殷小偉，盧緒章，毛正道，張倩，曹琦，黃燕華

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州第二人民醫(yī)院 1.呼吸科，2.血液科，江蘇 常州 213161)

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·論 著·

肺癌細(xì)胞中NKG2D配體MICA及ULBP高表達(dá)及其在CIK介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞殺傷中的作用

殷小偉1，盧緒章2，毛正道1，張倩1，曹琦1，黃燕華1

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州第二人民醫(yī)院 1.呼吸科，2.血液科，江蘇 常州 213161)

目的:探索肺癌細(xì)胞中NKG2D配體的表達(dá)量及其與CIK細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞毒性的關(guān)系。方法:在肺癌組織、癌旁組織及肺癌細(xì)胞株中用實(shí)時(shí)熒光定量PCR及蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)NKG2D配體的表達(dá)量。應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)腫瘤細(xì)胞株A549和QG56表面NKG2D配體的表達(dá)情況。體外分離培養(yǎng)CIK細(xì)胞，比較NKG2D單克隆抗體預(yù)處理CIK細(xì)胞和無(wú)NKG2D單克隆抗體預(yù)處理CIK細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞毒性。結(jié)果:NKG2D在肺癌組織及肺癌細(xì)胞株中高表達(dá)。CIK細(xì)胞對(duì)肺癌細(xì)胞株A549表現(xiàn)出較強(qiáng)的細(xì)胞毒性，但用NKG2D單克隆抗體預(yù)處理CIK細(xì)胞后可顯著降低這種作用(P<0.05)。結(jié)論:NKG2D配體在肺癌組織和肺癌細(xì)胞株中高表達(dá)。對(duì)于CIK細(xì)胞介導(dǎo)的肺癌細(xì)胞殺傷作用，NKG2D與其配體的相互作用至關(guān)重要。

肺癌； NKG2D配體； CIK細(xì)胞； MICA/B

肺癌是最常見(jiàn)的危害人類健康的惡性腫瘤之一，近年來(lái)，世界各國(guó)肺癌的發(fā)生率和死亡率均呈上升趨勢(shì)，每年約有130萬(wàn)人死于肺癌[1]。近20年來(lái)，隨著對(duì)肺癌研究的深入，一些分子靶向藥物應(yīng)用于臨床，在部分肺癌患者的治療方面獲得一定成效，但總體5年生存率仍然低于15%[2]。目前人們已經(jīng)認(rèn)識(shí)到，腫瘤的發(fā)生發(fā)展與機(jī)體免疫狀態(tài)尤其是細(xì)胞免疫密切相關(guān)，因此隨著多學(xué)科治療模式的逐步形成，免疫治療作為繼手術(shù)、化療及放療后的第4種腫瘤治療手段受到人們的廣泛關(guān)注，能否通過(guò)生物免疫的方法治療肺癌同樣值得研究。

腫瘤生物免疫治療主要是通過(guò)免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別和殺傷。免疫細(xì)胞可以通過(guò)分泌細(xì)胞因子促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，還可以通過(guò)免疫細(xì)胞表面的活化性受體識(shí)別腫瘤細(xì)胞表面相應(yīng)的配體對(duì)腫瘤細(xì)胞實(shí)施殺傷[3- 5]。目前細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷(cytokine induced killer，CIK)細(xì)胞輸注被廣泛應(yīng)用于腫瘤的治療并取得一定的臨床效果[6- 7]。CIK細(xì)胞是骨髓或者外周血來(lái)源的多克隆淋巴細(xì)胞，包括NK細(xì)胞、T細(xì)胞和NKT細(xì)胞。NKG2D的受體和配體相互作用，可以激活免疫細(xì)胞介導(dǎo)的殺傷作用，同時(shí)NKG2D還可以作為協(xié)同刺激分子增強(qiáng)T細(xì)胞受體的信號(hào)傳導(dǎo)，從而介導(dǎo)T細(xì)胞殺傷腫瘤的作用[8]。NKG2D和其相應(yīng)的配體相互作用介導(dǎo)的免疫系統(tǒng)反應(yīng)在調(diào)節(jié)主動(dòng)免疫和特殊免疫中起重要作用，對(duì)腫瘤及病原體有重要的免疫監(jiān)督作用。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)NKG2D特異的配體分子主要包括MICA/B和ULBPs兩類，是NKG2D發(fā)揮殺傷活性的主要配體[9]。本研究旨在探索肺癌細(xì)胞中NKG2D配體的表達(dá)量及其與CIK細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞毒性的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本收集

本研究獲得常州第二人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。所有患者均簽署書(shū)面的知情同意書(shū)。肺癌病人經(jīng)常州第二人民醫(yī)院病理科確診，無(wú)其它特殊的納入及排除標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 細(xì)胞株

肺癌細(xì)胞株A549和QG56購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)(上海，中國(guó))。用含10%胎牛血清(Gibco，USA)的DMEM高糖培養(yǎng)基(Hyclone，USA)于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞。

1.3 CIK細(xì)胞培養(yǎng)

采用密度梯度離心法分離人外周血單核細(xì)胞(PBMCs)，CIK細(xì)胞的具體培養(yǎng)參照本課題組發(fā)表的實(shí)驗(yàn)方法[10]。PBMCs采用RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，加入10% 胎牛血清和1000 U·ml-1γ干擾素(IFNγ;PROSPEC，USA)。培養(yǎng)24 h后加入50 ng·ml-1人源 抗- CD3 單克隆抗體(武漢生物制品研究所，武漢，中國(guó))和1000 U·ml-1重組人白細(xì)胞介素- 2(rhIL- 2;PROSPEC，USA)。細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中每隔3 d在原培養(yǎng)瓶中加入配制好的新鮮培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng)3周后收集CIK細(xì)胞。

1.4 RNA提取與實(shí)時(shí)熒光定量PCR

采用Trizol(Invitrogen，USA)法提取臨床組織RNA，抽提所得RNA參照Superscript Ⅱ Reverse Transcriptase(Invitrogen，Carlsbad，CA)說(shuō)明逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA并于-20℃長(zhǎng)期保存。根據(jù)NCBI提供基因序列，用Primer5設(shè)計(jì)引物序列，MICA正向引物5′- GAGCTCCCAGCATTCTACTAC- 3′，MICA反向引物 5′- GGTGTCGTGGCTCAAAGATA- 3′；ULBP2正向引物 5′- GAGAGGTGGTGGACATACTTAC- 3′，ULBP2反向引物5′- CAAGCCATCCTATACAGTCTCC- 3′;GAPDH 正向引物5′- CTATTCGATGCCGTGTATGC- 3′，GAPDH反向引物5′- GCCTGGTCCAGACTTCTTTC- 3′。引物序列送由上海生工生物工程股份有限公司(上海，中國(guó))合成。

1.5 Western- blot檢測(cè)組織中相關(guān)蛋白表達(dá)

提取肺癌及癌旁組織蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。運(yùn)用10%聚丙烯酰胺凝膠(SDS- PAGE)電泳分離蛋白，PVDF膜轉(zhuǎn)膜后5%脫脂牛奶封閉。用含一抗MICA(1∶500;Abcam Inc，USA)，β- actin(1∶10000;Cell Signaling Inc，USA) 稀釋液于4℃孵育過(guò)夜。用TBST洗滌膜5次，用含羊抗兔二抗(1∶6000;Santa Cruz Biotechnology，USA) 和羊抗鼠二抗(1∶10000;Santa Cruz Biotechnology，USA)稀釋液室溫孵育2h。應(yīng)用ECL化學(xué)發(fā)光顯色，Image J進(jìn)行灰度值分析，以β- actin為內(nèi)參進(jìn)行灰度分析。

1.6 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

A549和QG56細(xì)胞株分別與0.1μmol·L-1CAM(Calcein Acetoxymethyl Ester，Sigma Aldrich，USA)于37℃下避光共孵育15 min，然后用含10%胎牛血清的培養(yǎng)基洗兩遍。含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按照一定比例種植于96孔板中。按照Effector- To- Target比(E∶T)為10的比例添加CIK細(xì)胞，終體積為 200μl。共培養(yǎng)細(xì)胞體系于37℃避光孵育10h，PBS洗滌細(xì)胞5次，用100μl結(jié)合緩沖液(10mmol·L-1HEPES/NaOH，140mmol·L-1NaCl，2.5mmol·L-1CaCl2，pH7.4)重懸細(xì)胞，加入10μl 7- Amino- actinomycin D(7- AAD;Molecular Probes，USA)混勻。室溫避光孵育10 min后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。CIK對(duì)靶細(xì)胞的殺傷作用用特異性裂解率來(lái)表示，計(jì)算公式為：特異性裂解率=(CT- TE/CT)×100%，CT為無(wú)CIK細(xì)胞時(shí)的活靶細(xì)胞百分比，TE為CIK細(xì)胞與靶細(xì)胞共孵育后的活細(xì)胞百分比。在NKG2D阻滯實(shí)驗(yàn)中，CIK細(xì)胞與10μg·ml-1抗- NKG2D抗體37℃共孵育30 min后將其加入靶細(xì)胞中。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞株中NKG2D配體表達(dá)

收集細(xì)胞，MICA/B(Clone 6D4，eBioscience，USA) 和ULBP1，ULBP3和ULBP2(R&D Systems，USA)分別與細(xì)胞共孵育30 min，流式細(xì)胞儀(BD FACS Canto Ⅱ)檢測(cè)細(xì)胞株NKG2D配體表達(dá)。結(jié)果采用 FlowJo 軟件(Tri Star，Inc.，Ashland，USA)進(jìn)行分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)至少3次，應(yīng)用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)或單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 NKG2D配體在癌組織中高表達(dá)

采用qRT- PCR檢測(cè)NKG2D配體在24例肺癌組織及5例正常組織中的表達(dá)，結(jié)果顯示，與正常組相比NKG2D配體MICA和ULBP2在肺癌組織中顯著高表達(dá)，平均上調(diào)倍數(shù)為5.5(P<0.05，圖1A)。同時(shí)Western- blot檢測(cè)肺癌組織及正常組織中MICA蛋白表達(dá)，與正常組相比，肺癌組織中MICA蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，平均上調(diào)倍數(shù)為3.5(P<0.05，圖1B、C)。

A. 肺癌組與正常組NKG2D配體相對(duì)表達(dá)量

B. 蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)MICA蛋白表達(dá)

C. 肺癌組與正常組MICA蛋白相對(duì)表達(dá)量

與正常組比較，aP<0.05

圖1 NKG2D配體MICA和ULBP2在肺癌組織及正常組織中的蛋白和基因表達(dá)

2.2 NKG2D配體在肺癌細(xì)胞株中的表達(dá)

培養(yǎng)肺癌細(xì)胞株A549和QG56，流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)細(xì)胞表面NKG2D配體表達(dá)。肺癌細(xì)胞株A549和QG56中均表達(dá)NKG2D和HLA Ⅰ類分子，且MICA分子在A549細(xì)胞株中的表達(dá)量較QG56高(圖2、表1)。

圖2 NKG2D配體在肺癌細(xì)胞株中的表達(dá)

表1 肺癌細(xì)胞株中NKG2D配體表達(dá) MFI

細(xì)胞株NKG2D配體MICAULBP1ULBP2ULBP3QG561212.59.084.42A5493152.39.584.09

MFI:平均熒光密度;MICA:MHC- Ⅰ related molecules A;ULBP2，3：UL16- binding protein 2，3;自定義MFI值小于10為陰性不表達(dá)

2.3 ULBP2及MICA在A549和QG56中差異表達(dá)

培養(yǎng)肺癌細(xì)胞株，采用qRT- PCR檢測(cè)NKG2D配體的表達(dá)。結(jié)果顯示A549細(xì)胞株中MICA的mRNA表達(dá)量顯著高于QG56，而ULBP2在兩細(xì)胞株中的表達(dá)無(wú)顯著差異(圖3)。

2.4 NKG2D與CIK介導(dǎo)的肺癌細(xì)胞溶解相關(guān)

CIK細(xì)胞對(duì)A549表現(xiàn)出較強(qiáng)的細(xì)胞殺傷作用，細(xì)胞殺傷率達(dá)60%。但是NKG2D單克隆抗體預(yù)處理CIK細(xì)胞后，CIK細(xì)胞的這種殺傷作用顯著降低，殺傷率僅達(dá)30%(P<0.05，圖4)。

3 討 論

NKG2D配體在正常機(jī)體組織中很少表達(dá)，但是在毒物刺激、感染、腫瘤惡性轉(zhuǎn)化等條件下誘導(dǎo)表達(dá)[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，相比于癌旁組織，肺癌組織中NKG2D配體的表達(dá)量顯著升高。NKG2D配體廣泛表達(dá)于腫瘤細(xì)胞膜上。有證據(jù)表明，在多種腫瘤細(xì)胞中，NKG2D能觸發(fā)免疫細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用[12- 13]，但NKG2D介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用除了需要免疫細(xì)胞表達(dá)NKG2D受體外，還需要靶細(xì)胞(腫瘤細(xì)胞)表達(dá)NKG2D配體[14]。

與A549細(xì)胞株比較，aP<0.05

圖3 MICA和ULBP2在肺癌細(xì)胞株中基因表達(dá)差異

圖4 NKG2D在CIK介導(dǎo)的肺癌細(xì)胞溶解中的作用

CIK細(xì)胞是骨髓或者外周血來(lái)源的多克隆淋巴細(xì)胞，包括NK細(xì)胞、T細(xì)胞和NKT細(xì)胞。NKG2D是一種表達(dá)在免疫效應(yīng)細(xì)胞表面的活化性受體，主要表達(dá)在NK細(xì)胞、γδT細(xì)胞及NKT細(xì)胞[15]。我們前期運(yùn)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)大多數(shù)(86.32%±4.75%)培養(yǎng)的CIK 細(xì)胞表達(dá) NKG2D受體[16]。研究表明NKG2D配體決定了免疫細(xì)胞的不同作用效果[14]。本研究發(fā)現(xiàn)NKG2D配體表達(dá)于肺癌細(xì)胞株 A549細(xì)胞表面。此外，病人肺癌組織中NKG2D配體和UBP2高表達(dá)可能在腫瘤細(xì)胞被免疫細(xì)胞識(shí)別中發(fā)揮了重要作用。體外實(shí)驗(yàn)表明,CIK對(duì)A549細(xì)胞具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性作用，但這種作用可以被NKG2D抗體部分阻斷。這些研究結(jié)果提示，NKG2D與其配體的相互作用在CIK細(xì)胞對(duì)肺癌細(xì)胞的識(shí)別和殺傷過(guò)程中起到了非常重要的作用。

綜上所述，本研究證實(shí)NKG2D配體在肺癌組織和肺癌細(xì)胞株中高表達(dá)。對(duì)于CIK細(xì)胞介導(dǎo)的肺癌細(xì)胞殺傷作用，NKG2D與其配體的相互作用至關(guān)重要。

[1] JEMAL A，SIEGEL R，WARD E，et al.Cancer statistics，2009[J].CA Cancer J Clin，2009，59(4):225- 249．

[2] YOULDEN D R，CRAMB S M，BAADE P D.The international epidemiology of lung cancer:geographical distribution and secular trends[J].J Thorac Oncol，2008，3(8):819- 831．

[3] LJUNGGREN H G，MALMBERG K J.Prospects for the use of NK cells in immunotherapy of human cancer[J].Nat Rev Immunol，2007，7(5):329- 339．

[4] 蔡楓，何貞月，姜婷婷，等.腫瘤微環(huán)境中的樹(shù)突狀細(xì)胞及其在腫瘤治療中的作用[J].東南大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2012，31(2):225- 229．

[5] 李紅英，王蓉，汪蕾.沉默microRNA- 20a對(duì)乳腺癌MCF7細(xì)胞表達(dá)NK細(xì)胞活化性受體配體MICA的研究[J].現(xiàn)代醫(yī)學(xué)，2014，42(1):22- 25．

[6] LINN Y C，LAU L C，HUI K M.Generation of cytokine- induced killer cells from leukaemic samples withinvitrocytotoxicity against autologous and allogeneic leukaemic blasts[J].Br J Haematol，2002，116(1):78- 86．

[7] HONTSCHA C，BORCK Y，ZHOU H，et al.Clinical trials on CIK cells:first report of the international registry on CIK cells(IRCC)[J].J Cancer Res Clin Oncol，2010，137(2):305- 310．

[8] MORETTA A，BOTTINO C，VITALE M，et al.Activating receptors and coreceptors involved in human natural killer cell- mediated cytolysis[J].Annu Rev Immunol，2001，19：197- 223．

[9] EAGLE R A，TROWSDALE J.Promiscuity and the single receptor:NKG2D[J].Nat Rev Immunol，2007，7(9):737- 744．

[10] LINN Y C，LAU S K，LIU B H，et al.Characterization of the recognition and functional heterogeneity exhibited by cytokine- induced killer cell subsets against acute myeloid leukaemia target cell[J].Immunology，2009，126(3):423- 435．

[11] WANG Q J，HANADA K，YANG J C.Characterization of a novel nonclassical T cell clone with broad reactivity against human renal cell carcinomas[J].J Immunol，2008，181(6):3769- 3776．

[12] ZAFIROVA B，WENSVEEN F M，GULIN M，et al.Regulation of immune cell function and differentiation by the NKG2D receptor[J].Cell Mol Life Sci，2011，68(21):3519- 3529．

[13] CHAMPSAUR M，LANIER L L.Effect of NKG2D ligand expression on host immune responses[J].Immunol Rev，2010，235(1):267- 285.

[14] FUERTES M B，GIRART M V，MOLINERO L L，et al.Intracellular retention of the NKG2D ligand MHC class I chain- related gene A in human melanomas confers immune privilege and prevents NK cell- mediated cytotoxicity[J].J Immunol，2008，180(7):4606- 4614．

[15] OGASAWARA K，LANIER L L.NKG2D in NK and T cell- mediated immunity[J].J Clin Immunol，2005，25(6):534- 540．

[16] 何金媛，賈祝霞，蔡曉輝，等.NKG2D 在細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷性細(xì)胞(CIK)抗血液腫瘤細(xì)胞的作用[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志，2013，21(6):1380- 1384．

High expression level of NKG2D ligands MICA and ULBP in lung cancer cell and the role in CIK mediated cytotoxicity

YIN Xiao- wei1，LU Xu- zhang2，MAO Zheng- dao1，ZHANG Qian1，CAO Qi1，HUANG Yan- hua1

(1.DepartmentofRespiratory， 2.DepartmentofHematology，ChangzhouNo.2People’sHospital，theAffiliatedHospitalofNanjingMedicalUniversity，Changzhou213161，China)

Objective： To identify the expression level of NKG2D ligands in lung cancer cell and the interaction between NKG2D and NKG2D ligands in the CIK mediated cytotoxicity against tumor cells. Methods: We used RT- PCR and Western- blot to detect the expression level of NKG2D ligands in lung cancer tissue，para- carcinoma tissues and cell lines.The expression of NKG2D ligands in the surface of lung cancer cell lines was determined by flow cytometry.CIK cells were isolated and culturedinvitro.The anti- NKG2D mAbs treated CIK and non- anti- NKG2D mAbs treated CIK cells mediating cytotoxicity against A549 was determined by flow cytometry also. Results: NKG2D ligands highly expressed in lung cancer cells.The CIK cells caused cytolysis against the A549，but this cytolysis was decreased(30%±3.2%) by pretreatment of CIK cells with anti- NKG2D mAbs. Conclusion: The present study demonstrates the higher expression level of NKG2D ligands in lung cancer tissue than para- carcinoma tissue.The killing effect of lung cancer cells by CIK cell is partially mediated by NKG2D- NKG2D ligand interaction.The interaction between NKG2D and NKG2D ligands play a vital role in the CIK mediated tumor cell killing.

lung cancer; NKG2D ligands; CIK cells; MICA/B

2016- 05- 12

2016- 09- 01

南京醫(yī)科大學(xué)重點(diǎn)醫(yī)學(xué)項(xiàng)目(2012NJMU126)

殷小偉(1969-)，男，江蘇常州人，主任醫(yī)師。E- mail：xiaoweiyinhuxi@163.com

盧緒章 E- mail：luxuzhang2008@163.com

殷小偉，盧緒章，毛正道，等.肺癌細(xì)胞中NKG2D配體MICA及ULBP高表達(dá)及其在CIK介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞殺傷中的作用[J].東南大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2016，35(6)：861- 865.

R734.2

A

1671- 6264(2016)06- 0861- 05

10.3969/j.issn.1671- 6264.2016.06.007