鄒 茜，董麗英，袁平榮，劉慰華，蘇振喜，金 雁，寇姝燕*

(1．云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所，云南 昆明 650205；2．云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境資源研究所，云南 昆明 650205；3．云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)與信息研究所，云南 昆明 650205)

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廣譜持久抗病基因Pi40在云南高原粳稻的應(yīng)用研究

鄒 茜1，董麗英2，袁平榮1，劉慰華1，蘇振喜1，金 雁3，寇姝燕1*

(1．云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所，云南 昆明 650205；2．云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境資源研究所，云南 昆明 650205；3．云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)與信息研究所，云南 昆明 650205)

對持有主效廣譜抗瘟基因Pi40的單基因系4163與其它11份單基因鑒別品系進(jìn)行自然條件下稻瘟病抗性鑒定。結(jié)果表明，4163在云南省粳稻區(qū)的稻瘟病重病區(qū)均表現(xiàn)抗病，即在保山、宜良、玉溪葉瘟田間抗性分別為0級、0級、4級，穗瘟田間抗性為3級；同時，利用49份有代表性的云南稻瘟病單胞菌株，通過室內(nèi)接種抗性鑒定方法建立了Pi40對云南稻瘟病的抗譜，并與另外25份抗稻瘟病單基因系進(jìn)行室內(nèi)接種同步鑒定比較，結(jié)果表明Pi40對49份云南地方稻瘟病菌株的抗病頻率為87.8 %，表現(xiàn)出較廣的抗譜，可以作為云南高原粳稻抗病育種的新抗源利用。

Pi40；抗譜；稻瘟?。昏b定

據(jù)統(tǒng)計云南常年栽種稻谷(包括水、陸稻)100多萬hm2，稻瘟病常年發(fā)病有33.3多萬hm2，占稻谷面積的1/3以上[1]。云南常規(guī)水稻生產(chǎn)面積約為60多hm2，其中高原粳稻有53.3多萬hm2，其余為地方特色秈稻。由于云南特有的高原立體氣候，從國外和省外引進(jìn)的粳稻品種不能適應(yīng)高原氣候特點(diǎn)，無法在生產(chǎn)上加以直接利用；同時，省外引進(jìn)的常規(guī)秈稻品種稻米直鏈淀粉含量較高，不能滿足邊疆民族對品味的需求，因此一直以來，云南省在生產(chǎn)上使用的常規(guī)水稻品種都是自主選育品種。雖基本能滿足云南省糧食生產(chǎn)需求，但暴露出的問題也日漸突出，集中體現(xiàn)在應(yīng)用的大多數(shù)粳稻品種存在親本血緣相近，遺傳基礎(chǔ)狹窄，在生產(chǎn)上導(dǎo)致抵御病蟲害能力弱等問題，生產(chǎn)上隱患較大。如云粳25個品種中有23個都有合系34(Pi25)的血源，云粳優(yōu)1號至15號中，12個為合系34(Pi25)的后代，其余為合系24(Piz)和合系42的后代。其它生產(chǎn)中推廣面積較大的楚粳系統(tǒng)、鳳稻系統(tǒng)、靖粳系統(tǒng)中，則又都包含云粳的血緣?？梢哉f，近20年來云南水稻常規(guī)粳稻生產(chǎn)中利用的抗瘟基因主要是來自合系34的Pi25和來自合系24的Piz這2個基因，抗瘟基因來源過于單一，遺傳基礎(chǔ)十分狹窄。并且抗瘟基因Pi25為垂直抗性基因[2-3]，若其抗性喪失，生產(chǎn)上潛在導(dǎo)致大面積稻瘟病流行的風(fēng)險。

表1 苗期葉瘟抗性鑒定材料

隨著分子生物學(xué)和基因組學(xué)的迅猛發(fā)展，越來越多的抗稻瘟病基因被鑒定并克隆，這為水稻抗病機(jī)制的研究和分子標(biāo)記輔助育種帶來新的契機(jī)。根據(jù)國家水稻數(shù)據(jù)庫統(tǒng)計結(jié)果，截至2013年8月，至少已報道了68個抗稻瘟病位點(diǎn)共83個主效基因，其中Pi40為最新鑒定出的主效廣譜抗瘟基因，初步定位于水稻第6染色體短臂上。

本研究針對云南高原粳稻生產(chǎn)中稻瘟病抗性基因遺傳基礎(chǔ)狹窄，抗源單一的突出問題，引入攜帶主效廣譜抗瘟新基因Pi40的粳稻品系4163，在病圃中進(jìn)行自然發(fā)病，通過與另外11份鑒別品系進(jìn)行對比，表明4163在云南省粳稻區(qū)的稻瘟病重病區(qū)表現(xiàn)出田間水平抗性。進(jìn)一步利用49份有代表性的云南稻瘟病單胞菌株，對4163進(jìn)行室內(nèi)接種鑒定，初步明確Pi40的抗譜。同時與另外25份抗稻瘟病單基因系進(jìn)行抗性頻率對比分析，揭示出Pi40在云南高原粳稻育種中有較好的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 材料及試驗地設(shè)置

自然條件下葉瘟和穗瘟抗性鑒定材料及其所攜帶的抗性基因列于表1，蒙古稻為自然誘發(fā)介質(zhì)品種。49份有代表性的云南稻瘟病單胞菌株由云南省農(nóng)科院資源與環(huán)境研究所采集分離、鑒定培養(yǎng)，其詳細(xì)信息列于表2。研究采用的另外25份單基因系列于表3，其中LTH為麗江新團(tuán)黑谷，為公認(rèn)的普感稻瘟病水稻品種，作為對照品種。自然環(huán)境下稻瘟病鑒定圃的設(shè)置，根據(jù)云南省水稻生態(tài)區(qū)域特點(diǎn)在稻瘟病常發(fā)、重發(fā)地區(qū)設(shè)立了3 個病圃，分別位于玉溪市研和鎮(zhèn)(屬滇西南稻區(qū))，保山市隆陽區(qū)試驗場(屬滇西稻區(qū))，宜良縣羊街鄉(xiāng)(屬滇中稻區(qū))。

人工接種鑒定在云南省農(nóng)科院資源與環(huán)境研究所實驗室和昆明溫室進(jìn)行。

1.2 稻瘟病鑒定方法

1.2.1 自然環(huán)境下鑒定方法 供試材料于當(dāng)年晚播，濕潤育秧，重施氮肥(施尿素1050 kg/hm2)，每份材料播種100粒左右，材料間隔7 cm，順序排列不設(shè)重復(fù)。每垅及鑒定圃四周播蒙古稻作感染品種。當(dāng)供試材料3葉期時將新鮮采集的病葉插在蒙古稻行，覆水保濕7 d，待大部分供試材料普遍發(fā)病時作第1次病情調(diào)查，間隔7 d后作第2次病情調(diào)查。

1.2.2 稻瘟病單胞菌株培養(yǎng)和室內(nèi)接種方法 單胞菌株接種于燕麥培養(yǎng)基上進(jìn)行活化，24 ℃下培養(yǎng)約15 d左右，待菌絲長滿培養(yǎng)基后，用自來水洗去氣生菌絲，日光燈(400NM)照射下培養(yǎng)2～3 d，經(jīng)行產(chǎn)孢2～3 d。然后用蒸餾水洗下孢子并加入0.02 %Tween-20制成孢子懸浮液用于噴霧接種，孢子濃度為20～50個/150倍視野(2×105～5×105孢子/mL)。

供試材料置于水中浸泡48 h，然后撈出控干水，置于30 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行催芽，待芽長出0.2 cm左右，即可進(jìn)行播種。播于裝有秧田土的12 cm×18 cm×5 cm塑料育苗盒內(nèi)，每品種6粒。在溫室內(nèi)育苗，2葉期開始追施尿素0.5 g/盒，共2～3次。3～5葉期進(jìn)行噴霧接種，接種后的苗置于25 ℃保濕保溫箱內(nèi)24 h。保溫培養(yǎng)后取出放在溫室內(nèi)，每天進(jìn)行定時噴霧以保持溫室的濕度，創(chuàng)造有利的發(fā)病條件，接種7～10 d后進(jìn)行發(fā)病情況調(diào)查。

1.3 稻瘟病抗性評價標(biāo)準(zhǔn)及人工接種分級標(biāo)準(zhǔn)

葉瘟評價標(biāo)準(zhǔn)： 0級全葉片無病斑；1級葉片上有針頭狀大小的褐點(diǎn)；2級葉片可見較大的褐點(diǎn)；3級有小圓形至稍長的灰色病斑，邊緣褐色直徑約1～2 mm；4級葉片上有典型紡錘形病斑，長1～2 cm，通常僅局限于2條主脈之間，病斑危害面積少于2 %；5級病斑危害葉面積少于10 %；6級病斑危害葉面積少于25 %；7級病斑危害葉面積少于50 %；8級病斑危害葉面積少于75 %；9級全葉枯死。其中0～1級為高抗(HR)，2～3級為抗(R)，4級為中抗(MR)，5～6級為感病(S)，7～9級為高感(HS)。

表2 從云南不同地方收集分離出的稻瘟病單胞菌株情況

穗瘟評價標(biāo)準(zhǔn)： 0級無病穗或病穗比例小于1 %；1級病穗比率為1.1 %～5 %；3級病穗比率為5.1 %～10 %；5級病穗比率為10.1 %～25 %；7級病穗比率為25.1 %～50 %；9級病穗比率大于50.1 %。

室內(nèi)接種分級標(biāo)準(zhǔn)共分為5級：0級無病斑；1級葉片上產(chǎn)生褐點(diǎn)型過敏性壞死點(diǎn)，直徑小于0.5 mm，不具有產(chǎn)孢能力；2級葉片上產(chǎn)生小的近圓形病斑，直徑小于2 mm，病斑中心灰色，病斑周圍有褐色的邊緣圍繞，具有產(chǎn)孢能力；3級典型的梭型稻瘟病病斑，病斑大于2 mm，病斑中心壞死，有褐色的邊緣，具有產(chǎn)孢能力；4級水浸狀病斑無邊緣，病斑可繼續(xù)擴(kuò)展。其中，0～2級為抗病型反應(yīng)，3～4級為感病型反應(yīng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 病圃稻瘟病抗性鑒定結(jié)果

2010-2012年分別在云南省宜良、保山、玉溪對試驗材料進(jìn)行田間葉瘟鑒定，結(jié)果見表4。

從表4可以看出， 引進(jìn)品系4163在云南保山、玉溪、宜良等不同稻區(qū)均表現(xiàn)出抗病的特性，也表明其抗性的廣譜性。而其余用于鑒別品系的表現(xiàn)不一，大多表現(xiàn)為感病，只有部分材料為抗，然而其年份間和地點(diǎn)間的差異突出。如，福錦2010和2012年葉瘟抗性等級為3～4級，表現(xiàn)為抗，而2011年在2點(diǎn)均表現(xiàn)為感病，等級為8-9級，這個可能由于不同年份、不同地點(diǎn)的生理小種不同而致。

表3 25個抗稻瘟病單基因系

2.2 Pi40對代表性云南稻瘟病的抗譜反應(yīng)

選用49份有代表性的云南稻瘟病的單胞菌株4163進(jìn)行了接種鑒定，以麗江新團(tuán)黑谷為對照，抗譜結(jié)果如表5所示。

從表5看出麗江新團(tuán)黑谷則均表現(xiàn)為感病，而4163對49份稻瘟病菌株中的43份都表現(xiàn)出抗性反應(yīng)，僅對09BSH-10-5A、2011-1-1-29-1、2011-1-1-39-1、2011-1-1-19-1、2011-1-1-43-1、2011-1-1-35-1這 6個稻瘟病菌株表現(xiàn)為感病，抗病頻率達(dá)到87.8 %。該結(jié)果表明，攜帶Pi40抗病基因的品系4163對云南的稻瘟病菌株表現(xiàn)了較廣的抗譜，若利用引進(jìn)的Pi40進(jìn)行云南稻區(qū)水稻品種改良及新種質(zhì)資源創(chuàng)制具有良好的應(yīng)用前景。

由表5可見，49份具有代表性的稻瘟病菌株中17份采自保山隆陽稻區(qū)，Pi40對這17份菌株均表現(xiàn)為抗性反應(yīng)，而對于采自其它稻區(qū)，甚至保山壩子的菌株的抗性反應(yīng)則有抗有感，這一結(jié)果也佐證了表4中，引進(jìn)的Pi40高代粳稻回交系4163在除在保山隆陽病圃葉瘟表現(xiàn)高抗外，在宜良和玉溪的病圃中葉瘟均表現(xiàn)為水平抗性。該結(jié)果說明與保山當(dāng)?shù)靥厥獾牡疚敛【晗嚓P(guān)，也與往年課題組其它育種材料在保山病圃的鑒定結(jié)果一致。

表4 供試材料在不同年份、不同地點(diǎn)的葉瘟鑒定

表5 49份代表性單胞菌株對4163的抗譜

2.3 Pi40與其它抗瘟基因的抗性對比

為進(jìn)一步揭示Pi40在云南高原育種研究中的應(yīng)用價值，利用上述49份代表性的單胞菌株對另外25份單基因抗性材料進(jìn)行接種鑒定，其抗譜見圖1。

由圖1可見，26份材料的抗譜差異較大，抗病頻率從6.7 %到100 %；其中Pi9和Pi20對49份菌株均表現(xiàn)抗性，抗性頻率達(dá)到100 %；而Piks、Pik則抗譜較窄，抗性頻率分別為8.2 %和6.7 %，該結(jié)果說明在云南水稻種植區(qū)域中，Pi9和Pi20是比較有用的抗病基因材料，同時在今后育種中應(yīng)注意避免Piks、Pik等基因材料的應(yīng)用。由圖1可見，Pi40的抗性頻率為87.8 %，稍低于Pi9、Pi20、Pita和Pizt，抗譜廣度居于第5位，表明Pi40作為新引進(jìn)的稻瘟病抗源，對大多數(shù)云南稻區(qū)的稻瘟病菌株都有良好的抗性，是進(jìn)行高原粳稻抗病新材料創(chuàng)制的良好抗源供體。

3 討 論

由子囊菌引發(fā)的稻瘟病是世界上最重要的病害之一[4～6]，每年都造成嚴(yán)重的糧食損失。稻瘟病的抗性問題歷來是育種工作者急需解決的重大課題。水稻的抗瘟性受不同致病菌株的直接影響，水稻品種的抗病基因?qū)Φ疚敛【拇怪笨剐宰V存在很大差異[7-11]，抗譜的廣度(數(shù)量)與抗性的強(qiáng)度(質(zhì)量)之間有顯著的正相關(guān)[12]。因此，探明水稻品種對不同菌系的抗性譜，對于了解其適應(yīng)稻區(qū)的廣度和預(yù)測其抗性維持時間的長短是很必要的，對育種研究者在雜交親本的選用和配組以及新育成品種的合理布局等方面也有著實際意義[13-14]。

圖1 不同單基因系對云南不同稻瘟病株的抗譜Fig.1 Different single-genic lines on the resistant spectrum of different rice blast isolates in Yunnan

本文抗譜測定試驗中，選用的49份單胞菌株，其中的大多數(shù)在本區(qū)田間的分布廣度與數(shù)量上均占優(yōu)勢。因而，選用這些菌株對正在利用的水稻材料進(jìn)行抗譜分析，將使研究結(jié)果與田間實際緊密聯(lián)系起來。稻種的抗菌株頻率越高，即抗譜越廣[15-16]。本文Pi40對49份菌株中的43份都表現(xiàn)出抗性，表明引進(jìn)的4163品系對本稻區(qū)稻瘟病的抗譜較廣，作為抗源在后續(xù)育種中進(jìn)行雜交利用，將為云南高原水稻抗病基因遺傳基礎(chǔ)的拓寬和抗病新材料的創(chuàng)制具有積極作用。

從田間自然誘發(fā)和不同生理小種的接種鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)一些同源抗性基因的抗譜卻不盡相同，比如Pi9、Pizt、Pi2是位于同一位點(diǎn)的同源性抗性基因，但三者的抗譜差異較大，Pi2抗菌譜較窄，這種情況表示，在分子進(jìn)化過程中NBS-LRR結(jié)構(gòu)[17]的分化可能是導(dǎo)致3個基因抗譜差異的主要原因。此外，在所用到的抗病基因材料中Pi9和Pi20抗譜最寬，Pita和Pizt次之，這些都可作為今后抗性基因抗源加以利用。

[1]劉國權(quán)，孟昭河，任艷軍，等.水稻抗稻瘟病研究進(jìn)展與對策[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2009(1)：211-214.

[2]吳建利,莊杰云,李德葆,等. 水稻對稻瘟病抗性的分子生物學(xué)研究進(jìn)展[J]. 中國水稻科學(xué), 1999, 13 (2): 123 - 128.

[3]趙正洪，張岳平，瞿華香.水稻稻瘟病菌及其抗性遺傳研究進(jìn)展[J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008(5):1-4.

[4]肖丹鳳,王 玲,劉連盟,等.黑浙桂稻瘟病菌生理小種鑒定與遺傳多樣性分析[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報，2014，27(1):121-126.

[5]Ashikawa I, Hayashi N, Yamane H, et al. Two Adjacent Nucleotide-Binding Site-Leucine-Rich Repeat Class Genes Are Required to ConferPikm-Specific Rice Blast Resistance[J]. Genetics, 2008,180(4): 2267-2276.

[6]Barbara V. Underground life for rice foe[J]. Nature, 2004,431:516-517.

[7]Berruyer R, Adreit H, Milazzo J, et al. Identification and fine mapping ofPi33, the rice resistance gene corresponding to theMagnaporthegriseaavirulencegeneACE1[J]. Theoretical and Applied Genetics, 2003, 107(6): 1139-1147.

[8]Bryan GT, Wu KS, Farrall L, et al. A Single Amino Acid Difference Distinguishes Resistant and Susceptible Alleles of the Rice Blast Resistance GenePi-ta[J]. The Plant Cell, 2000,12(11): 2033-2046.

[9]楊小林，曾凡松，張 舒，等.20個稻瘟病抗性基因在湖北省的利用價值分析[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014,16：3798-3802.

[10]秦飛龍，李澤福,吳晗霖,等.不同水稻品種在皖南地區(qū)對稻瘟病的抗性鑒定[J].安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2015,42(1)：77-81.

[11]莫海玲，唐 梅，孫 富，等.近十年廣西審定感光型雜交稻品種的主要病害抗性水平及育種方向分析[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報,2015,46(2):194-198.

[12]薛石玉，項壽南,謝加華,等.應(yīng)用聚合回交法選育抗稻瘟病恢復(fù)系及新組合[J].浙江農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1999,25(1)：5-9.

[13]夏小東,袁筱萍,余漢勇,等.中國稻種資源初級核心種質(zhì)對稻瘟病的抗性聚類分析[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2011,32(2):39-43.

[14]李進(jìn)波，夏明元，戚華雄.水稻抗稻瘟病基因Pi1和Pi2聚合系的獲得及其抗性評價[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2015,43(5):12-14,31.

[15]羅利民,王云高,羅耀光,等.稻種資源對稻瘟病的抗譜測定[J].作物品種資源,1996(1):11-13.

[16]黃費(fèi)元,彭紹裘,劉二明,等.持久抗瘟性稻種鑒定與評價方法研究[J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué),2003(2):38-41.

[17]劉云飛,萬紅建,李志邈,等.植物NBS-LRR抗病基因結(jié)構(gòu)、功能、進(jìn)化起源及其應(yīng)用[J].分子植物育種，2014,12(2)：377-389.

(責(zé)任編輯 王家銀)

Application Study on Broad-spectrum Blast Resistance GenePi40 in Yunnan Plateau Rice Breeding

ZOU Qian1, DONG Li-ying2, YUAN Ping-rong1, LIU Wei-hua1, SU Zhen-xi1, JIN Yan3, KOU Shu-yan1*

(1.Institute of Food Crops, Yunnan Academy of Agricultural Sciences，Yunnan Kunming 650205，China; 2.Institute of Agricultural Environment and Resources, Yunnan Academy of Agricultural Sciences，Yunnan Kunming 650205，China; 3.Agricultural Institute of Economy and Information, Yunnan Academy of Agricultural Sciences，Yunnan Kunming 650205，China)

The identification of leaf blast resistance was carried out to a new bred line 4163 containing the rice blast resistant genePi40, and another 11 monogenic lines in natural disease nursery. The results showed that 4163 had a good resistant character to Yunnan’s blast isolates. The leaf blast resistance level were 0, 0 and 4 grade in Baoshan city, Yiliang city and Yuxi city respectively, while the neck blast resistance was 3 level. In order to construct a spectrum ofPi40 under Yunnan plateau, 49 typical strains were isolated to inoculate the 4163 in library, and thePi40 showed 87.8 % resistance frequency. While compared to the other 25 resistance genes,Pi40 showed a wide resistant spectrum which indicated that it could be used as the main source of resistance gene in the future Yunnan plateau japonica rice breeding.

Pi40; Resistance spectrum; Rice blast; Identification

1001-4829(2016)07-1493-06

10.16213/j.cnki.scjas.2016.07.001

2014-02-27

云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究項目(2010ZC174)；云南省科技計劃項目(2015ZA003)

鄒 茜(1980-) ，女，副研究員，主要從事水稻稻瘟病研究工作，E-mail: day14@163.com,* 為通訊作者，E-mail: sy_kou@sina.com。

S511

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