胡 蓉，高 杰，梁雅茹，黃 悅，李 紅，蘇 敏

(貴州醫(yī)科大學(xué)組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，貴陽 550004)

?

·技術(shù)與方法·

以羊膜為載體體外培養(yǎng)大鼠角膜緣干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究*

胡 蓉，高 杰，梁雅茹，黃 悅，李 紅，蘇 敏△

(貴州醫(yī)科大學(xué)組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，貴陽 550004)

目的 比較角膜緣干細(xì)胞(LSCs)在不同羊膜上的生長情況，尋求LSCs體外培養(yǎng)的最佳載體。方法 取健康剖宮產(chǎn)孕婦胎盤的羊膜組織，分別制備保留上皮的新鮮羊膜、去除上皮的新鮮羊膜和冷凍羊膜。消化法分離大鼠LSCs后將其按相同濃度分別種植于3種事先準(zhǔn)備好的羊膜載體和無載體孔中，分為4組。實(shí)驗(yàn)1組：保留上皮的新鮮羊膜組；實(shí)驗(yàn)2組：去除上皮的新鮮羊膜組；實(shí)驗(yàn)3組：去除上皮的冷凍羊膜組；對照組：無羊膜載體組。4組細(xì)胞分別作細(xì)胞凋亡檢測，p63、PCNA免疫熒光檢測，檢測陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)。結(jié)果 培養(yǎng)第3天，3個(gè)實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)的細(xì)胞排列緊密，融合形成單層，其中可見大小不等的團(tuán)塊狀集落，細(xì)胞大小基本一致，多呈圓球形或卵圓形。對照組培養(yǎng)的細(xì)胞排列相對稀疏，基本融合，形成單層，可見散在的、大小不等的桑葚樣細(xì)胞集落，集落細(xì)胞的生長特征及形態(tài)特點(diǎn)與實(shí)驗(yàn)組相似。實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞凋亡率均低于對照組，p63陽性率和PCNA陽性率均高于對照組(P<0.01)，尤以實(shí)驗(yàn)1組變化最為明顯(P<0.01)。結(jié)論 羊膜載體有利于體外培養(yǎng)大鼠LSCs的擴(kuò)增，保留上皮的新鮮羊膜能更好地維持體外培養(yǎng)LSCs的特性，是體外角膜緣干細(xì)胞培養(yǎng)的理想載體。

角膜緣；干細(xì)胞；羊膜；染色與標(biāo)記；角膜；細(xì)胞凋亡；p63；PCNA

正常角膜表面由角膜上皮細(xì)胞覆蓋，表層上皮細(xì)胞不斷脫落死亡，同時(shí)基底層的細(xì)胞不斷增殖以取代表層上皮細(xì)胞。角膜上皮的完整性依賴于這一動態(tài)平衡過程。體外培養(yǎng)的角膜緣干細(xì)胞(limbal stem cells，LSCs)移植被認(rèn)為是目前針對眼表疾病最有前景的治療方法之一[1-3]。大量實(shí)驗(yàn)表明羊膜是LSCs體外培養(yǎng)的良好底物，是干細(xì)胞體外培養(yǎng)和臨床移植研究的首選載體[4-6]。盧建民等[7]研究報(bào)道，將人羊膜上皮細(xì)胞移植到兔角膜緣干細(xì)胞缺乏性功能障礙(LSCD)模型眼上可抑制新生血管，減輕角膜混濁。以羊膜為載體的LSCs體外培養(yǎng)方法的建立，目前主要集中在新鮮羊膜或低溫冷凍保存羊膜的使用。對于何種羊膜載體在LSCs培養(yǎng)中更有利于LSCs的生長目前尚需進(jìn)一步研究。故本研究擬探討用不同羊膜為載體體外培養(yǎng)LSCs的方法，比較LSCs在不同羊膜上的生長情況，以期尋求LSCs體外培養(yǎng)的最佳載體，為最終實(shí)現(xiàn)以體外培養(yǎng)的LSCs移植提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 健康清潔級SD大鼠，體質(zhì)量200～500 g，雌雄不限，由貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，生產(chǎn)許可證：SCXK(黔)2012-0001。孕婦胎盤，產(chǎn)前進(jìn)行母體血清學(xué)檢查，排除一切傳染性疾病的感染，由貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院提供，并通過倫理委員會批準(zhǔn)。

1.1.2 儀器與試劑 DMEM/F12培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，胎牛血清購自杭州四季青生物工程公司，0.25%Trypsin-0.01%乙二胺四乙酸(EDTA)購自美國Hyclone公司，兔多克隆抗體p63購自北京博奧森生物技術(shù)公司，小鼠單克隆抗體PCNA、細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、免疫熒光試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司，細(xì)胞培養(yǎng)板購自美國Costar公司，CO2培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司，倒置相差顯微鏡購自日本Nikon公司。

1.2 方法

1.2.1 羊膜載體的制備 取行剖宮產(chǎn)的健康孕婦的胎盤，無菌條件下，鈍性分離獲取羊膜，浸泡在含青鏈霉混合液(1∶1)的磷酸鹽緩沖液(PBS)中20 min。上皮面向上貼附于無菌硝酸纖維素膜上，修剪成2.5 cm×2.5 cm的小塊。(1)羊膜保存：將部分羊膜置于5%胎牛血清的DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)液中浸泡備用，4 ℃保存，于取材后12 h內(nèi)使用。將剩余羊膜按培養(yǎng)基和甘油1∶1混合的溶液浸泡，4 ℃冰箱中放置20 min，轉(zhuǎn)-80 ℃冰箱保存2個(gè)月，待使用時(shí)取出迅速置于37 ℃ PBS中解凍1 min，沖去表面甘油，PBS水化30 min后去上皮。(2)羊膜去上皮：含0.25%胰蛋白酶、0.01%EDTA的消化液37 ℃消化45 min，細(xì)胞刮刀刮除上皮細(xì)胞，倒置鏡下確認(rèn)上皮細(xì)胞全部清除，上皮面朝上置于24孔培養(yǎng)板內(nèi)于37 ℃孵箱中干燥待用。

1.2.2 LSCs的分離與培養(yǎng) 取新鮮大鼠角膜緣組織，眼科剪將組織反復(fù)剪碎至1 mm2大小，消化液37 ℃消化20 min，加適量20%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基反復(fù)吹打至單細(xì)胞懸液，離心去上清液。適量培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)后以1.5×105/cm2的密度分別接種于平鋪24孔培養(yǎng)板中，分為4組：有新鮮的保留上皮的羊膜為實(shí)驗(yàn)1組；新鮮的去除上皮的羊膜為實(shí)驗(yàn)2組；經(jīng)冷凍保存的去除上皮的羊膜及無羊膜載體的為實(shí)驗(yàn)3組；無羊膜載體組為對照組。37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)，培養(yǎng)液每2～3天更換1次，每日用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞的生長狀況并拍照記錄。

1.2.3 細(xì)胞凋亡蘇木素-伊紅(HE)染色檢測 取分組培養(yǎng)第5天的LSCs，按照武漢博士德生物工程有限公司提供凋亡檢測試劑盒說明書操作。

1.2.4 免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色檢測 取分組培養(yǎng)第5天的LSCs，免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色檢測p63和PCNA的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照說明書操作，空白對照以PBS代替一抗。

2 結(jié) 果

2.1 羊膜載體的制備 倒置顯微鏡觀察，保留上皮的羊膜上皮細(xì)胞呈立方形，小而密，覆蓋整個(gè)表面(圖1A)。去除上皮的羊膜表面未見細(xì)胞成分，可見基底膜網(wǎng)狀纖維，縱橫交錯(cuò)，見圖1B。

圖1 羊膜載體制備結(jié)果(×200)

圖2 SD大鼠LSCs體外細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果(×400)

2.2 大鼠LSCs的培養(yǎng)體外生長特征 倒置鏡觀察，培養(yǎng)第3天，實(shí)驗(yàn)1組(圖2A)、實(shí)驗(yàn)2組(圖2B)、實(shí)驗(yàn)3組(圖2C)3個(gè)實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)細(xì)胞排列緊密，融合形成單層，單層之間可見大小不等的團(tuán)塊狀集落，細(xì)胞大小基本一致，多呈圓球形或卵圓形，其中實(shí)驗(yàn)2組和實(shí)驗(yàn)3組的細(xì)胞集落均多于實(shí)驗(yàn)1組的細(xì)胞集落，但二者的死細(xì)胞數(shù)比實(shí)驗(yàn)1組多。對照組(圖2D)培養(yǎng)細(xì)胞排列相對稀疏，基本融合形成單層，可見散在的、大小不等的桑葚樣細(xì)胞集落，集落細(xì)胞生長特征及形態(tài)特點(diǎn)與實(shí)驗(yàn)組相似，死細(xì)胞明顯比3個(gè)實(shí)驗(yàn)組的死細(xì)胞多。HE染色觀察4組培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)特征：實(shí)驗(yàn)1組(圖2E)、實(shí)驗(yàn)2組(圖2F)、實(shí)驗(yàn)3組(圖2G)3個(gè)實(shí)驗(yàn)組的LSCs數(shù)量均相對較多，對照組(圖2H)細(xì)胞數(shù)較少，4組培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)基本相同，均呈橢圓形或不規(guī)則形。

2.3 免疫熒光細(xì)胞化學(xué)檢測各組p63蛋白及增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)的表達(dá) 培養(yǎng)第5天，3個(gè)實(shí)驗(yàn)組中均有大多數(shù)細(xì)胞呈p63陽性反應(yīng)(細(xì)胞核發(fā)出橙黃色熒光的細(xì)胞則為p63陽性細(xì)胞)，而p63陽性細(xì)胞則為LSCs。實(shí)驗(yàn)1組、實(shí)驗(yàn)2組、實(shí)驗(yàn)3組的p63陽性率均高于對照組(圖3)。細(xì)胞核發(fā)出橙黃色熒光的細(xì)胞則為PCNA陽性細(xì)胞，3個(gè)實(shí)驗(yàn)組中均有大多數(shù)細(xì)胞呈PCNA陽性反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)1組、實(shí)驗(yàn)2組、實(shí)驗(yàn)3組的PCNA陽性率均高于對照組(圖4)。實(shí)驗(yàn)1組與實(shí)驗(yàn)2組的p63，PCNA陽性性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.01)；實(shí)驗(yàn)1組與實(shí)驗(yàn)3組的p63，PCNA陽性性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.01)；實(shí)驗(yàn)2組與實(shí)驗(yàn)3組的p63，PCNA陽性性表達(dá)率比較，差異無統(tǒng)計(jì)意義(P>0.05)，見圖3、4。

圖3 SD大鼠LSCs中p63免疫熒光染色結(jié)果

2.4 細(xì)胞凋亡檢測各組細(xì)胞的凋亡率 培養(yǎng)第5天，3個(gè)實(shí)驗(yàn)組中均有少數(shù)細(xì)胞呈細(xì)胞凋亡陽性反應(yīng)，細(xì)胞核中有棕黃色顆粒者為陽性，即發(fā)生凋亡的細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)1組細(xì)胞凋亡率為(21.63±2.76)%、實(shí)驗(yàn)2組細(xì)胞凋亡率為(31.21±2.50)%、實(shí)驗(yàn)3組細(xì)胞凋亡率為(30.49±4.01)%，而對照組細(xì)胞凋亡率為(54.60±5.21)%。與對照組比較，實(shí)驗(yàn)1組、實(shí)驗(yàn)2組、實(shí)驗(yàn)3組均細(xì)胞凋亡數(shù)量減少(P<0.01)。實(shí)驗(yàn)3組與實(shí)驗(yàn)2組細(xì)胞凋亡率均高于實(shí)驗(yàn)1組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖5。

圖4 SD大鼠LSCs中PCNA免疫熒光染色結(jié)果

圖5 SD大鼠LSCs細(xì)胞凋亡結(jié)果

3 討 論

3.1 大鼠LSCs的體外培養(yǎng)及鑒定LSCs位于角膜緣上皮基底層中，其更新能夠保持角膜緣上皮細(xì)胞功能和結(jié)構(gòu)的完整性，對于角膜通透性至關(guān)重要。因此LSCs體外培養(yǎng)及相關(guān)分子鑒定至關(guān)重要。直到目前為止，關(guān)于LSCs的鑒定都是間接的。Sudha等[8]發(fā)現(xiàn)，p63局限地位于角膜上皮邊緣的基底細(xì)胞，認(rèn)為p63是LSCs的標(biāo)志物。Parthasarathy等[9]研究發(fā)現(xiàn)p63在LSCs中高表達(dá)，而在由干細(xì)胞分化而來的短暫擴(kuò)充細(xì)胞中不表達(dá)，認(rèn)為p63可作為鑒定LSCs的標(biāo)志。近年來，p63已被廣泛用作了LSCs的鑒定[10-13]。

PCNA是一種在增殖細(xì)胞中合成和表達(dá)的核內(nèi)多肽，它的表達(dá)和合成與細(xì)胞周期有關(guān)，其作為DNA聚合酶的輔助蛋白直接參與了細(xì)胞的增殖能力，在含有增殖細(xì)胞的組織中，PCNA呈陽性表達(dá)，故PCNA可間接地反映細(xì)胞的增殖狀況[14]。PCNA陽性細(xì)胞僅局限于有增殖能力的組織，是評價(jià)細(xì)胞增殖能力的可靠指標(biāo)，多用于細(xì)胞的體外培養(yǎng)[15]。故本研究對4組細(xì)胞進(jìn)行了PCNA免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色，各組中均有不同數(shù)量的細(xì)胞染色呈陽性，證明了所培養(yǎng)的LSCs具有較強(qiáng)的增殖能力。

3.2 最佳羊膜載體的選擇 目前認(rèn)為，羊膜是干細(xì)胞體外培養(yǎng)和臨床移植研究的首選載體[4]。Bourne將正常人羊膜組織自內(nèi)向外分為5層：(1)上皮細(xì)胞層；(2)基底膜；(3)致密層；(4)纖維母細(xì)胞層；(5)海綿層。在制備羊膜載體時(shí)，將絨毛膜去掉，合格的羊膜載體只包括上皮細(xì)胞層和基底膜，無血管和基質(zhì)成分(如成纖維細(xì)胞、膠原和其他非細(xì)胞成分)。本實(shí)驗(yàn)制備的羊膜載體成分均符合體外培養(yǎng)載體的要求。

本研究在3種羊膜上培養(yǎng)的LSCs發(fā)現(xiàn)所得的克隆細(xì)胞團(tuán)形態(tài)一致，有較高的核質(zhì)比，說明3種培養(yǎng)方法均較好地保持了培養(yǎng)LSCs的干細(xì)胞特性。倒置鏡觀察到，羊膜載體上培養(yǎng)的細(xì)胞，3d的融合率可達(dá)到70%，5d可達(dá)100%，明顯高于無載體組(第5天左右方可達(dá)到70%的融合)，說明在3種羊膜載體上培養(yǎng)的大鼠LSCs生長速度快，克隆形成率高，具有較強(qiáng)的增殖能力，均較無載體狀態(tài)更有利于LSCs的體外培養(yǎng)。

目前，關(guān)于新鮮羊膜和保存羊膜用于眼表疾病的治療中孰優(yōu)孰劣的問題，眾說紛紜。LSCs在體內(nèi)增殖分化受神經(jīng)、內(nèi)分泌、體液及微環(huán)境等各種因素的影響，其中各種細(xì)胞因子的作用尤為重要。許多研究表明，完整新鮮羊膜的上皮層細(xì)胞能夠分泌多種生物活性分子(表皮生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子、神經(jīng)生長因子等)，在體外培養(yǎng)時(shí)，能刺激培養(yǎng)細(xì)胞的增殖、運(yùn)動，增強(qiáng)黏附，并調(diào)節(jié)其分化狀態(tài)[16-20]。另外，神經(jīng)生長因子還可誘導(dǎo)蛋白質(zhì)合成、刺激免疫球蛋白M(IgM)分泌、調(diào)節(jié)膽堿乙?；D(zhuǎn)移酶的活性,對調(diào)節(jié)LSCs生存的微環(huán)境，促進(jìn)其增殖具有重要作用。本研究用新鮮完整羊膜培養(yǎng)的LSCs數(shù)量最多，增殖能力最強(qiáng)，細(xì)胞凋亡率最低，在整個(gè)培養(yǎng)過程中，除培養(yǎng)基外，未使用其他任何促進(jìn)細(xì)胞增殖的試劑，產(chǎn)生這一結(jié)果的原因可能與羊膜上皮細(xì)胞分泌各種細(xì)胞因子，最好地模擬了LSCs生長的微環(huán)境有關(guān)。

羊膜的基底膜是人體中最厚的基底膜，含有Ⅳ型膠原纖維網(wǎng)(ColⅣ)、層粘連蛋白(LN)和硫肝糖蛋白，可以為細(xì)胞黏附提供支架，引發(fā)細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進(jìn)細(xì)胞增生和移行[21]。說明去上皮的羊膜作為“移植的基底膜”，也可以為LSCs生長提供一種健康基質(zhì)，起到增強(qiáng)LSCs的黏附，促進(jìn)其移行和分化，以及防止凋亡等作用。故本研究用新鮮去上皮的羊膜作LSCs的體外培養(yǎng)，所獲細(xì)胞的數(shù)量、增殖能力、凋亡率均優(yōu)于無載體，提示在羊膜去上皮的情況下，羊膜基質(zhì)在LSCs體外培養(yǎng)過程中也在一定程度上發(fā)揮了正面的作用。

針對冷凍去上皮羊膜培養(yǎng)LSCs的情況，研究表明，冷凍保存的羊膜中上皮分泌的各種細(xì)胞因子效價(jià)顯著降低，但基底膜中含有的ColⅣ和LN并無明顯變化，故認(rèn)為在冷凍保存羊膜中各種生物活性分子的作用很小，甚至沒有作用，而發(fā)揮主要作用的是基底膜[21]。這一觀點(diǎn)支持了本實(shí)驗(yàn)冷凍去上皮羊膜組LSCs體外培養(yǎng)的結(jié)果，即由于沒有羊膜上皮所分泌的各種細(xì)胞因子的作用，所獲LSCs的數(shù)量、增殖能力均低于新鮮保留上皮的羊膜組，而凋亡率則相對增加；相關(guān)指標(biāo)與新鮮去上皮羊膜組沒有明顯的區(qū)別，這也是沒有設(shè)置冷凍保留上皮羊膜組培養(yǎng)的原因。

綜上所述，本研究通過比較大鼠LSCs在保留上皮的新鮮羊膜、去除上皮的新鮮羊膜和去除上皮的冷凍羊膜上的生長情況和生物學(xué)特性發(fā)現(xiàn)，保留上皮的新鮮羊膜能更好地維持體外培養(yǎng)LSCs的干細(xì)胞的特性。因此，可認(rèn)為保留上皮的新鮮羊膜載體更有利于大鼠LSCs的體外培養(yǎng)，是體外培養(yǎng)大鼠LSCs的理想載體，可為建立穩(wěn)定的LSCs體外實(shí)驗(yàn)細(xì)胞模型，和LSCs進(jìn)一步用于角膜損傷修復(fù)的研究奠定理論基礎(chǔ)。

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An experimental study of cultivating rat limbal stem cells in vitro on amniotic membrane*

HuRong,GaoJie,LiangYaru,HuangYue,LiHong,SuMin△

(DepartmentofHistologyandEmbryology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang,Guizhou550004,China)

Objective To search the optimal substrate of limbal stem cells(LSCs) cultured in vitro and provide experimental basis for LSCs transplantation.Methods The amniotic membranes of placenta from healthy pregnant women were obtained after caesarean section,the intact fresh amniotic membrane,the denuded fresh amniotic membrane and the denuded frozen amniotic membrane were prepared.There were 4 groups in the experiment:the experimental group 1 (the intact fresh amniotic membrane group),the experimental group 2 (the denuded fresh amniotic membrane group),the experimental group 3 (the denuded frozen amniotic membrane group) and the control group (the amniotic membrane free group).One hundred and twenty SD rats were used in this experiment.The cells of 4 groups were detected by cell apoptosis(TUNEL method),immunofluorescence of p63 and PCNA.The positive rates were analysed with the statistical methods.Results On the 3th day,the cultured cells of 3 experimental groups spreaded tightly and fused to a monolayer.There were many big clones clustered and the cells were spherical or oval with the same size.The cultured cells of the control group spreaded less tightly and fused to a monolayer as well.There were some small clones clustered and the cells were similar to the experimental groups.Experimental groups had less apoptosis positive cells and most cells were p63 and PCNA positive,while the control group had more apoptosis positive cells and less p63 and PCNA positive cells.The cell apoptosis rates of three experimental groups were lower than those of control group,the positive rates of their p63 and PCNA were higher than those of control group (P<0.01).The changes of the experimental group 1 were the most obvious (P<0.01).Conclusion Three different amniotic membranes are all helpful for rat LSCs culture in vitro.Moreover，the cells cultured on the intact fresh amniotic membrane were maintained with better characteristics.So the intact fresh amniotic membrane is considered to be the optimal substrate.

limbus corneae；stem cells；amnion；staining and labeling;corneae；cell apoptosis;p63;PCNA

貴州省優(yōu)秀科技教育人才省長專項(xiàng)資金項(xiàng)目(黔省專合字[2012]41號)；貴州省科技廳-貴陽醫(yī)學(xué)院聯(lián)合基金(黔科合LG字[2012]026號)。 作者簡介：胡蓉(1980-)，副教授，博士，主要從事干細(xì)胞基礎(chǔ)與應(yīng)用方面研究。△

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.23.023

R329.2

A

1671-8348(2016)23-3233-04

2016-04-08

2016-07-21)