李顯文 鐘朝暉 付春花 陸新升 張斌 羅錦斌 曾燦

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·短篇論著·

BLCAP基因干擾表達(dá)載體的構(gòu)建及對膀胱癌細(xì)胞系T24增殖的影響

李顯文 鐘朝暉 付春花 陸新升 張斌 羅錦斌 曾燦

有研究發(fā)現(xiàn)抑癌基因BLCAP基因特異性表達(dá)于肌層非浸潤性膀胱癌病灶中，而在浸潤性膀胱癌中該基因表達(dá)下降[1-2]。本研究在成功構(gòu)建膀胱癌相關(guān)性抑癌基因BLCAP基因干擾表達(dá)載體的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究BLCAP基因干預(yù)對膀胱癌細(xì)胞系T24增殖的影響。報(bào)告如下。

材料與方法

一、材料與試劑

血/細(xì)胞DNA抽提和質(zhì)粒預(yù)提純試劑盒(湖南艾佳生物科技股份有限公司)，pcDNA3.1載體(美國Ambion)，T4DNA連接酶(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)，限制性內(nèi)切酶和10×Tango緩沖液(立陶宛Fermentas)，Lipo2000(美國Invitrogen)，MTT(上海生物工程有限公司)，T24細(xì)胞株(中科院上海細(xì)胞庫)，引物合成及陽性克隆測序由華大基因科技有限公司完成。

二、干擾載體的線性化

1.質(zhì)粒載體：選擇pcDNA3.1質(zhì)粒為BLCAP基因載體。

2.引物設(shè)計(jì)：h-BLCAP-F：5′CCC AAGCTT ATGTATTGCCTCCAGTG 3′(Hind III)；h-BLCAP-R：5′CCG GAATTC TTAGGTGCCCACAA 3′(EcoR I)。

3.目的基因PCR擴(kuò)增：反應(yīng)體系每管100 μl，含2×HS液 50 μl、上游引物(10 μmol/L)5 μl、下游引物(10 μmol/L)5 μl、DNA模板5 μl、ddH2O 35 μl。吹吸混勻，離心15 s。PCR程序設(shè)置：95 ℃變性5 min后進(jìn)入PCR循環(huán)。95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30個循環(huán)，再行72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，確定其與目的片段大小一致后，切取并回收。

4.酶切：①質(zhì)粒酶切反應(yīng)體系：pcDNA3.1(0.5 μg/μl)4 μl，10×Tango緩沖液5 μl，EcoR I(10 U/μl)2 μl，Hind III(10 U/μl)2 μl，H2O補(bǔ)至50 μl。將上述混合的反應(yīng)物置于37 ℃，孵育4 h。② PCR產(chǎn)物反應(yīng)體系：PCR產(chǎn)物37 μl，10×Tango緩沖液5 μl，EcoR I(10 U/μl)1 μl，Hind III(10 U/μl)1 μl，H2O補(bǔ)至50 μl。將上述混合的反應(yīng)物置于37 ℃，過夜孵育。

5.回收純化及連接：條帶單一的PCR產(chǎn)物可直接進(jìn)行回收(使用循環(huán)純化試劑盒，美國OMEGA)。連接操作時將所需試劑置于冰上，按試劑盒說明書進(jìn)行(過程略)。

6.連接后產(chǎn)物轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)及提取菌液行PCR檢測：連接后產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α后挑取單克隆，隨后進(jìn)行菌液PCR鑒定(過程略)。如載體成功重組，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物行凝膠電泳時可見264 bp的單一條帶。

將PCR條帶與目的產(chǎn)物大小一致的克隆送華大基因公司測序，通過測序峰圖進(jìn)行核對，證實(shí)插入片段為BLCAP片段，且無堿基突變，說明pcDNA3.1-BLCAP過表達(dá)載體構(gòu)建成功。選取測序結(jié)果正確的克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒。

三、RT-PCR法檢測T24細(xì)胞在重組載體轉(zhuǎn)染前后BLCAP基因的表達(dá)情況

實(shí)驗(yàn)分為3組：重組載體組(pcDNA3.1-BLCAP)、空載體組(pcDNA3.1-NC)及空白對照組(Con，無質(zhì)粒)，每組3個樣本。RT-PCR法檢測：檢測體系每管20 μl，設(shè)定程序?yàn)閮刹椒≧eal-Time定量，預(yù)變性95 ℃，3 min，之后每一步變性95 ℃，10 s，BLCAP、β-actin、U6引物60 ℃退火延伸30 s，共進(jìn)行40個循環(huán)，每次在延伸階段讀取熒光值。利用熒光信號的變化實(shí)時檢測PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對起始模板進(jìn)行定量分析(過程略)。

四、MTT檢測BLCAP對膀胱癌細(xì)胞系T24增殖能力的影響

分別將pcDNA3.1-NC、pcDNA3.1-BLCAP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染膀胱癌細(xì)胞株(T24)后，通過MTT法檢測其對細(xì)胞增殖能力的影響。因在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)呈正比，所以可根據(jù)測得的吸光度值(即OD值)，來判斷活細(xì)胞數(shù)量，OD值越大，細(xì)胞活性越強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)分為3組：重組載體組(pcDNA3.1-BLCAP)、空載體組(pcDNA3.1-NC)及空白對照組(Con)，每組5個樣本，選擇轉(zhuǎn)染后0、24、48和72 h為檢測節(jié)點(diǎn)，過程略。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本研究結(jié)果為3組計(jì)量資料樣本，且需行組間兩兩比較，故統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用單因素多個樣本均數(shù)比較(成組設(shè)計(jì))，在樣本均數(shù)方差齊性分析的基礎(chǔ)上，組間兩兩比較，需行q檢驗(yàn)(Newman-Keuls法)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、RT-PCR法檢測T24細(xì)胞在重組載體轉(zhuǎn)染前后BLCAP基因的表達(dá)情況

重組載體組BLCAP基因含量為3.072 5，明顯高于空載體組及空白對照組(分別為1.159 7和1.015 0)，表明BLCAP重組載體成功構(gòu)建。

二、MTT檢測BLCAP對膀胱癌細(xì)胞系T24增殖能力的影響

檢測結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染24 h后至72 h重組載體組細(xì)胞增殖明顯低于空白對照組和空載體組(P<0.01)，空白對照組和空載體組轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞增殖無明顯差異(P>0.05)。見圖1、表1。

圖1 T24各組細(xì)胞MTT結(jié)果(OD值)

表1 T24各組細(xì)胞OD值均數(shù)兩兩比較的q檢驗(yàn)(Newman-Keuls法)

討 論

業(yè)已明確腫瘤或者癌癥發(fā)生和演進(jìn)的主要原因和機(jī)制源于癌基因的激活、抑癌基因的失活和腫瘤細(xì)胞的抗凋亡活性增高。研究表明，膀胱癌發(fā)生時通常伴發(fā)有多種抑癌基因的失活(如廣為人知的p53基因、Rb基因)，其中也包括本研究涉及的抑癌基因BLCAP。

2002年報(bào)道發(fā)現(xiàn)，BLCAP基因特異性表達(dá)于肌層非浸潤性膀胱癌病灶中，而在浸潤性膀胱癌中該基因表達(dá)下降[1-2]。2009年Moreira等[3]通過大樣本的研究，進(jìn)一步證實(shí)了膀胱癌的進(jìn)展與BLCAP基因的表達(dá)缺失有關(guān)，認(rèn)為BLCAP基因是膀胱癌的一個潛在的預(yù)后標(biāo)志物。Baffa等[4]較詳細(xì)論述了BLCAP在膀胱癌診斷和治療目標(biāo)中的分子遺傳學(xué)機(jī)制。相比國外研究情況而言，膀胱癌與BLCAP基因的相關(guān)性研究在國內(nèi)尚未見有報(bào)道。對其進(jìn)行更深入的研究，對闡明膀胱癌的發(fā)生和演進(jìn)機(jī)制，開拓膀胱癌基因治療的新靶點(diǎn)等都有重要的意義。

本研究中我們運(yùn)用分子和細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)，成功構(gòu)建了BLCAP基因質(zhì)粒重組載體--pcDNA3.1-BLCAP。隨后的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，人膀胱癌細(xì)胞T24轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-BLCAP后24 h，MTT檢測該組樣本的OD值均數(shù)為0.622，顯著低于空白對照組(0.741)的和空載體組(0.724)(P<0.01)，而空白對照組和空載體組間OD值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；轉(zhuǎn)染后48 h和72 h，重組載體組的OD值均數(shù)分別為0.837和1.031，亦顯著低于空白對照組(1.038、1.228)和空載體組(1.010、1.191)(P<0.01)，空白對照組和空載體組間OD值差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究初步表明，人膀胱癌T24細(xì)胞在成功轉(zhuǎn)染BLCAP基因后癌細(xì)胞的增殖速度明顯減慢，BLCAP基因在膀胱癌中具有抗腫瘤效應(yīng)，因此以BLCAP基因?yàn)榘悬c(diǎn)的基因治療是初步可行的，BLCAP基因有望成為膀胱癌基因治療的新靶點(diǎn)。

[1] Ratliff TL.bc10: a novel human bladder cancer-associated protein with a conserved genomic structuredownregulated in invasive cancer[J].J Urol,2002,168(2):884-885.

[2] Gromova I, Gromov P, Celis JE.bc10: A novel human bladder cancer-associated protein with a conserved genomic structure downregulated in invasive cancer[J].Int J Cancer,2002,98(4):539-546.

[3] Moreira JM, Ohlsson G, Gromov P, et al.Bladder cancer-associated protein, a potential prognostic biomarker in human bladder cancer[J].Mol Cell Proteomics,2010,9(1):161-177.

[4] Baffa R, Letko J, McClung C, et al.Molecular genetics of bladder cancer: targets for diagnosis and therapy[J].J Exp Clin Cancer Res,2006,25(2):145-160.

(本文編輯：熊鈺芬)

2013深圳市南山區(qū)科技計(jì)劃項(xiàng)目(醫(yī)療衛(wèi)生類)(2013044)

518000 深圳市蛇口人民醫(yī)院泌尿外科(李顯文、陸新升、張斌、羅錦斌、曾燦)；中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院泌尿外科(鐘朝暉)；北京大學(xué)深圳醫(yī)院ICU(付春花)

李顯文，E-mail:xianwen_li@sina.com

10.3870/j.issn.1674-4624.2016.04.011

2016-06-06)