徐剛　薛義軍▲　鄒曉峰　李龍濱　袁源湖　肖日?！∴u毓華

1.贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院泌尿外科，江西贛州341000；2.江西省贛州市南康區(qū)第一人民醫(yī)院泌尿外科，江西贛州341400

調(diào)控CD147基因表達(dá)的Micro RNA分子鑒定及其抗膀胱癌轉(zhuǎn)移研究

徐剛1薛義軍1▲鄒曉峰1李龍濱2袁源湖1肖日海1鄒毓華1

1.贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院泌尿外科，江西贛州341000；2.江西省贛州市南康區(qū)第一人民醫(yī)院泌尿外科，江西贛州341400

目的探討調(diào)控CD147基因表達(dá)的MicroRNA對(duì)膀胱癌的增殖、遷移和浸潤的關(guān)聯(lián)性。方法選取自2015年1月～2016年5月在我院接受治療的膀胱癌患者50例，分別取膀胱癌組織以及癌旁組織采用免疫組化進(jìn)行CD147陽性檢測(cè)，構(gòu)建CD147 siRNA重組腺病毒（Ad-CD147 siRNA）載體轉(zhuǎn)染膀胱癌細(xì)胞，將CD147陽性表達(dá)的膀胱癌組織隨機(jī)分為Ad-CD147 siRNA轉(zhuǎn)染的干擾組，腺病毒顆粒轉(zhuǎn)染的陰性對(duì)照以及未加處理的對(duì)照組，采用MTT檢測(cè)腫瘤細(xì)胞增殖能力、采用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞遷移能力、采用明膠酶譜實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MMP-2和MMP-9含量、采用Transwell小室法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞浸潤能力。結(jié)果CD147在膀胱癌組中陽性率90.00%（45/50）顯著高于癌旁組織12.00%（6/50），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。不同性別和不同年齡間CD147陽性表達(dá)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；而不同的TNM分期及腫瘤細(xì)胞分化程度與CD147陽性表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）?？瞻捉M及對(duì)照組的膀胱癌細(xì)胞遷移距離、侵入基底膠數(shù)量、MMP-2以及MMP-9含量明顯高于干擾組，體外膀胱癌細(xì)胞在490 nm處吸收值顯著低于干擾組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論CD147基因所表達(dá)的MicroRNA能夠通過促進(jìn)MMP-2和MMP-9的分泌而加速膀胱癌組織的血供形成，加速增殖、遷移以及浸潤。

CD147基因；微小RNA；小RNA；腫瘤轉(zhuǎn)移；膀胱癌

膀胱癌是較為常見的發(fā)生于泌尿系統(tǒng)的死亡率較高的惡性腫瘤[1]，由于人們的生活方式改變以及工作壓力的升高，使膀胱癌發(fā)病率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，再加上其較高的病死率，使該病逐漸受到重視。雖然其能夠通過相應(yīng)檢查手段早期發(fā)現(xiàn)并手術(shù)治療，但仍然無法取得理想的治療效果。膀胱癌患者最主要的死亡原因是腫瘤發(fā)生遷移和浸潤，因此有效地控制膀胱癌細(xì)胞遷移和浸潤是延長患者壽命的關(guān)鍵。細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子[2-3]（extracellular metalloproteinase inducer，EMMPRIN/CD147）是廣泛存在于腫瘤細(xì)胞表面的一種單向跨膜糖蛋白，與腫瘤的遷移和浸潤有著密切的聯(lián)系。近年來，參與腫瘤遷移和浸潤密切相關(guān)的因子MMP-2與MMP-9受到廣泛的研究，且有人猜測(cè)其與CD147基因所分泌的MicroRNA有一定聯(lián)系。因此本文旨在探討調(diào)控CD147基因表達(dá)的MicroRNA對(duì)膀胱癌的增殖、遷移和浸潤的關(guān)聯(lián)性?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料

選取2015年1月～2016年5月來我院接受治療的膀胱癌患者50例，其中男34例，女16例，年齡23～62歲，平均（49.8±8.5）歲，所有患者均初次患病，且為原發(fā)，無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，所有患者均經(jīng)過病理活檢，并由2名以上病理醫(yī)師評(píng)定結(jié)果，取50例患者膀胱癌組織以及癌旁組織制成組織芯片待檢，將其按照原發(fā)灶淋巴結(jié)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（Tumor Node Metastasis，TNM）分期分為T1（13例）、T3（17例）和T4期（20例）。低分化21例，中分化18例，高分化11例。將CD147陽性表達(dá)的膀胱癌組織隨機(jī)分為Ad-CD147 siRNA轉(zhuǎn)染的干擾組、腺病毒顆粒轉(zhuǎn)染的陰性對(duì)照以及未加處理的對(duì)照組各15例。

1.2方法

1.2.1采用免疫組化檢測(cè)CD147陽性表達(dá)通過標(biāo)本收集與儲(chǔ)存，抗原修復(fù)后進(jìn)行免疫組化，現(xiàn)用現(xiàn)配3%透明膠質(zhì)酸（haluronic acid，HA），密封20 min，蒸餾水PBS洗，山羊血清密封1 h，繼續(xù)用PBS緩沖液進(jìn)行三次洗滌，滴加由上海拜力生物科技有限公司生產(chǎn)的即用型快捷免疫組化MaxVision試劑，濕盒中室溫靜置，對(duì)待測(cè)樣品通過石蠟做包埋，將樣品與石蠟結(jié)合待凝固后應(yīng)用石蠟切片機(jī)將待測(cè)組織切成4μm厚度芯片，將組織芯片置于65℃恒溫中5 h待測(cè)。

1.2.2采用MTT法檢測(cè)增殖能力吸取膀胱腫瘤細(xì)胞于培養(yǎng)基中，先后加入磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS），0.25%的胰蛋白酶溶解液，顯微鏡觀察合格后加入10%胎牛血清制成細(xì)胞懸液，滴入載玻片上進(jìn)行計(jì)數(shù)，分析三組細(xì)胞的增殖情況。

1.2.3劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)膀胱癌細(xì)胞遷移能力首先進(jìn)行癌細(xì)胞培養(yǎng)，隨后采用PBS進(jìn)行沖洗，加入1 mL EDTA消化，脫壁后終止消化，制成細(xì)胞懸液800 r/min，5 min離心，過夜培養(yǎng)后，觀察細(xì)胞貼壁情況，根據(jù)不同分組向其中加入不同干擾物培養(yǎng)48 h，采用移液槍槍頭進(jìn)行劃痕實(shí)驗(yàn)，觀察腫瘤細(xì)胞遷移情況。

1.2.4明膠酶譜法觀察MMP-2和MMP-9含量配置分離膠和濃縮液，采用移液槍加液后，進(jìn)行電泳，110 V電泳至溴酚藍(lán)指示劑前到達(dá)分離膠前端左右時(shí)停止電泳，觀察跑膠條帶的寬度、面積以及灰度值。

1.2.5Transwell腫瘤細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)制作底膠后，在每個(gè)小室內(nèi)加入趨化劑，小心將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞懸液加入小室內(nèi)，觀察侵襲情況。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

對(duì)本次研究對(duì)象所得的數(shù)據(jù)聘請(qǐng)專業(yè)的衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)學(xué)人員應(yīng)用軟件SPSS13.0進(jìn)行相關(guān)的處理與分析，對(duì)數(shù)值變量資料間的樣本均數(shù)比較一般采用t檢驗(yàn)，用（±s）表示，對(duì)多組分類變量的率的比較一般采用卡方檢驗(yàn)，如若P＜0.05，則說明兩變量之間或多變量間差異顯而易見。如若進(jìn)行SNK-q檢驗(yàn)。對(duì)兩個(gè)變量間的相關(guān)性進(jìn)行研究時(shí)，可先進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，若結(jié)果滿足正態(tài)，可對(duì)其先進(jìn)行χ2檢驗(yàn)判斷兩變量間是否相關(guān)獨(dú)立，如若P＜0.05則說明兩變量間相關(guān)聯(lián)。

2　結(jié)果

2.1CD147在不同組織中的表達(dá)情況

CD147在膀胱癌組織中的陽性率[90.00%（45/50）]顯著高于癌旁組織[12.00%（6/50）]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1　CD147在不同組織中的表達(dá)情況[n（%）]

2.2CD147在膀胱癌組織不同病理特征中的陽性表達(dá)情況

不同性別和不同年齡間CD147陽性表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；而不同的TNM分期以及腫瘤細(xì)胞分化程度的CD147陽性表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

2.3CD147 siRNA對(duì)膀胱腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲以及增殖能力的影響

空白組以及對(duì)照組的膀胱癌細(xì)胞遷移距離、侵入基底膠數(shù)量、MMP-2以及MMP-9含量明顯高于干擾組，體外膀胱癌細(xì)胞在490 nm處吸收值顯著低于干擾組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示CD147與膀胱癌細(xì)胞遷移，侵入及增殖有一定聯(lián)系。見表3。

表2　CD147在膀胱癌組織不同病理特征中的陽性表達(dá)情況[n（%）]

3　討論

CD147是一種存在于腫瘤細(xì)胞表面的基質(zhì)蛋白酶誘導(dǎo)因子[4-6]，屬于單次跨膜糖蛋白，屬于免疫球蛋白超家族。有研究顯示[7-10]，該因子多表達(dá)于腫瘤組織以及炎癥反應(yīng)組織中，同時(shí)在精子分化過程中也有參與。膀胱癌是泌尿系統(tǒng)內(nèi)常見的惡性腫瘤之一，其具有較高的遷移和浸潤能力，是導(dǎo)致患者死亡的主要原因。因此了解膀胱癌遷移和浸潤的機(jī)制有助于膀胱癌的治療和控制，但膀胱癌的遷移和轉(zhuǎn)移是個(gè)復(fù)雜的反應(yīng)過程。有研究報(bào)道[11-13]，CD147能夠在一定程度上協(xié)助癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，在CD147協(xié)助轉(zhuǎn)移途徑中，MMP-2以及MMP-9起決定性作用。

RNA干擾現(xiàn)象[14]（RNA interfering，RNAi）是指通過干擾性小RNA（siRNA）特異性地降解目標(biāo)RNA，使其沉默不表達(dá)，是近年來常用的研究基因功能的方法。因此，本文旨在通過siRNA探討調(diào)控CD147基因表達(dá)的MicroRNA分子鑒定及其抗膀胱癌轉(zhuǎn)移作用。

本次研究結(jié)果顯示，CD147在膀胱癌組中陽性率（90.00%）顯著高于癌旁組織（12.00%），說明CD147對(duì)于腫瘤組織具有一定特異性；結(jié)果顯示而不同的TNM分期以及腫瘤細(xì)胞分化程度與CD147陽性表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），進(jìn)一步說明CD147與腫瘤組織的增殖分化具有一定聯(lián)系。2010年，陳清標(biāo)等[15]研究了CD147在膀胱癌組織中表達(dá)的情況發(fā)現(xiàn)，膀胱癌組織中CD147表達(dá)率為70.7%，顯著高于正常膀胱組織以及癌旁組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與本研究結(jié)果基本一致?？瞻捉M以及對(duì)照組的膀胱癌細(xì)胞遷移距離、侵入基底膠數(shù)量、MMP-2以及MMP-9含量明顯高于干擾組，體外膀胱癌細(xì)胞在490 nm處吸收值顯著低于干擾組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示CD147與膀胱癌細(xì)胞遷移、侵入以及增殖有一定聯(lián)系，可能是由于MMP-2和MMP-9在發(fā)生遷移和浸潤的腫瘤細(xì)胞中呈高度表達(dá)，且二者高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞遷移率高達(dá)92.3%，MMP-2具有降解基底膜屏障、促進(jìn)血管內(nèi)皮因子（VEGF）的生成、加速腫瘤內(nèi)新生血管形成，為腫瘤增殖、遷移以及浸潤提供可能；MMP-9是腫瘤血管再生的開關(guān)，其能夠啟動(dòng)血管生成，因此CD147通過作用于MMP-2和MMP-9，從而為腫瘤增殖、侵入以及遷移提供條件。

綜上所述，CD147是腫瘤組織中特異表達(dá)因子，能夠?yàn)槟[瘤的增殖、遷移以及侵入提供條件，為膀胱癌的轉(zhuǎn)移以及浸潤的控制以及治療提供新的思路和方法。

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表3　CD147 siRNA對(duì)膀胱腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲以及增殖能力的影響（±s）

表3　CD147 siRNA對(duì)膀胱腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲以及增殖能力的影響（±s）

注：*與干擾組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）

組別n干擾組對(duì)照組空白組F值P遷移距離（mm）侵入基底膠數(shù)量（個(gè)）490 nm處吸收值MMP-2（μg/mL）MMP-9（μg/mL）15 15 15 0.82±0.01 1.62±0.04*1.88±0.04*245.77＜0.05 80.24±8.54 211.58±9.63*259.34±10.27*576.36＜0.05 0.58±0.14 0.48±0.11*0.30±0.08*12.25＜0.05 0.41±0.03 0.83±0.06*0.87±0.06*40.23＜0.05 0.17±0.02 0.81±0.05 0.82±0.06 90.55＜0.05

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Study on the identification of MicroRNA molecule in regulating CD147 gene expression and its anti-bladder cancer metastasis

XU Gang1XUE Yijun1ZOU Xiaofeng1LI Longbin2YUAN Yuanhu1XIAO Rihai1ZOU Yuhua1
1.Department of Urology,the First Affiliated Hospital of Gannan Medical University,Ganzhou 341000,China；2.Department of Urology,the First People's Hospital of Nankang District of Ganzhou City in Jiangxi Province,Ganzhou 341400,China

Objective To investigate the correlation of MicroRNA that regulates the expression of CD147 gene with the proliferation,migration and infiltration of bladder cancer.Methods A total of 50 patients with bladder cancer who were treated in our hospital from January,2015 to May,2016 were selected,and immunohistochemistry was used to detect the positive expression of CD147 in bladder cancer tissues and adjacent tissues,and vector-transfected bladder cancer cells of CD147 siRNA recombinant adenovirus(Ad-CD147 siRNA)were constructed.CD147 positive bladder cancer tissues were randomly divided into interference group transfected with Ad-CD147 siRNA,negative control group transfected by adenovirus particles,and untreated control group.MTT was used to detect the proliferation of tumor cells,the migration ability of tumor cells was detected by scratch test,the contents of MMP-2 and MMP-9 were detected by gelatin zymography,and tumor cell infiltration ability was measured by Transwell chamber method.Results The positive rate of CD147 in bladder cancer group was 90.00%(45/50),which was significantly higher than that in para-cancerous tissue(12.00%,6/50).The difference was statistically significant(P＜0.05).There was no significant difference of CD147 expression between different genders and ages(P＞0.05).The expression of CD147 was significantly different between T stage and tumor cell differentiation(P＜0.05).The migration distance,invasion matrix quantity,MMP-2 and MMP-9 of bladder cancer cells in blank group and control group were significantly higher than those in the interference group, and the absorbance of bladder cancer cells at 490 nm was significantly lower than that in the interference group,the differences were statistically significant(P＜0.05).Conclusion MicroRNA expressed by CD147 gene can accelerate the formation of blood supply,accelerate proliferation,migration and infiltration of bladder cancer by promoting the secretion of MMP-2 and MMP-9.

CD147 gene；MicroRNA；Small RNA；Tumor metastasis；Bladder cancer

R737

A

1673-9701（2016）29-0001-03

江西省贛州市指導(dǎo)性科技計(jì)劃項(xiàng)目▲

（2016-08-09）