呂磊，郭華，張潔，徐軍

(南京軍區(qū)南京總醫(yī)院 干部心內(nèi)科，江蘇 南京 210002)

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·論 著·

糖原合酶激酶- 3β在川芎嗪對(duì)心肌缺血再灌注損傷保護(hù)中的作用

呂磊，郭華，張潔，徐軍

(南京軍區(qū)南京總醫(yī)院 干部心內(nèi)科，江蘇 南京 210002)

目的:探討川芎嗪對(duì)在體大鼠缺血再灌注(IR)損傷心肌的影響以及糖原合酶激酶- 3β(GSK- 3β)在其中的作用。方法:40只雄性SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、IR對(duì)照組、川芎嗪組、川芎嗪+渥曼青霉素組以及渥曼青霉素組，每組8只。假手術(shù)組冠狀動(dòng)脈左前降支不結(jié)扎，余各組均結(jié)扎左前降支，松結(jié)后直接再灌注。再灌注末，測(cè)定血漿心肌酶水平及缺血心肌組織腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)含量，采用電子顯微鏡觀察缺血心肌超微結(jié)構(gòu)變化，蛋白質(zhì)印跡法測(cè)定缺血心肌組織磷酸化Akt(p- Akt)和磷酸化GSK- 3β(p- GSK- 3β)的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果:IR對(duì)照組血漿心肌酶升高，缺血心肌組織ATP含量減少，線粒體損傷。川芎嗪組心肌酶釋放減少，ATP含量增加，心肌細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)損傷明顯減輕，p- Akt和p- GSK- 3β水平顯著增高。渥曼青霉素減弱了川芎嗪對(duì)IR心肌的保護(hù)作用并抑制了川芎嗪所致的p- Akt和p- GSK- 3β蛋白水平的增加。 結(jié)論:川芎嗪預(yù)處理能減少在體大鼠心肌IR所致心肌酶釋放和ATP下降，減輕線粒體損傷，PI3K/Akt- GSK- 3β信號(hào)通路參與介導(dǎo)該保護(hù)作用。

川芎嗪； 缺血再灌注； 糖原合酶激酶- 3β； 線粒體； 大鼠

如何減輕心肌缺血再灌注(ischemia reperfusion，IR)損傷一直是冠心病治療中關(guān)注的問題[1]。糖原合成酶激酶- 3β(glycogen synthase kinase- 3β，GSK- 3β)是調(diào)節(jié)糖原代謝的關(guān)鍵酶，近年研究發(fā)現(xiàn)，GSK- 3β與心肌IR損傷密切相關(guān)，是許多心肌保護(hù)措施發(fā)揮保護(hù)作用的最終共同機(jī)制[2]。川芎嗪(tetramethylpyrazine，TMP)是中藥川芎的有效單體成分，動(dòng)物模型研究提示TMP有抗氧化，減少心、腎、腦IR損傷的作用[3- 5]，但其減少心肌IR損傷的確切機(jī)制尚不明確。本研究旨在觀察TMP對(duì)在體大鼠IR損傷心肌的超微結(jié)構(gòu)、血清酶和腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)含量的影響，初步探討GSK- 3β在其中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)分組

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用健康雄性SD大鼠(南京軍區(qū)南京總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)共40只，體重260～300g，隨機(jī)分成5組，每組8只。(1) 假手術(shù)組(Sham組)：開胸僅穿線不結(jié)扎前降支。(2) 缺血再灌注對(duì)照組(IR對(duì)照組)：開胸結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支，缺血35min，松結(jié)后恢復(fù)再灌注120min。(3) TMP組：缺血前5min靜脈注射TMP(中國(guó)藥品生物制品檢定所)10 mg·kg-1，余同IR對(duì)照組。(4) TMP+渥曼青霉素組(TMP+Wort組)：缺血前5min靜脈注射TMP 10 mg·kg-1，再灌前15min靜脈注射磷脂酰肌醇- 3- 激酶(phosphatidylinositol 3- kinase，PI3K)抑制劑渥曼青霉素(美國(guó)Sigma- Aldrich公司)15μg·kg-1，余同IR對(duì)照組。(5) 渥曼青霉素組(Wort組)：再灌注前15min靜脈給予渥曼青霉素15μg·kg-1，余同IR對(duì)照組。

1.2 在體大鼠IR模型制備和標(biāo)本采集

SD大鼠稱重后10%水合氯醛腹腔注射麻醉，取仰臥位固定，氣管切開后接小動(dòng)物呼吸機(jī)(TKR200C型，江西特立麻醉呼吸設(shè)備公司)，持續(xù)監(jiān)測(cè)Ⅱ?qū)?lián)心電圖。開胸依次剪開縱隔胸膜和心包膜，左心耳根部下方進(jìn)針，5- 0無損傷縫線貫穿左前降支并結(jié)扎，以心電圖QRS波增寬和J點(diǎn)上抬以及左室前壁紫紺為結(jié)扎成功標(biāo)志。35min后剪斷結(jié)扎線，心肌再灌注120min。再灌注末抽取大鼠右房血2ml，室溫下3000r·min-1離心5min，生化分析儀(7600型，日本日立公司)檢測(cè)肌酸磷酸激酶同工酶(CK- MB)和乳酸脫氫酶(LDH)水平。左心室缺血心肌組織保存于-80℃冰箱。

1.3 心肌組織超微結(jié)構(gòu)觀察

再灌注末心臟快速放血處死大鼠，取出心臟生理鹽水沖洗，每組隨機(jī)取材1～2份，留取左室缺血中心區(qū)同一部位行電鏡檢測(cè)。切取1mm3心肌組織，戊二醛固定液中低溫固定，1%鋨酸固定后脫水，環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片并電子染色，透射電子顯微鏡(JEM- 1011，日本JEOL公司)進(jìn)行心肌超微結(jié)構(gòu)觀察并拍照。

1.4 ATP含量的測(cè)定

嚴(yán)格按ATP試劑盒(南京建成生物工程公司)說明書操作步驟進(jìn)行，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白含量，計(jì)算每g蛋白中的ATP含量。

1.5 蛋白質(zhì)印跡法測(cè)定心肌組織中p- Akt、Akt、p- GSK- 3β和GSK- 3β含量

大鼠心肌組織勻漿，裂解液(含蛋白酶和磷酸酶抑制劑，美國(guó)Thermo Scientific公司)冰上裂解，提取缺血心肌組織總蛋白，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白濃度。心肌組織蛋白煮沸后聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，電轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜，室溫下2%脫脂奶粉緩沖液封閉，加入相應(yīng)一抗(p- Akt、Akt、p- GSK- 3β和GSK- 3β)(美國(guó)Cell Signaling Technology公司)封閉，4℃過夜。辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗(1∶5 000稀釋)封閉液室溫孵育2h，洗滌緩沖液洗膜后行發(fā)光檢查，暗室曝光分析，采用Gel Doc2000凝膠圖像專用軟件(Bio- Rad公司)分析目標(biāo)條帶的光密度值，分別以p- Akt/Akt、p- GSK- 3β/GSK- 3β的值反映p- Akt和p- GSK- 3β的相對(duì)活化水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間均數(shù)比較采用One- way ANOVA單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK法檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 心肌酶譜檢測(cè)結(jié)果

Sham組大鼠血清CK- MB、LDH水平分別為(873.7±146.3)和(390.5±108.4) U·L-1；IR對(duì)照組CK- MB、LDH水平分別為(5238.7±829.8)和(1673.8±141.4) U·L-1，較Sham組明顯升高(P<0.05)。與IR對(duì)照組相比，TMP組CK- MB和LDH水平下降(均P<0.05)。合用渥曼青霉素后，TMP+Wort組CK- MB水平與TMP組比較明顯增高(P<0.05)，單獨(dú)給予渥曼青霉素時(shí)，CK- MB和LDH水平與IR對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.2 心肌ATP含量

Sham組和IR對(duì)照組大鼠缺血心肌組織ATP含量分別為(203.9±32.5)和(114.8±30.1) μmol·g-1，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與IR對(duì)照組相比，TMP組ATP含量升高(P<0.05)，TMP+Wort組與Wort組的ATP含量分別為(84.6±18.5)和(76.4±15.7) μmol·g-1，與IR對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血清心肌酶及心肌組織ATP 含量變化( x ± s)

Tab 1 The levels of serum myocardial enzyme and ATP content in each group( x ± s)

組 別nLDH水平/U·L-1CK-MB水平/U·L-1ATP含量/μmol·g-1Sham組6390.5±108.4ab873.7±146.3ab203.9±32.5abIR對(duì)照組61673.8±141.4b5238.7±829.8b114.8±30.1bTMP組61062.7±162.4a3598.3±841.5a155.2±35.5aTMP+Wort組61208.3±156.6a4128.0±882.3b84.6±18.5bWort組61458.7±235.6b5379.3±1170.5b76.4±15.7b

與IR對(duì)照組比較，aP<0.05；與TMP組比較，bP<0.05

2.3 心肌組織超微結(jié)構(gòu)改變

電鏡下Sham組大鼠心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，肌節(jié)整齊，肌絲清晰，線粒體膜完整，嵴清晰(圖1A)。IR對(duì)照組電鏡下部分心肌纖維排列紊亂，線粒體腫脹明顯，變性，嵴模糊、絮狀改變或消失，部分空泡化(圖1B)。TMP組線粒體輕度水腫，嵴尚完整，部分線粒體嵴較模糊，少部分線粒體嵴消失、絮狀改變或空泡變性(圖1C)。TMP+Wort組及Wort組電鏡下均可見大部分線粒體腫脹變性，嵴模糊、絮狀改變或消失(圖1D、E)。

2.4 p- Akt和p- GSK- 3β的蛋白表達(dá)情況

TMP組p- Akt蛋白相對(duì)表達(dá)水平為1.44±0.28，IR對(duì)照組為0.80±0.19，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，TMP組p- GSK- 3β水平較IR對(duì)照組亦明顯增高(1.92±0.34vs0.64±0.24，P<0.05)。合用渥曼青霉素后，TMP+Wort組p- Akt和p- GSK- 3β蛋白相對(duì)表達(dá)水平分別為0.55±0.23和1.04±0.26，較TMP組下降(均P<0.05)。單用渥曼青霉素時(shí)，p- Akt和p- GSK- 3β分別為0.63±0.25和0.87±0.29，與IR對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見圖2。

3 討 論

心肌是體內(nèi)對(duì)氧供需求最高的組織，含有豐富的線粒體，對(duì)IR損傷尤為敏感。IR時(shí)細(xì)胞及細(xì)胞器水腫，以線粒體變化最為明顯。心肌IR時(shí)細(xì)胞ATP酶活性下降，ATP供應(yīng)不足，鈣離子內(nèi)流增加導(dǎo)致鈣超載，同時(shí)氧自由基大量生成，線粒體結(jié)構(gòu)和功能受損，心肌細(xì)胞能量代謝障礙，進(jìn)一步加重細(xì)胞損傷[6- 7]。本研究觀察心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)電鏡下IR對(duì)照組大鼠缺血心肌細(xì)胞線粒體腫脹，嵴模糊、絮狀改變甚至空泡變性，心肌ATP含量較Sham組也有明顯下降。而TMP預(yù)處理后，線粒體損傷減輕，ATP含量增加，提示TMP保護(hù)了心肌。此外，TMP組大鼠血漿CK- MB和LDH水平均明顯低于IR對(duì)照組，說明TMP預(yù)處理可以減少心肌酶釋放，保護(hù)缺血心肌。

圖1 各組大鼠心肌電鏡結(jié)果

Fig 1 Electron microscope images of myocardium in each group

1.Sham組；2.IR對(duì)照組；3.TMP組；4.TMP+Wort組；5.Wort組與IR對(duì)照組相比，aP<0.05；與TMP組相比，bP<0.05

圖2 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)心肌p- Akt和p- GSK- 3β的蛋白表達(dá)

Fig 2 Western blot analysis of Akt and GSK- 3β phosphorylation

PI3K廣泛存在于細(xì)胞中，是與細(xì)胞凋亡和能量代謝等密切相關(guān)的胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要分子。蛋白激酶B(protein kinase B，也稱為Akt)是PI3K下游的直接和最主要的靶酶，負(fù)責(zé)由PI3K始動(dòng)的生物信息的傳導(dǎo)。大量研究表明，再灌注之初PI3K/Akt信號(hào)通路的激活能減少心肌梗死面積，促進(jìn)心肌細(xì)胞存活，被認(rèn)為是再灌注挽救激酶信號(hào)通路(RISK信號(hào)通路)的重要組成部分[8]。缺血預(yù)處理、缺血后處理均能在缺血后和再灌注初期主動(dòng)募集PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，Akt被激活并轉(zhuǎn)運(yùn)至胞質(zhì)和胞核，磷酸化各種底物蛋白，進(jìn)一步激活下游靶點(diǎn)產(chǎn)生生物學(xué)效益，從而保護(hù)心肌[9]。本研究發(fā)現(xiàn)川芎嗪組p- Akt的蛋白表達(dá)水平明顯增加，而PI3K抑制劑渥曼青霉素能阻斷TMP所致的p- Akt的增加，提示TMP激活了PI3K/Akt信號(hào)通路。

GSK- 3β是一種進(jìn)化上非常保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，廣泛表達(dá)于所有的真核細(xì)胞中，不僅是調(diào)節(jié)糖原代謝的關(guān)鍵酶，還與調(diào)控細(xì)胞分化增殖、存活凋亡有關(guān)。GSK- 3β主要位于心肌細(xì)胞胞質(zhì)，生理狀況下呈持續(xù)活化狀態(tài)。IR時(shí)，氧化應(yīng)激等因素誘導(dǎo)GSK- 3β易位至線粒體，抑制線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeability transition pore，mPTP)開放。GSK- 3β是RISK信號(hào)通路中PI3K/Akt和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2等多種細(xì)胞保護(hù)信號(hào)通路的共同下游激酶，Akt的激活能激活GSK- 3β，使其N- 末端絲氨酸(Ser9)殘基磷酸化，抑制其活性。磷酸化GSK- 3β能通過直接與mPTP亞單位腺嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)合提高mPTP開放的閾值從而抑制mPTP開放，保護(hù)線粒體內(nèi)膜完整性，被認(rèn)為是抑制mPTP開放的決定性因素之一[2，10]。動(dòng)物模型研究證實(shí)，缺血預(yù)適應(yīng)、缺血后適應(yīng)等機(jī)械干預(yù)和促紅細(xì)胞生成素、異氟烷等藥物預(yù)處理等心肌保護(hù)措施均能增加心肌線粒體p- GSK- 3β水平，提高mPTP開放閾值，保護(hù)心肌[10- 12]。本研究通過蛋白質(zhì)印跡法測(cè)定p- GSK- 3β水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TMP可顯著增加缺血心肌組織p- GSK- 3β水平，渥曼青霉素能抑制TMP所致的Akt和GSK- 3β磷酸化，提示PI3K/Akt信號(hào)通路參與了TMP所致的GSK- 3β磷酸化過程。TMP組大鼠CK- MB水平明顯低于IR對(duì)照組，ATP含量高于IR對(duì)照組。而TMP+Wort組較IR對(duì)照組無顯著差異，提示渥曼青霉素能減弱TMP對(duì)IR心肌的保護(hù)作用。因此，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，TMP可以減少在體大鼠心肌IR所致心肌酶釋放，增加心肌ATP含量，減輕心肌細(xì)胞線粒體損傷，該保護(hù)作用可能與激活PI3K/Akt- GSK- 3β信號(hào)通路、抑制GSK- 3β的活性有關(guān)。

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The role of glycogen synthase kinase 3β in the protective effect of ligustrazine on myocardial ischemia reperfusion injury in rats

(DepartmentofGeriatricCardiology，NanjingGeneralHospitalofNanjingMilitaryCommand，PLA，Nanjing210002，China)

Objective： To observe the effect of ligustrazine(tetramethylpyrazine，TMP) on myocardial ischemia reperfusion(IR) and to discuss the role of glycogen synthase kinase 3β(GSK- 3β) in a rat IR modelinvivo. Methods: Forty male SD rats were randomly divided into Sham，IR control，TMP，TMP+Wortmannin(wort) and Wort group.The left anterior descending artery(LAD) was not ligated in the Sham group.LAD in other groups was ligated for 35 min followed by 120 min of reperfusion.The activities of creatine kinase MB fraction(CK- MB) and lactate dehydrogenase(LDH) and the content of myocardial ATP were measured at the end of reperfusion.Electron microscopic evaluation was conducted.Expression of phosphorylated Akt and phosphorylated GSK- 3β were detected by Western blot.Results: The level of plasma CK- MB and LDH increased and ATP content decreased in the IR control group while the mitochondria were damaged.Compared to the IR control group，pretreatment with TMP markedly decreased plasma CK- MB and LDH，increased ATP content，attenuated mitochondrial injury，and induced Akt and GSK- 3β phosphorylation.However，wortmannin attenuated the TMP- induced phosphorylation of Akt and GSK- 3β and abolished the cardioprotective effect of TMP. Conclusion: Ligustrazine pretreatment attenuates myocardial IR injury and mitochondrial injury through decreasing the myocardial enzyme release and boosting ATP level.This cardioprotective effect of ligustrazine is mediated through activating the PI3K/Akt- GSK- 3β signal transduction pathway.

ligustrazine; ischemia reperfusion; glycogen synthase kinase 3β; mitochondria； rats

2016- 06- 18

2016- 09- 02

南京軍區(qū)南京總醫(yī)院科研基金資助項(xiàng)目(2014061)

呂磊(1978-)，女，安徽黃山人，副主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士。E- mail：lvleimm@hotmail.com

徐軍 Email:xxujun305@sina.com

呂磊，郭華，張潔，等.糖原合酶激酶- 3β在川芎嗪對(duì)心肌缺血再灌注損傷保護(hù)中的作用[J].東南大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2016，35(6)：836- 840.

R331.31； R33- 33

A

1671- 6264(2016)06- 0836- 05

10.3969/j.issn.1671- 6264.2016.06．003