劉青，蔣小崗

(蘇州大學藥學院，江蘇 蘇州 215123)

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·論 著·

激酶抑制劑DRB在骨髓瘤細胞中調控鋅指轉錄因子IKZF1的機制研究

劉青，蔣小崗

(蘇州大學藥學院，江蘇 蘇州 215123)

目的:研究激酶抑制劑調控多發(fā)性骨髓瘤細胞死亡關鍵蛋白鋅指轉錄因子IKZF1的分子機制。方法：在兩種多發(fā)性骨髓瘤細胞OPM2和U266中用酪蛋白激酶抑制劑DRB處理不同時間后，蛋白質免疫印跡實驗檢測IKZF1的表達變化，研究細胞凋亡相關蛋白在藥物處理后的表達和激活情況；用漆黃素(fisetin)和凋亡酶抑制劑處理U266細胞后檢測IKZF1、procaspase- 3及其剪切體的變化。結果：激酶抑制劑DRB在OPM2細胞中但不在U266細胞中降低IKZF1、procaspase- 9、procaspase- 3、BID等蛋白的表達；漆黃素在U266細胞中激活細胞凋亡并導致IKZF1的剪切；凋亡酶抑制劑處理兩細胞株后發(fā)現(xiàn)IKZF1剪切被抑制。結論：在多發(fā)性骨髓瘤細胞OPM2和U266中激活凋亡酶可以導致IKZF1的剪切和降解。

多發(fā)性骨髓瘤； IKZF1； 凋亡酶； DRB； 漆黃素

多發(fā)性骨髓瘤是第二大血液腫瘤，到目前為止只能用藥物進行治療卻不能完全治愈[1]。臨床治療多發(fā)性骨髓瘤的一線藥物主要有類固醇、蛋白酶體抑制劑和免疫調節(jié)劑沙利度胺及其結構衍生物來那度胺[2- 3]。然而病人經過這些藥物治療后易產生耐藥性和復發(fā)，對這類疾病的治療提出了很大的挑戰(zhàn)。如免疫調節(jié)劑來那度胺的長期使用會造成骨肉瘤細胞U266產生耐藥性[4]，蛋白酶體抑制劑硼替佐米的長期使用會造成骨肉瘤細胞OPM2產生耐藥性[5]。近期的研究發(fā)現(xiàn)沙利度胺和來那度胺可以促進一個E3泛素連接酶復合物的底物受體cereblon與兩個鋅指轉錄因子IKZF1和IKZF3的結合，從而促進它們的泛素化，并經過泛素- 蛋白酶體途徑使它們降解[6- 7]。這兩個轉錄因子的降解最終導致骨髓瘤細胞的死亡[6]。這些研究表明IKZF1和IKZF3是調控骨髓瘤細胞存活的關鍵蛋白。如果我們能發(fā)現(xiàn)調控這兩個蛋白降解的新機制，就有可能為對耐藥骨髓瘤病人的治療提供新的思路。

自從2001年美國食品藥物管理局批準格列衛(wèi)治療費城染色體陽性慢性髓性白血病[8]以來，已經有28個小分子蛋白激酶抑制劑被用于治療多種腫瘤[9- 11]，使得激酶成為一類最大的腫瘤分子靶向治療的靶標分子[12]。在我們的前期實驗中嘗試了幾個激酶抑制劑對骨髓瘤細胞中IKZF1表達的影響，發(fā)現(xiàn)在一些骨髓瘤細胞如OPM2中IKZF1的蛋白水平可以被一個酪蛋白激酶Ⅱ抑制劑DRB(5，6- dichlorobenzimidazole riboside)調控，然而DRB在另一些細胞系中對IKZF1的表達并沒有影響[13]。DRB在不同骨髓瘤細胞中如何調控IKZF1蛋白的表達這一分子機制還不清楚。本研究中我們將利用生物化學、抑制和激活凋亡酶等手段來探索在兩個骨髓瘤細胞OPM2和U266中DRB調控IKZF1降解的分子機制。通過對細胞凋亡過程中的關鍵蛋白如caspase、促凋亡蛋白、抗凋亡蛋白的檢測發(fā)現(xiàn)其可能的調控機制，并利用藥物激活細胞凋亡后探索對IKZF1的調控機制。

1 材料和方法

1.1 實驗細胞

多發(fā)性骨髓瘤細胞系U266購自美國ATCC；OPM2細胞系購自德國DSMZ。

1.2 實驗材料

DMEM高糖培養(yǎng)基(SH40007.01，GE healthcare life sciences)；RPMI 1640培養(yǎng)基(SH30809.01B，HyClone)；胎牛血清(FBS，04- 001- 1ACS，Biological Industries)；青霉素- 鏈霉素(GNM 15140，吉諾生物醫(yī)藥技術有限公司)；胰酶(Trypsin，1- 435- 792- 800，GE healthcare life sciences)；蛋白酶抑制劑(Protease Inhibitor Cocktail tablets，Roche)；預染蛋白Marker(26616，Thermo Fisher)；二甲基亞砜(DMSO，A36720100，AppliChem)；Procaspase- 3抗體(9662，CST)；PARP1抗體(9532，Cell Signaling Technology)；GAPDH抗體(R1210- 1，杭州華安生物技術有限公司)；Mcl- 1(YT5160)，Bid(YT0488)，Bax(YT0456)，IKZF1，Procaspase- 6(YC0105)，Procaspase- 7(YT0659)均購自ImmunoWay；Procaspase- 9(RLM3077)購自睿瀛生物技術有限公司；ECL發(fā)光液購自Millipore；酪蛋白激酶II抑制劑DRB(5，6- dichlorobenzimidazole riboside)購自Sigma；Fisetin購自上海同田生物技術有限公司；廣譜凋亡酶抑制劑z- VAD- fmk和caspase- 3特異性抑制劑z- DQMD- fmk均購自APExBio；BCA蛋白濃度檢測試劑盒購自碧云天生物技術有限公司。

1.3 實驗儀器

超純水機(MicroPure UV，Thermo)；微量紫外分光光度計2000(Thermo)；金屬浴(GL- 150，其林貝爾)；電泳儀及電泳槽、轉膜槽(天能)；凝膠成像系統(tǒng)(ChemiDoc MP，Bio- Rad)；高速低溫離心機(SL 16R，Thermo)；立式壓力蒸汽滅菌鍋(LDZX- 50KBS，上海申安醫(yī)療器械廠)；細胞培養(yǎng)箱(BB15，Thermo)；生物安全柜(BSC- 1000，蘇凈安泰)；倒置生物顯微鏡(XD- 202，南京江南永新光學有限公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1 細胞培養(yǎng) 多發(fā)性骨髓瘤U266和OPM2細胞用含10%FBS、100 U·ml-1青霉素、100 μg·ml-1鏈霉素的改良型RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。細胞置于37 ℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內，待細胞生長至90%左右時傳代，收集細胞到離心管中，低速離心沉淀細胞，棄去上清液，用新鮮培養(yǎng)基重懸細胞并繼續(xù)在培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。

1.4.2 藥物處理 在倒置生物顯微鏡下用細胞計數(shù)板進行細胞計數(shù)，按照5×105個·ml-1的密度將細胞種在25 cm2的培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)12 h后加入50 μmol·L-1DRB(50 mmol·L-1母液)處理細胞，同時對照組中加入相同體積的DMSO，分別在處理0、2、4、6 h后收集細胞。抑制劑預處理實驗中，預先加入廣譜caspase抑制劑z- VAD- fmk(50 μmol·L-1)或caspase- 3特異性抑制劑z- DQMD- fmk(50 μmol·L-1)處理細胞4 h，再加入50 μmol·L-1DRB處理6 h或者50 μmol·L-1Fisetin處理9 h后收集細胞。

1.4.3 蛋白質免疫印跡(Western blotting)實驗 細胞用藥物處理后，將懸浮細胞收集到離心管中，4 ℃ 600×g離心3 min，加入含有新鮮蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液在冰上靜置30 min，15 000×g離心10 min，收集上清至新的離心管中，即為總蛋白裂解液。將各組的蛋白樣品用BCA蛋白檢測試劑盒測定濃度后統(tǒng)一調整為相同濃度，加入5倍上樣緩沖液在金屬浴中煮7 min。離心后在SDS- PAGE中加入20 μg蛋白樣品進行電泳分離，上層膠70 V用時30 min，下層膠110 V用時100 min。電泳結束后將膠上的蛋白轉移到用甲醇活化的PVDF膜上，260 mA轉膜120 min。轉膜結束后清洗去除甲醇后在5%的脫脂奶粉中封閉1 h。用相應的一抗室溫孵育2 h或者4 ℃孵育過夜，用TBST洗3次，每次10 min，用相應的二抗室溫孵育1 h，TBST洗3次，最后用ECL發(fā)光液顯影[14- 15]。

1.5 統(tǒng)計學處理

每個實驗獨立重復3次，數(shù)據(jù)采用Excel進行統(tǒng)計分析。Western blotting條帶用Image J進行灰度定量。兩組間比較采用t檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 激酶抑制劑DRB在OPM2細胞中但不在U266細胞中誘導IKZF1的降解

DRB處理OPM2細胞4 h和6 h后IKZF1的表達有明顯的下降；但是在U266細胞中，IKZF1蛋白水平基本沒有變化(圖1A、B)。統(tǒng)計結果得出了相同的結論(圖1C、D)。

A.DRB在OPM2細胞中對內源性IKZF1蛋白表達水平的影響； B.DRB在U266細胞中對內源性IKZF1蛋白表達水平的影響； C、D.對A和B中3次重復實驗結果定量分析

采用成對的student’st檢驗對DRB處理的樣品與DMSO處理的樣品的比值進行統(tǒng)計分析，a與0 h比較，P<0.05

圖1 酪蛋白激酶抑制劑DRB在骨髓瘤OPM2細胞中但不在U266細胞中下調鋅指轉錄因子IKZF1

Fig 1 Casein kinase Ⅱ inhibitor DRB downregulated a zinc finger transcription factor IKZF1 in OPM2 but not in U266 cells

2.2 DRB在OPM2細胞中但不在U266細胞中誘導procaspase- 9和procaspase- 3的特異性剪切

在這兩個細胞中procaspase- 6/7和剪切后的caspase- 6的表達受DRB的調控是一致的。procaspase- 7在兩個細胞株中的表達基本不受DRB的影響，但procaspase- 6的表達在DRB處理后有所下降，DRB處理后剪切的caspase- 6表達有所升高。但是Procaspase- 9/3和剪切的caspase- 3在兩個細胞中的表達受DRB的調控并不完全相同。在OPM2細胞中，Procaspase- 9/3在DRB處理4 h后都發(fā)生了下調，但是在U266細胞中不受DRB的影響(圖2)。相應地，剪切后活化的caspase- 3在OPM2細胞中經DRB處理4 h后表達上升，但在U266細胞中盡管實驗條件相同卻沒有檢測到剪切后的caspase- 3蛋白條帶(圖2A、B)。

A、B.OPM2細胞和U266細胞用DRB(50 μmol·L-1)處理后蛋白質印跡檢測procaspase和剪切的caspase蛋白水平； C、D.DRB處理后的OPM2細胞中procaspase- 3和procaspase- 9的定量分析； E、F.DRB處理后的U266細胞中procaspase- 3和procaspase- 9的定量分析

采用成對的student’st檢驗對DRB處理的樣品與DMSO處理的樣品的比值進行統(tǒng)計分析，與0 h比較，aP<0.05，bP<0.01

圖2 DRB在OPM2細胞中但不在U266細胞中激活caspase- 9和caspase- 3

Fig 2 DRB activated caspase- 9 and caspase- 3 in OPM2 but not in U266 cells

2.3 DRB特異性地在OPM2細胞中但不在U266細胞中降低促凋亡蛋白BID的表達

在OPM2細胞中，促凋亡蛋白BID在DRB處理4 h后發(fā)生下降，這極有可能是發(fā)生了剪切降解。但是該蛋白在U266細胞中并不受DRB影響。Bax和Bak在DRB處理后的兩個細胞中的表達均沒有發(fā)生變化，但Mcl- 1表達均發(fā)生了下降，它們在兩種細胞中的表達受DRB的調控基本一致(圖3)。定量分析結果發(fā)現(xiàn)BID/Bax的比例在U266中沒有發(fā)生明顯的變化，但在OPM2細胞中有顯著的降低。這些實驗結果表明，在DRB處理后OPM2細胞發(fā)生了凋亡而U266細胞卻沒有發(fā)生凋亡。

A、B.OPM2細胞和U266細胞用DRB(50 μmol·L-1)處理后蛋白質印跡檢測BID、Bax、Bak、Mcl- 1的蛋白水平； C、D.DRB處理后OPM2細胞中Bid和Bid/Bax的定量分析； E、F.DRB處理后U266細胞中Bid和Bid/Bax的定量分析

采用成對的student’st檢驗對DRB處理的樣品與DMSO處理的樣品的比值進行統(tǒng)計分析，與0 h比較，aP<0.05

圖3 DRB在OPM2和U266細胞中差異調控促凋亡蛋白BID的表達

Fig 3 DRB differentially regulated the cell proapoptotic protein， BID in OPM2 and U266 cells

2.4 Fisetin可在U266細胞中激活細胞凋亡并剪切降解IKZF1

當用凋亡抑制劑z- VAD- fmk和z- DQMD- fmk預處理細胞后，我們發(fā)現(xiàn)DRB在OPM2細胞中對IKZF1的降解完全被抑制，蛋白水平恢復到沒有被DRB處理的水平(圖4A)。這一結果說明DRB激活了caspase- 3，活化的caspase- 3剪切了IKZF1，并導致該蛋白表達水平發(fā)生了大幅度的降低。漆黃素可以在U266細胞中剪切procaspase- 3產生活化的caspase- 3(圖4B)。我們也發(fā)現(xiàn)這一化合物可以導致IKZF1的降解。但當用兩種凋亡酶抑制劑抑制細胞凋亡后，在U266細胞中IKZF1的表達水平恢復到了沒有被漆黃素處理的水平。這一現(xiàn)象說明在OPM2和U266細胞中激活caspase- 3導致IKZF1的降解。

A.在OPM2細胞中caspase- 3特異性抑制劑和廣譜凋亡酶抑制劑阻止了DRB誘導的IKZF1表達的降低； B.在U266細胞中caspase- 3特異性抑制劑和廣譜凋亡酶抑制劑阻止了fisetin誘導的IKZF1表達的降低

圖4 在多發(fā)性骨髓瘤細胞OPM2和U266中激活caspase- 3導致IKZF1蛋白的降低

3 討 論

通過對細胞凋亡酶、促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白的蛋白質免疫印跡檢測發(fā)現(xiàn)，酪蛋白激酶Ⅱ抑制劑DRB在不同的多發(fā)性骨髓瘤細胞中對IKZF1蛋白有不同的調控關系。通過對其分子機制的詳細研究，我們發(fā)現(xiàn)，DRB可以促進procaspase- 9的降解，激活caspase- 9并剪切procaspase- 3，從而使得caspase- 3對IKZF1剪切并使其降解。利用廣譜caspase抑制劑和caspase- 3特異性抑制劑，我們發(fā)現(xiàn)在OPM2細胞中IKZF1的降解均被抑制，這些事實說明IKZF1是被caspase- 3直接或其下游蛋白間接剪切而降解的。盡管IKZF1的氨基酸序列中含有數(shù)個caspase- 3凋亡酶的保守系列(DXXD)[16- 17]，我們不能完全排除caspase- 3的下游蛋白對IKZF1的降解。事實上，我們通過蛋白質組學的研究發(fā)現(xiàn)，在DRB誘導OPM2細胞的凋亡過程中，根據(jù)酶切位點分析顯示確實有一些蛋白并不是直接被蛋白凋亡酶所酶切的，預示著其它蛋白酶也可能在這一過程中被激活[18]，從而剪切它們的底物蛋白。

而在U266細胞中，DRB不能導致procaspase- 9的剪切和激活，不能進一步剪切procaspase- 3從而無法激活下游細胞凋亡信號通路，不能剪切并降解IKZF1蛋白。但是當我們用漆黃素在U266細胞中激活caspase- 3后，IKZF1蛋白水平發(fā)生了明顯的降低，這一降低可以被凋亡酶抑制劑所抑制，證實caspase- 3的剪切導致了IKZF1蛋白水平的降低。這一結果證實在多發(fā)性骨髓瘤細胞中激活細胞凋亡可以導致IKZF1蛋白表達水平的降低，從而可能為耐沙利度胺及其衍生物的骨髓瘤病人提供可能的治療方法。

盡管我們的實驗解釋了DRB在兩個骨髓瘤細胞中調控IKZF1蛋白的分子機制，但是我們的實驗還沒有完全解釋清楚許多問題。雖然酪蛋白激酶Ⅱ在OPM2和U266細胞中的表達水平相仿[19]，為什么DRB可以在OPM2細胞中導致細胞凋亡而在U266細胞中不能激活細胞凋亡通路？這可能是因為在兩個細胞中激活細胞凋亡的分子機制的關鍵蛋白的表達并不完全一致。另一種可能的解釋是DRB可能有多個靶蛋白，其中某些靶蛋白在U266細胞中并不表達而在OPM2細胞中有表達，從而導致細胞凋亡的不同激活路徑。另外，為什么DRB對OPM2和U266細胞中凋亡酶的激活不同，但是DRB均可降低這兩個細胞的活力[13]？一個可能的解釋是DRB通過其它的機制如增加活性氧化物等來影響U266細胞的活力。

本研究中我們發(fā)現(xiàn)調控骨髓瘤細胞死亡的關鍵蛋白鋅指轉錄因子IKZF1在不同的骨髓瘤細胞中受激酶抑制劑DRB的調控完全不同。通過蛋白質免疫印跡及凋亡酶抑制和激活實驗，我們發(fā)現(xiàn)DRB對caspase- 3的不同激活是導致IKZF1蛋白在OPM2和U266細胞中受到不同調控的原因。我們的這一研究為探索耐藥性骨髓瘤的治療提供了一定的理論基礎。

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Mechanistic study of a kinase inhibitor DRB on the regulation of a zinc finger transcription factor IKZF1 in multiple myeloma cells

LIU Qing，JIANG Xiao- gang

(CollegeofPharmaceuticalSciences，SoochowUniversity，Suzhou215123，China)

Objective： To explore the molecular mechanism by which a kinase inhibitor regulates the protein level of a zinc finger transcription factor IKZF1， which plays critical roles in determining the death of multiple myeloma cells. Methods: IKZF1 in two myeloma cells OPM2 and U266 treated by DRB for different time was determined by western blotting. The procaspases， caspases， proapoptotic and antiapoptotic proteins were immunoblotted. IKZF1 was also monitored in U266 cells treated with fisetin in the absence or presence of caspase inhibitors. Results: IKZF1， procaspase- 9/3 and BID were cleaved in OPM2 cells but not in U266 cells after DRB treatment. Activation of apoptosis with fisetin in U266 cells also led to the cleavage of IKZF1. The cleavage of IKZF1 in two myeloma cell lines was blocked by caspase inhibitors. Conclusion: Activation of apoptotic pathway in two myeloma cells OPM2 and U266 leads to the cleavage and degradation of IKZF1．

multiple myeloma; IKZF1; caspase; DRB; fisetin

2016- 05- 09

2016- 06- 21

國家自然科學基金面上項目(31270874)

劉青(1990-)，女，安徽阜陽人，在讀碩士研究生。E- mail:cyan1029@126.com

蔣小崗 E- mail:jiangxiaogang@suda.edu.cn

劉青，蔣小崗.激酶抑制劑DRB在骨髓瘤細胞中調控鋅指轉錄因子IKZF1的機制研究[J].東南大學學報:醫(yī)學版，2016，35(6)：847- 853.

R967

A

1671- 6264(2016)06- 0847- 07

10.3969/j.issn.1671- 6264.2016.06．005