溫聰聰，梁世凱，曹美嬌，王 巍

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連 116600)

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訶子炮制前后多糖的含量變化研究*

溫聰聰，梁世凱，曹美嬌，王 巍

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連 116600)

采用苯酚-硫酸法測定了訶子炮制前后多糖的含量變化情況，為研究訶子“煨熟固腸止瀉”的炮制原理提供理論依據(jù)。方法學(xué)考察結(jié)果顯示葡萄糖質(zhì)量濃度在4.028～16.11 μg/ mL濃度與吸光度具有良好的線性關(guān)系；平均回收率為97.3%，RSD=1.3%(n=6)。使用該方法測得的不同產(chǎn)地訶子藥材生品中多糖含量在4.35%～10.64%，制品中多糖含量在5.17%～10.79%。結(jié)果表明炮制后訶子中多糖含量略有增高。

訶子；炮制；多糖；苯酚-硫酸法

訶子為使君子科植物訶子TerminaliachebulaRetz.及絨毛訶子TerminaliachebulaRetz. var. tomentella Kurt.的干燥成熟果實，收載于《中國藥典》2015年版一部[1]。在傳統(tǒng)中醫(yī)應(yīng)用中，訶子存在生熟異用現(xiàn)象，《本經(jīng)逢原》中就有“訶子苦澀降斂，生用清金止嗽，煨熟固腸止瀉”的記載[2]。現(xiàn)代臨床上訶子多為制后使用，治療久瀉、痢疾、腸風(fēng)瀉血等[3]，即中醫(yī)的“腸澼”，與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的潰瘍性結(jié)腸炎(UC)相對應(yīng)[4]。藥理學(xué)研究表明多糖類成分可以通過調(diào)節(jié)結(jié)腸黏膜細(xì)胞因子的表達，減輕腸道局部免疫反應(yīng)，對UC起到治療作用[5-8]。本文擬建立訶子多糖的含量測定方法，并檢測炮制前后多糖含量的變化，為合理解釋訶子“煨熟固腸止瀉”的炮制原理提供理論依據(jù)，并為進一步炮制工藝的優(yōu)化奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀 器

ETTLER AE240型十萬分析天平，瑞士METTLER，ALC-110.4型分析天平，德國艾科勒公司；HH-4型恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司，UV-3010型紫外分光光度計，日本日立公司。

1.2 試劑與試藥

訶子購自藥材市場，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)鑒定教研室翟延君教授鑒定，均為使君子科植物訶子TerminaliachebulaRetz.。D-無水葡萄糖對照品購自中國藥品生物制品檢定所(批號：110833-201503，供含量測定用)，乙醇、石油醚、氯仿、正丁醇、苯酚、濃硫酸均為分析純，購自天津科密歐化學(xué)試劑有限公司，水為純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 訶子多糖的提取與精制

取藥材(S5)適量，砸碎，取果肉，粉碎，過40目篩，稱取樣品粉末10 g，置于圓底燒瓶中，加入石油醚(60～90 ℃)100 mL，回流提取2次，每次30 min，傾出石油醚液，藥渣揮干石油醚后加入蒸餾水100 mL，回流提取2次，每次2 h，合并提取液，減壓濃縮，濃縮液中加入95%乙醇調(diào)含醇量至85%，抽濾，濾渣真空干燥后即得粗多糖。粗多糖加蒸餾水復(fù)溶后經(jīng)過Sevag試劑(氯仿:正丁醇 5:1)除蛋白，脫蛋白后的多糖溶液中加入乙醇調(diào)含醇量為85%，沉淀用乙醇反復(fù)洗滌，干燥，得精制多糖干燥物。

2.2 供試品制備及試劑配制

2.2.1 對照品溶液制備

取105 ℃干燥至恒重的無水葡萄糖約10 mg，精密稱定，置100 mL量瓶中，加適量水溶解，并稀釋至刻度，搖勻，即得0.1007 mg/mL的葡萄糖對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液制備

取訶子藥材適量，砸碎，取果肉粉碎，過40目篩，取粉末0.1 g，精密稱定，置于圓底燒瓶中，加入40 mL 80%乙醇，加熱回流1 h，抽濾，用少量熱80%乙醇洗滌2次。濾渣在常溫下?lián)]干，將濾渣連同濾紙置燒瓶中，加蒸餾水40 mL，加熱回流1 h，趁熱濾過，用少量熱水洗滌濾器，合并濾液與洗液，放冷，移入50 mL量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.3 苯酚液的制備

取苯酚100 g，加鋁片0.1 g，碳酸氫鈉0.05 g，蒸餾。收集182 ℃攝氏度餾分5 g，置100 mL量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻后，濾過至棕色試劑瓶中，得5%苯酚液，置冰箱中儲存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 樣品測定方法

精密吸取供試品溶液2 mL，置于10 mL刻度試管中，精密加入5%苯酚液1.0 mL，搖勻，再加入濃硫酸6 mL，搖勻，放置5 min，再置沸水浴中保溫5 min，取出冷卻至室溫，加水至10 mL，于486 nm處測定吸光度。

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

精密吸取葡萄糖對照品溶液0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL、1.4 mL、1.6 mL，分別置于10 mL刻度試管中，分別加水至2 mL，再按2.3項下方法操作，于486 nm處測定吸光度值，以葡萄糖濃度C為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得回歸方程：A=45.804C-0.0054，r=0.9992，表明樣品在0.004028～0.016112 mg/mL與吸光度線性關(guān)系良好。2.4.2 換算因子測定

取2.1項下所制得的訶子精制多糖20 mg，精密稱定，置100 mL量瓶中，加蒸餾水溶解并稀釋至刻度，搖勻，得濃度為0.2005 mg/mL的訶子粗多糖溶液。取該溶液2.0 mL，按2.3項下方法測定吸光度，重復(fù)5次。由回歸方程求出訶子精制多糖溶液中葡萄糖濃度，并計算其中葡萄糖的含量，按下式計算換算因子：

f=W/(C×D)

式中：W——訶子精制多糖的質(zhì)量，mgC——訶子精制多糖溶液中葡萄糖濃度，mg/mLD——訶子多糖的稀釋因數(shù)

根據(jù)吸光度的5次測定值求得f為3.333。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 精密度考察

精密吸取精制多糖溶液2 mL，按2.3項下方法顯色，連續(xù)測定6次，分別記錄吸光度值，計算RSD值為0.7%，表明儀器精密度良好。

2.5.2 穩(wěn)定性考察

(1)清萬樹《詞律》中載《卜算子》調(diào)9體[注]柳永與張先的名為《卜算子》的詞作，實則是《卜算子慢》，且柳永之作為《卜算子慢》正體。[1]118-121

精密吸取精制多糖溶液2 mL，按2.3項下方法顯色，分別于反應(yīng)后0、20、40、60、80、100、120 min時測定吸光度值，計算RSD值為1.2%，表明樣品顯色后2 h內(nèi)顏色穩(wěn)定，適宜測定。

2.5.3 重復(fù)性考察

取樣品(S5)粉末6份，每份0.1 g，精密稱定，按2.2項下方法制備供試品溶液，再按2.3項下方法測定吸光度，分別計算多糖含量并計算RSD值。結(jié)果樣品中多糖平均含量為4.887%，RSD值為1.8%，表明方法重復(fù)性良好。

2.5.4 回收率考察

取已知準(zhǔn)確含量(4.89%)的樣品(S5)6份，每份0.05 g，精密稱定，再加入葡萄糖對照品約2.4 mg，按2.2項下方法制備供試品溶液，再按2.3項下方法測定吸光度，計算回收率及RSD值。結(jié)果表明回收率均在95.0%～105.0%之間，RSD值亦符合相關(guān)規(guī)定。結(jié)果見表1。

表1 回收率考察結(jié)果

2.6 樣品含量測定

取不同產(chǎn)地訶子生品及炮制品(將藥材與麥麩以100:40投入鍋中，控制溫度為130～150 ℃，翻炒20 min)按2.2項下方法制備供試品溶液，再按2.3項下方法測定吸光度，根據(jù)回歸方程求出供試品中葡萄糖的濃度，按下式計算出多糖含量，結(jié)果見表2。

多糖含量=(C×D×f/W)×100%。

式中：C——供試品溶液中葡萄糖的濃度，mg/mLD——樣品溶液的稀釋倍數(shù)f——換算因子W——樣品質(zhì)量，mg

表2 不同產(chǎn)地訶子多糖含量測定結(jié)果

3 討論與結(jié)論

3.1 供試品溶液制備方法考察

試驗中對供試品溶液制備方法進行了考察[9-10]，以S5樣品為研究對象，首先比較了回流提取與超聲提取的所得總多糖含量，回流提取為5.18%，超聲提取為4.32%，證明回流提取的提取效率更高；然后對醇提后蒸餾水回流提取時間進行考察，比較了提取20 min、40 min、60 min、90 min所得多糖含量，分別為4.56%、4.88%、5.21%、5.23%，證明提取60 min時多糖已基本提取完全。經(jīng)考察確定供試品制備方法為現(xiàn)用80%乙醇回流提取1 h后，在采用蒸餾水回流提取1 h。

3.2 樣品測定方法考察

試驗中先后對5%苯酚加入量、硫酸加入量、水浴溫度、水浴時間進行考察[9-10]，結(jié)果表明在加入5%苯酚液1.0 mL、濃硫酸6 mL、沸水浴保溫5 min的條件下吸光度值最高，測定最靈敏。以精制多糖為研究對象，按確定的方法進行顯色，以蒸餾水作為空白，掃描200～800 nm的吸收光譜，結(jié)果在486 nm處為最大吸收，因此確定檢測波長為486 nm。

訶子中化學(xué)成分以鞣質(zhì)類為主，應(yīng)是訶子治療UC的主要有效成分，但中藥的特點是多種成分發(fā)揮協(xié)同治療作用，而且現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明多糖類成分卻有治療UC的作用，因此若研究訶子煨后治療UC的有效物質(zhì)，多糖類應(yīng)是主要研究目標(biāo)之一。

本文建立了訶子多糖的含量測定條件，對建立的方法進行方法學(xué)考察，各項指標(biāo)均符合含量測定的要求，證明該方法可準(zhǔn)確測定訶子中多糖的含量。用該方法對8個不同來源的訶子藥材進行炮制前后多糖含量的比較，結(jié)果表明8個樣品炮制后多糖含量均有不同程度的增高，考慮炮制后多糖含量的變化可能是其煨后固腸止瀉作用增強的原因之一。

[1] 中華人民共和國衛(wèi)生部藥典委員會.中國藥典[S].一部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：173.

[2] 江蘇新醫(yī)學(xué)院. 中藥大辭典(上冊)[M]. 上海: 上海人民出版社, 1977: 1174-1176.

[3] 史欣德，石歷聞. 從220首古方看訶子效用[J].中醫(yī)研究, 1996, 9(4):41-44.

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Study on Change of Content of Polysaccharides in Crude and ProcessedTerminaliachebulaRetz.*

WENCong-cong,LIANGShi-kai,CAOMei-jiao,WANGWei

(School of Pharmacy, Liaoning University of TCM, Liaoning Dalian 116600, China)

The change of the content of polysaccharides in crude and processedTerminaliachebulaRetz.was determined by phenol-sulfuric acid method, to explain the effect of strengthening the Astringent to the intestine and relieve diarrhea after bran-roasted. Methodology study results showed that glucose showed a good linear relationship in the range of 4.028～516.11 μg/mL (r=0.999 2,n=6) and the average recovery of glucose was 97.3%, RSD was 1.3% (n=6). The content of polysaccharides in the crude and processedTerminaliachebulaRetz. were 4.35%～10.64% and 5.17%～10.79%, respectively. The experimental results showed that the content of polysaccharide inTerminaliachebulaRetz. increased slightly after processing.

TerminaliachebulaRetz.; processing; polysaccharide; phenol-sulfuric acid method

遼寧省博士啟動基金(NO. 201501097)。

溫聰聰(1994-)，男，碩士研究生，從事中藥分析及新藥開發(fā)研究。

R284.1

A

1001-9677(2016)023-0057-03