米源，杜媛鯤，劉慶熠，廖海江，王林，王雷

(1.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院 胸二科，河北 石家莊 050011； 2.河北醫(yī)科大學(xué) 期刊社，河北 石家莊 050017)

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·論 著·

siRNA下調(diào)Gli基因表達(dá)對肺鱗癌SK- MES- 1細(xì)胞生物學(xué)行為的影響

米源1，杜媛鯤2，劉慶熠1，廖海江1，王林1，王雷1

(1.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院 胸二科，河北 石家莊 050011； 2.河北醫(yī)科大學(xué) 期刊社，河北 石家莊 050017)

目的:探討Gli表達(dá)下調(diào)對肺鱗癌SK- MES- 1細(xì)胞周期分布和上皮- 間質(zhì)轉(zhuǎn)化能力的影響及其分子機(jī)制。方法：將Gli1和Gli2 siRNA與空白對照siRNA分別轉(zhuǎn)染SK- MES- 1細(xì)胞48 h，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測Gli1、Gli2 mRNA表達(dá)水平；Western blot法檢測SK- MES- 1細(xì)胞Gli1、Gli2、Cyclin D1、Cyclin E、E- cadherin、N- cadherin蛋白的表達(dá)；流式細(xì)胞術(shù)檢測SK- MES- 1細(xì)胞周期分布；Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲能力。結(jié)果：與空白對照siRNA組相比，Gli1和Gli2 siRNA可明顯抑制SK- MES- 1細(xì)胞Gli1、Gli2 mRNA及蛋白表達(dá)，下調(diào)Cyclin D1、Cyclin E、N- cadherin蛋白的表達(dá)，增加E- cadherin蛋白表達(dá)，將細(xì)胞周期明顯阻滯在G0/G1期并降低細(xì)胞的侵襲能力，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論：Gli蛋白表達(dá)可能在肺鱗癌的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，Gli1和Gli2表達(dá)下調(diào)可導(dǎo)致肺鱗癌細(xì)胞周期分布和上皮- 間質(zhì)轉(zhuǎn)化能力的改變，這可能與Cyclin D1、Cyclin E、E- cadherin、N- cadherin蛋白變化相關(guān)。

肺鱗癌； Gli； 細(xì)胞周期； 上皮- 間質(zhì)轉(zhuǎn)化

肺癌又稱支氣管肺癌，是全球范圍內(nèi)癌癥相關(guān)性死亡的首位原因[1]。非小細(xì)胞肺癌(non- small- cell carcinoma，NSCLC)包括鱗癌、腺癌和大細(xì)胞癌等多種病理類型，約占每年新發(fā)肺癌的85%，其中肺鱗癌占非小細(xì)胞肺癌總數(shù)的30%[2]。肺鱗癌的主要治療方法仍舊采取以外科手術(shù)為主放化療為輔的綜合治療，但晚期NSCLC患者的預(yù)后仍差強(qiáng)人意。

肺癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多階段、多因素和多條基因信號傳導(dǎo)通路參與的復(fù)雜過程，基因的異常改變可導(dǎo)致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。近年來研究發(fā)現(xiàn)，Hedgehog(Hh)信號傳導(dǎo)通路在卵巢癌[3]、非霍奇金淋巴瘤[4]、肝癌[5]和前列腺癌[6]等多種腫瘤組織中異常激活，與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Gli作為Hh信號通路的關(guān)鍵組分包括Gli1、Gli2和Gli3。Gli3是該通路的轉(zhuǎn)錄抑制因子，而Gli1和Gli2作為主要的轉(zhuǎn)錄激活因子在多種腫瘤中異常高表達(dá)且參與調(diào)控下游多種靶基因的表達(dá)，在腫瘤的發(fā)生及發(fā)展中發(fā)揮重要作用。目前國內(nèi)外關(guān)于Hh/Gli異常激活與鱗癌細(xì)胞周期和上皮- 間質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)系研究極少，本研究應(yīng)用siRNA下調(diào)肺鱗癌SK- MES- 1細(xì)胞中Gli1和Gli2的表達(dá)，旨在研究Gli和肺鱗癌細(xì)胞生長轉(zhuǎn)移的關(guān)系，為肺鱗癌的分子靶向治療提供新依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系來源 人肺鱗癌細(xì)胞系SK- MES- 1購自上海拜力生物科技有限公司。

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器及試劑 RPMI- 1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自美國Gibco公司；青霉素、鏈霉素購自山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司；胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司；SilencerTMSelect Gli1、Gli2和control siRNA，TaqMan?Gli1引物和探針(Hs00171790)，Gli2引物和探針(Hs01119974_m1)，GAPDH(Hs02758991_g1)購自美國Life Technologies公司；LipofectamineTMRNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司；總RNA提取試劑盒購自德國Qiagen公司；iScriptTMcDNA合成試劑盒購自美國Bio- Rad公司；Pierce- BCA蛋白分析試劑盒購自美國Thermo Scientific公司；CyclinD1、CyclinE兔抗人單克隆抗體購自美國Cell Signaling公司；Gli2鼠抗人單克隆抗體、GAPDH鼠抗人單克隆抗體、N- cadherin兔抗人單克隆抗體均購自美國Santa Cruz公司；Gli1兔抗人多克隆抗體和E- cadherin鼠抗人單克隆抗體購自美國Abcam公司；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自美國Thermo Scientific公司；Matrigel膠和Transwell膜嵌套購自美國Corning公司；ABI 7900HT高通量熒光定量PCR儀購自美國Applied Biosystems公司；Epics- XL型流式細(xì)胞儀購自美國Beckman- Coulter公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 SK- MES- 1細(xì)胞使用含10%胎牛血清(FCS)及青霉素/鏈霉素雙抗各10 U·ml-1的RPMI- 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，每隔1～2 d換液1次。細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)板底面積80%～90%時(shí)進(jìn)行傳代，傳代時(shí)使用0.25%胰酶溶液消化。實(shí)驗(yàn)細(xì)胞選用對數(shù)生長期細(xì)胞，以每孔3×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板上，培養(yǎng)24 h后待細(xì)胞密度達(dá)到50%～60%更換無血清培養(yǎng)基，按照LipofectamineTMRNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行Gli1和Gli2 siRNA轉(zhuǎn)染，同時(shí)設(shè)立空白對照組(control SiRNA)。每組各設(shè)3個(gè)孔，每孔Gli1 & Gli2 siRNA及空白對照siRNA的濃度均為100 nmol·L-1。轉(zhuǎn)染6 h后更換新的無血清培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染48 h后提取各組樣本的mRNA及蛋白，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測Gli- 1和Gli- 2基因的表達(dá) 轉(zhuǎn)染48 h后用PBS洗滌6孔板細(xì)胞，按照總RNA提取試劑盒說明書提取各組樣本RNA，在NanoDrop 8000全光譜紫外- 可見光分光光度計(jì)檢測下對每組樣本的RNA濃度進(jìn)行檢測。采用cDNA合成試劑盒進(jìn)行cDNA的反轉(zhuǎn)錄，每組樣本的反應(yīng)體系共為40 μl，包含總RNA500 ng，iScript逆轉(zhuǎn)錄酶2 μl和iScript反應(yīng)混合液8 μl，在25 ℃ 5 min、42 ℃ 30 min和85 ℃ 5 min的條件下進(jìn)行cDNA的反轉(zhuǎn)錄。用無R- Nase水將反轉(zhuǎn)錄的cDNA稀釋10倍，以10 μl·孔-1的反應(yīng)體系(每組樣本cDNA4.5 μl，Taqman基因表達(dá)預(yù)混液5 μl，TaqMan?Gli1、Gli2、GAPDH各自的引物和探針0.5 μl)加樣在384孔板，在ABI 7900HT高通量熒光定量PCR儀中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增條件為95 ℃ 10 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 10 s，40個(gè)循環(huán)。以GAPDH的CT值作為內(nèi)參，采用2-ΔCt法進(jìn)行各組數(shù)據(jù)分析。

1.2.3 Western blot法檢測蛋白表達(dá) 用PBS洗滌轉(zhuǎn)染48 h后的6孔板細(xì)胞，每孔加入100 μl含有蛋白酶抑制劑的M- PER細(xì)胞總蛋白提取試劑，用刮匙收集各組樣本的總蛋白提取液后用BCA法測定各組樣本的總蛋白濃度。采用常規(guī)Western blot法蛋白上樣進(jìn)行凝膠電泳和轉(zhuǎn)PVDF膜。再用5%脫脂奶粉/TBST液封閉PVDF膜，加入一抗Gli1(工作濃度為1∶1 000)、一抗Gli2(工作濃度為1∶250)、一抗Cyclin D1(工作濃度為1∶1 000)、一抗Cyclin E(工作濃度為1∶1 000)、一抗E- cadherin(工作濃度為1∶8 000)、一抗GAPDH(工作濃度為1∶10 000)和一抗N- cadherin(工作濃度為1∶500)，于4 ℃搖床過夜孵育。用TBST液10 min·次-1洗膜，共3次，加入工作濃度均為1∶20 000的羊抗兔或羊抗鼠二抗室溫孵育1 h，將膜置于ECL發(fā)光，再放到暗室經(jīng)X線曝光顯影，最后將顯影蛋白條帶通過Image軟件分析灰度值。以GAPDH為內(nèi)參，每組樣本蛋白相對表達(dá)=目的蛋白表達(dá)量/內(nèi)參蛋白表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測肺鱗癌SK- MES- 1細(xì)胞周期 收集轉(zhuǎn)染48 h后的SK- MES- 1細(xì)胞，將細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液，用4 ℃ 70%冰乙醇固定以PBS漂洗的單細(xì)胞懸液30 min。調(diào)整每組樣品細(xì)胞數(shù)為1×106個(gè)·(0.1 ml)-1，再用冷PBS漂洗3次后加入50 μg·ml-1碘化吡啶1 ml，在4 ℃冰箱染色30 min后通過流式細(xì)胞儀檢測DNA含量，應(yīng)用MuticycleAV分析軟件對DNA細(xì)胞周期進(jìn)行擬合分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲能力 將Matrigel膠按1∶4用培養(yǎng)基稀釋后以50 μl包被Transwell小室基底膜，在37 ℃條件下放置2 h使Matrigel膠凝固為凝膠。分別加入Gli1 & Gli2 siRNA和Control siRNA轉(zhuǎn)染的7.5×104個(gè)細(xì)胞在上室，在下室中加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)液500 μl后在5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。24 h后常規(guī)去除上室液體，用棉簽擦去Matrigel膠和未侵襲的細(xì)胞，用甲醛固定小室基底膜，結(jié)晶紫染色，在顯微鏡(×400)下觀察。在每張膜上隨機(jī)取4個(gè)視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野內(nèi)的穿膜細(xì)胞數(shù)的平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果

將Gli1 & Gli2 siRNA組與control siRNA組檢測數(shù)據(jù)經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化處理后顯示：Gli1 & Gli2 siRNA組Gli1 mRNA表達(dá)水平為0.27±0.03，較control siRNA組1.00±0.03顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=32.24，P<0.01)；Gli2 mRNA表達(dá)水平為0.35±0.02，較control siRNA組1.00±0.03顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=32.96，P<0.01)，見圖1。

與control siRNA比較，aP<0.05

圖1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測不同siRNA處理SK- MES- 1細(xì)胞的Gli1、Gli2 mRNA水平

2.2 Western blot檢測蛋白表達(dá)

SK- MES- 1細(xì)胞Gli1、Gli2、CyclinD1、Cyclin E、E- cadherin和N- cadherin蛋白表達(dá)的結(jié)果顯示，Gli1 & Gli2 siRNA組Gli1(t=14.81，P<0.001)、Gli2(t=16.29，P<0.01)、CyclinD1(t=15.61，P<0.01)、Cyclin E(t=6.74，P<0.01)和N- cadherin(t=21.62，P<0.01)表達(dá)較control siRNA顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；E- cadherin蛋白表達(dá)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-44.18，P<0.01)，見圖2。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期結(jié)果

流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示：Gli1 & Gli2 siRNA組G0/G1期細(xì)胞為(63.22±5.66)%，與control siRNA組[(44.78±3.68)%]比較顯著增高(t=-4.73，P=0.009);S期細(xì)胞為(32.28±4.75)%，與control siRNA組[(50.13±3.50)%]比較顯著降低(t=-5.24，P=0.006)，見圖3。

與control siRNA組比較，aP<0.05

A.電泳結(jié)果; B.SK- MES- 1細(xì)胞中蛋白相對表達(dá)

圖2 Western blot法檢測SK- MES- 1細(xì)胞中Gli- 1、Gli- 2、Cyclin D1、Cyclin E、N- Cadherin和E- Cadherin蛋白表達(dá)

與control siRNA組比較，aP<0.05

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測siRNA作用下SK- MES- 1細(xì)胞周期直方圖

2.4 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)

與control siRNA組穿膜細(xì)胞數(shù)(124.67±7.50)比較，Gli1 & Gli2 siRNA組穿膜細(xì)胞數(shù)(64.33±6.51)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.52，P<0.001)，見圖4。

3 討 論

Hedgehog(Hh)信號通路主要由Hh配體、跨膜蛋白受體Ptch、Smo、核轉(zhuǎn)錄調(diào)控子Gli以及下游靶基因等構(gòu)成，當(dāng)Hh配體與受體復(fù)合物結(jié)合后使Ptch內(nèi)化降解，從而失去對Smo的抑制，被磷酸化激活的Smo與SUFU- Gli- Kif7復(fù)合物作用釋放出Gli蛋白，進(jìn)而誘導(dǎo)Hh信號下游靶基因的表達(dá)。Gli1和Gli2具有轉(zhuǎn)錄激活作用，可以進(jìn)入細(xì)胞核與下游靶基因啟動子區(qū)結(jié)合并調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖和上皮- 間質(zhì)轉(zhuǎn)化，抑制細(xì)胞凋亡，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展[7- 8]。本研究首先轉(zhuǎn)染Gli1、Gli2 siRNA進(jìn)入肺鱗癌SK- MES- 1細(xì)胞中，結(jié)果顯示與空白siRNA比較，內(nèi)源性Gli1、Gli2 mRNA和蛋白表達(dá)均顯著下調(diào)，表明特異性的Gli1、Gli2 siRNA能有效下調(diào)肺鱗癌細(xì)胞中內(nèi)源性Gli1、Gli2的表達(dá)。

與control siRNA組比較，aP<0.05

A.鏡下結(jié)果； B.兩組間穿膜細(xì)胞數(shù)比較

圖4 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測siRNA對SK- MES- 1細(xì)胞侵襲能力的影響(×400)

細(xì)胞周期紊亂與腫瘤的發(fā)生密不可分，當(dāng)細(xì)胞的增殖能力增強(qiáng)或?qū)φＸ?fù)性調(diào)節(jié)的刺激變?nèi)蹙蓪?dǎo)致腫瘤發(fā)生。本研究通過應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)分析了Gli1、Gli2siRNA對SK- MES- 1細(xì)胞周期分布的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Gli1 & Gli2siRNA轉(zhuǎn)染組將細(xì)胞阻滯于G0/G1期，S期細(xì)胞比例顯著低于對照組，表明Gli的表達(dá)可以調(diào)控細(xì)胞周期，Gli1和Gli2表達(dá)下調(diào)可以使肺鱗癌細(xì)胞周期更多地靜止在G0/G1期從而阻斷DNA復(fù)制抑制細(xì)胞增殖。為了更進(jìn)一步證實(shí)Hh/Gli通路與肺鱗癌細(xì)胞周期之間的關(guān)系，我們通過運(yùn)用Western blot法對細(xì)胞周期相關(guān)蛋白Cyclin D1、Cyclin E蛋白進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示Gli1、Gli2表達(dá)沉默后CyclinD1和CyclinE蛋白表達(dá)下調(diào)。Cyclin D1是細(xì)胞周期的關(guān)鍵因子，在正常組織中表達(dá)很低，而在許多惡性腫瘤中呈高表達(dá)，其表達(dá)可以和CDK4、CDK6形成cyclinD/CDK復(fù)合物，促進(jìn)細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期，加速細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞癌變和進(jìn)展[9- 10]。Cyclin E是調(diào)控細(xì)胞周期G1/S期的重要蛋白，其上調(diào)與結(jié)腸癌[11]、乳腺癌[12]的發(fā)展相關(guān)。本研究結(jié)果顯示Gli1和Gli2表達(dá)沉默后Cyclin D1、Cyclin E蛋白的表達(dá)下降，表明Hh/Gli信號通路激活后可能通過調(diào)節(jié)Cyclin D1和Cyclin E的表達(dá)進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，這與Seiler等[10]研究發(fā)現(xiàn)Cyclin D1作為Hh通路的靶基因被活化的結(jié)果相符。

上皮- 間質(zhì)轉(zhuǎn)化與腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移有著密切關(guān)系，上皮- 間質(zhì)轉(zhuǎn)化是指上皮細(xì)胞通過特定程序轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型細(xì)胞的生物學(xué)過程，以上皮表型標(biāo)志E- Cadherin下調(diào)、N- Cadherin和Vimentin等間質(zhì)表型特征分子表達(dá)上調(diào)為特征，是腫瘤細(xì)胞獲得侵襲與轉(zhuǎn)移能力的有效方式之一[13- 14]。本研究運(yùn)用Western blot法顯示抑制Gli1和Gli2表達(dá)后E- Cadherin表達(dá)上調(diào)，N- Cadherin表達(dá)下調(diào)；Transwell實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步說明了沉默Gli1、Gli2表達(dá)后穿膜細(xì)胞數(shù)明顯減少，結(jié)果表明通過抑制Hh/Gli通路可以抑制肺鱗癌細(xì)胞的上皮- 間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，進(jìn)而限制了腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移，而Chen等[15]研究已經(jīng)證實(shí)了在肝癌細(xì)胞中可以通過下調(diào)Gli1而阻止上皮- 間質(zhì)轉(zhuǎn)化的過程。

本研究結(jié)果提示，Gli基因的表達(dá)下調(diào)可能通過調(diào)節(jié)Cyclin D1、Cyclin E使細(xì)胞更多的阻滯在G0/G1期，進(jìn)而延緩腫瘤細(xì)胞增殖，并且Gli基因的表達(dá)下調(diào)還可以抑制上皮- 間質(zhì)轉(zhuǎn)化的過程進(jìn)而限制腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移，這為以后抗腫瘤的治療提過了更多的依據(jù)。

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Effect of silencing Gli with small interfering RNA on the malignant biological behavior of lung squamous carcinoma SK- MES- 1 cells

MI Yuan1，DU Yuan- kun2，LIU Qing- yi1，LIAO Hai- jiang1，WANG Lin1，WANG Lei1

(1.DepartmentofThoracicSurgery，theFourthHospitalofHebeiMedicalUniversity，Shijiazhuang050011，China;2.DepartmentofPeriodicalMagazine，HebeiMedicalUniversity，Shijiazhuang050017，China)

Objective： To detect the expression of Gli in lung squamous carcinoma， and to analyze the effects of down- regulation of Gli expression on malignant biological behavior of lung squamous carcinoma SK- MES- 1 cells and to explore their molecular mechanisms. Methods： Gli1， Gli2 siRNA and control siRNA were transfected into SK- MES- 1 cells for 48 h respectively. The Gli- 1， Gli- 2 mRNA expression were detected by real time fluorescence quantitative PCR method. The protein expression of Gli- 1， Gli- 2， Cyclin D1， CyclinE， N- cadherin and E- cadherin were detected by Western blot assay. The cell cycle were observed by flow cytometry. Transwell assay was performed to detect cell invasion ability. Results： Compared with Control siRNA， Gli1 & Gli2 siRNA could significantly inhibit the Gli- 1， Gli- 2 mRNA and protein expression in SK- MES- 1 cells， which at last downregulated the CyclinD1， CyclinE， N- cadherin protein expression， and enhanced E- cadherin expression. Downregulation of Gli- 1， Gli- 2 could arrest cell cycle at G0/G1 phase and decrease cell invasion ability(P<0.01). Conclusion： Gli may play an important role in the development of lung squamous carcinoma. The downregulation of Gli expression can lead to changes in the cell cycle and invasion of lung squamous carcinoma， which may be associated with Cyclin D1， Cyclin E， N- cadherin and E- cadherin proteins．

lung squamous carcinoma; Gli; cell cycle; epithelial- mesenchymal transition

2016- 03- 21

2016- 07- 14

米源(1990-)，男，河北廊坊人，在讀碩士研究生。E- mail:394034007@qq.com

米源，杜媛鯤，劉慶熠，等.siRNA下調(diào)Gli基因表達(dá)對肺鱗癌SK- MES- 1細(xì)胞生物學(xué)行為的影響[J].東南大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版,2016,35(6)：908- 913.

R734.2

A

1671- 6264(2016)06- 0908- 06

10.3969/j.issn.1671- 6264.2016.06.016