傷害，這是秋茄能夠耐鹽脅迫的一個重要機制。

鹽脅迫首先會引起滲透脅迫，阻礙細胞水分吸收。植物為了抵御這種傷害，會主動積累大量可溶性物質(zhì)，以降低細胞滲透式，從而保證鹽脅迫下水分的正常供應(yīng)。本研究顯示，秋茄根系在短期NaCl脅迫下可溶性糖、可溶性蛋白含量顯著增加，表明秋茄根系通過合成大量滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來抵抗鹽脅迫對根系細胞的傷害。這與前人在同為耐鹽植物的星星草[13]和鹽芥[14]等植物中的報道一致。

已有研究證明，次生代謝途徑產(chǎn)生的一些小分子物質(zhì)可以維持細胞膨壓，降低由鹽脅迫引起的細胞滲透脅迫，在植物耐鹽中發(fā)揮重要的作用[15]。PAL是植物中次生代謝上游的重要酶，與次生代謝物的合成有重要關(guān)系。本研究結(jié)果顯示，秋茄根系在中高度NaCl（≥400 M Mol）脅迫下，PAL活性顯著升高，這與前人在銀杏[16]中的研究結(jié)論一致。秋茄中PAL活性的增高，最終引起了哪些次生代謝途徑的變化，從而增強了其耐鹽能力，還需要進一步研究。

綜上所述，在短期NaCl脅迫下，秋茄根系產(chǎn)生了明顯的生理響應(yīng)，表現(xiàn)為保護酶活性和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量顯著增加，與次生代謝相關(guān)的PAL活性明顯升高，從而使根系組織免受鹽脅迫引起的氧化脅迫和滲透脅迫的傷害。本研究僅從生理層面證明了秋茄根系在短期脅迫下的變化特征，但是這些變化在分子水平上是如何產(chǎn)生的，相互之間又存在著怎樣的調(diào)控關(guān)系還需要通過現(xiàn)代分子生物學(xué)手段從基因轉(zhuǎn)錄與翻譯層面進行深入揭示。

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（責(zé)任編輯：朱聯(lián)九）

Effects of Short-terMNaCl Stress on Physiological Indices of Kandelia candel.Roots

XING Jian-hong1,2,3,PAN De-zhuo3,SONG Xiao-min3,CHENWei3

(1.Fujian Provincial Key Laboratory of Resources and Environment Monitoring&Sustainable Management and Utilization, Sanming 365004,China, 2.School of Resources and Chemical Engineering,Sanming University,Sanming 365004,China; 3.School of Life Sciences,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou 350002,China)

In this experiment,the Kandelia candel.seedlingswhich were sand cultured 60 days irrigated with Hoagland solutionwereused asmaterial,the produce-rate,POD,SOD,CAT and PAL activity,H2O2,soluble sugar,soluble protein,and MDA contentof rootswas beenmeasured treated by four NaCl concentrations(0,200,400,600M Mol),and the effects of short-terMNaCl stress on physiological indices of Kandelia candel.rootswas discussed preliMinary.The results showed that the produce-rate,H2O2and MDA contentwas notobvious changes compared with controlunder NaCl treatmentsat concentrations≤400M Mol.When the concentration of NaCl up to 600M Mol,those three indices raised obviously.With increased in NaCl concentrations,the activitiesof SOD and PAL enhanced,and the activitiesof CAT and POD initially increased but then decreased,butall treatmentswere significantly higher than control.The soluble sugar increased but then decreased,butstress groupswere significantly higher than control,and the soluble protein content increased with the increase of NaCl concentration.This research reveals that the Kandelia candel.roots can resistance to saltstresson root cell damage through efficientactive oxygen removalsysteMand synthesisofosmotic regulation substancesduring short-terMNaCl stress.

Kandelia candel.;short-term;NaCl stress;physiological indices

Q 945.78

A

1673-4343（2016）06-0016-05

10．14098／j．cn35－1288／z．2016．06．003

2016-08-17

福建省科技廳自然科學(xué)基金面上項目（2014J01137）；福建省教育廳中青年教師教育科研項目（JA13296）

邢建宏，男，陜西寶雞人，副教授。主要研究方向：植物生理與分子生物學(xué)。通訊作者：陳偉，男，福建福州人，教授。主要研究方向：植物蛋白質(zhì)組學(xué)。