吳明媛，韋信賢，童桂香，蘭柳春，楊姝麗

(廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院，廣西 南寧 530021)

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水產(chǎn)品組織中硝基呋喃類代謝物殘留檢測方法優(yōu)化研究

吳明媛，韋信賢，童桂香，蘭柳春，楊姝麗*

(廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院，廣西 南寧 530021)

優(yōu)化改進(jìn)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定水產(chǎn)品組織中硝基呋喃類代謝物殘留的方法，用0.3 mol/L鹽酸對(duì)樣品進(jìn)行水解，2-硝基苯甲醛進(jìn)行衍生化，37 ℃避光振蕩16 h后用磷酸氫二鉀與氫氧化鈉混合溶液調(diào)節(jié)水解液pH為7.0～8.0，利用乙酸乙酯進(jìn)行萃取。萃取液氮吹至干，用甲醇溶液定容，用作HPLC-MS/MS測定。結(jié)果表明，4種硝基呋喃代謝物在1～500 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，加標(biāo)回收率為92.1 %～103 .0 %，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10.0 %。方法檢測下限為0.1 μg/kg。試驗(yàn)證明，該方法穩(wěn)定可靠，提高了樣品處理效率，解決了陽性樣品檢測值偏低的問題。

硝基呋喃類代謝物；水產(chǎn)品；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；優(yōu)化

硝基呋喃類藥物是一類廣譜抗生素，因價(jià)格較低廉且療效佳，被廣泛應(yīng)用于畜禽和水產(chǎn)養(yǎng)殖。硝基呋喃類藥物具有遺傳毒性可能導(dǎo)致基因變異，其原型藥在動(dòng)物體內(nèi)代謝迅速，穩(wěn)定性只有數(shù)小時(shí)，但其代謝物能與蛋白質(zhì)緊密結(jié)合，形成穩(wěn)定的殘留物，殘留時(shí)間達(dá)數(shù)周之久[1-5]。歐盟從1997年起，禁止在動(dòng)物飼料中添加任何硝基呋喃類藥物。我國也于2002年頒布了禁止使用硝基呋喃類抗生素的禁令[6]。日本在2006年5月29日起實(shí)施食品中農(nóng)業(yè)化學(xué)品殘留“肯定列表制度”，對(duì)硝基呋喃及其代謝物殘留制定新的檢測限0.5 μg/kg[7]。

硝基呋喃類藥物主要有呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃妥因、呋喃西林，其對(duì)應(yīng)的代謝物分別為：3-氨基-2-噁唑烷基酮(AOZ)、5-甲基-嗎啉-3-氨基-2-噁唑烷基酮(AMOZ)、1-氨基-2-內(nèi)酰脲(AHD)和氨基脲(SEM)[8-9]。一般判定動(dòng)物源性食品中硝基呋喃類藥物的殘留狀況都是通過檢測其中硝基呋喃類代謝產(chǎn)物的含量作為依據(jù)[10]。

硝基呋喃類代謝物殘留檢測手段主要有酶聯(lián)免疫法(ELISA)、高效液相色譜法(HPLC)、高效液相色譜-質(zhì)譜法(HPLC-MS)、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)[11-12]。高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法因高靈敏度，定性定量準(zhǔn)確已成為主要檢測方法。但在按照我國農(nóng)業(yè)部發(fā)布的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[13]進(jìn)行大批量樣品檢測時(shí)發(fā)現(xiàn)存在陽性樣品檢測值偏低的情況。本研究擬通過對(duì)樣品前處理進(jìn)行優(yōu)化，為解決陽性樣品檢測值偏低的問題提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試儀器：Thermo TSQ Quantum Access MAX液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Thermo公司)，配電噴霧離子源(ESI)；供試藥劑：呋喃唑酮代謝物(AOZ)、呋喃它酮代謝物(AMOZ)、呋喃妥因代謝物(AHD)、呋喃西林代謝物(SEM)(Dr.Ehrenstorfer公司)；AOZ-D4、AMOZ-D5、AHD-13C3、SEM.HCl-13C15N2(Witega公司)；鹽酸、2-硝基苯甲醛、二甲基亞砜、氫氧化鈉、磷酸氫二鉀、乙酸乙酯、甲醇。

本研究中使用的組織樣品為實(shí)驗(yàn)室中未檢出4種硝基呋喃類代謝物的鰻鱺、羅非魚和對(duì)蝦作為陰性樣品，以及實(shí)驗(yàn)室中檢出有硝基呋喃類代謝物的鰻鱺，對(duì)蝦作為陽性樣品進(jìn)行研究。

1.2 色譜條件

色譜柱：Hypersil GOLD C18液相色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.9 μm)；流速：200 μl/min；柱溫：30 ℃；樣品盤溫度10 ℃；進(jìn)樣量：20 μl；流動(dòng)相：A相為甲醇，B相為5 mM乙酸胺 + 0.1 %甲酸水溶液。梯度洗脫程序見表1。

1.3 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源(ESI)；噴霧電壓：3500 V；毛細(xì)管溫度：350 ℃；鞘氣：氮?dú)猓?0 bar；輔助氣：氮?dú)猓?0 bar；碰撞氣：氬氣，1.5 mTorr；選擇反應(yīng)監(jiān)測掃描模式(SRM)，參數(shù)見表2。

1.4 試驗(yàn)方法

稱取2 g均質(zhì)后的樣品于50 mL離心管中，加入50 μl混合內(nèi)標(biāo)工作液，加入5 mL 0.3 mol/L鹽酸溶液和150 μl 0.05 mol/L 2-硝基苯甲醛，混勻后置于恒溫振蕩器中37 ℃避光振蕩16 h。取出離心管避光冷卻至室溫，加入4 mL pH調(diào)節(jié)劑(1 M磷酸氫二鉀∶1 M氫氧化鈉=1∶3)，調(diào)節(jié)pH至7.0～7.5，混勻后加入8 mL乙酸乙酯，振蕩5 min，4000 r/min離心5 min。取4 mL上層清液至5 mL玻璃管中，50 ℃下氮吹至干，用5 %甲醇溶液1 mL漩渦混合溶解殘留物后，如油脂過多可4000 r/min離心10 min，下層液體過0.22 μm濾膜，待分析。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序

2 結(jié)果與分析

2.1 水解鹽酸濃度的影響

分別用0.1、0.2、0.3 和0.4 mol/L鹽酸對(duì)陽性樣品進(jìn)行水解，同批樣品添加2.5 μg/kg及10 μg/kg兩個(gè)水平的質(zhì)控樣進(jìn)行跟標(biāo)監(jiān)控，在質(zhì)控樣的加標(biāo)回收率在90 %～110 %的情況下，由陽性樣品檢測結(jié)果(表3)可以看出，陽性樣品在0.1 mol/L鹽酸里的只有部分進(jìn)行了水解，隨著鹽酸的濃度加大，水解效率不斷增加，當(dāng)鹽酸濃度達(dá)到0.3 mol/L是達(dá)到一個(gè)峰值，繼續(xù)增加鹽酸的濃度，水解效率有所下降。因此只有當(dāng)鹽酸濃度達(dá)到0.3 mol/L時(shí)，陽性樣品中的目標(biāo)物才能完全水解，否則會(huì)導(dǎo)致陽性樣品最終檢測結(jié)果偏低。

2.2 衍生化時(shí)間的影響

由于4種硝基呋喃類代謝物的分子量為75～201，在此范圍背景干擾大，離子化效率低，碎片不具有特征性，因此采用2-硝基苯甲醛對(duì)4種代謝物的自由氨基進(jìn)行衍生化，形成一個(gè)具有較好質(zhì)譜特性的化合物[14-16]。在酸性條件下，親核基團(tuán)R-NH2很快游離出來與2-硝基苯甲醛的羰基發(fā)生反應(yīng)[17]。由表4看出，標(biāo)準(zhǔn)溶液和質(zhì)控樣品衍生化1 h后就可以得到一個(gè)比較固定的數(shù)值，而陽性樣品1 h只能衍生化出一部分目標(biāo)物，隨著時(shí)間的增加檢測結(jié)果增大，16 h后達(dá)到峰值。因此，樣品必需在37 ℃下反應(yīng)16 h才可以得到穩(wěn)定且響應(yīng)值最高的結(jié)果，如果時(shí)間不夠會(huì)造成檢測結(jié)果偏低。但對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)溶液及加標(biāo)質(zhì)控樣的衍生，由于不需要經(jīng)過蛋白質(zhì)水解，在1 h內(nèi)可以衍生化完畢。

表2 選擇反應(yīng)監(jiān)測掃描模式(SRM)質(zhì)譜參數(shù)

注：*為定量離子。

Note：*mean quantitative ion.

表3 水解鹽酸濃度對(duì)硝基呋喃類代謝物陽性樣品結(jié)果的影響

表4 衍生化時(shí)間對(duì)硝基呋喃類代謝物結(jié)果的影響

2.3 水解衍生化后調(diào)節(jié)pH值的影響

5 ppb硝基呋喃代謝物、50 ppb硝基呋喃類代謝物內(nèi)標(biāo)物加入陰性組織中按1.4步驟進(jìn)行水解衍生后，用pH調(diào)節(jié)劑調(diào)至不同pH值后測定，從結(jié)果(圖1)可以看出，水解液pH值在7～8時(shí)，響應(yīng)值RSD在15 %內(nèi)，靈敏度變化不大，而且內(nèi)標(biāo)法定量采用的定量離子與內(nèi)標(biāo)物離子響應(yīng)值比率RSD在5 %內(nèi)，對(duì)定量影響很小。本研究結(jié)果表明，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH容易過高，磷酸氫二鉀調(diào)節(jié)pH消耗量過大，用磷酸氫二鉀與氫氧化鈉混合溶液調(diào)節(jié)pH消耗量小且pH不易過高。處理大批量樣品時(shí)并不需要對(duì)每個(gè)樣品精確調(diào)節(jié)pH，可提高實(shí)驗(yàn)效率。

圖1 pH對(duì)4種硝基呋喃代謝物的影響Fig.1 Effects of pH values on response signals of nitrofuran metabolites

2.4 線性關(guān)系、檢出限和回收率

分別采用4種硝基呋喃代謝物的同位素標(biāo)記物作為內(nèi)標(biāo)物，減少了水解衍生、調(diào)節(jié)pH等步驟對(duì)回收率的影響，使定量更加準(zhǔn)確。以各特征離子質(zhì)量色譜峰面積與相應(yīng)內(nèi)標(biāo)物的峰面積比為縱坐標(biāo)，對(duì)照溶液的濃度為橫坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，其相應(yīng)的回歸方程和相關(guān)系數(shù)(表5)如下：由回歸方程及相關(guān)系數(shù)表明，4種硝基呋喃代謝物在1～100 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，4種被測物檢測下限均為0.1 μg/kg。

對(duì)水產(chǎn)品組織樣品進(jìn)行3個(gè)添加水平測試(表6)，在不同加標(biāo)水平處理下，AOZ在3組水產(chǎn)品陰性組織中的回收率為95.2 %～103.0 %，其中加標(biāo)0.5 μg/kg處理下回收高于其它兩個(gè)加標(biāo)水平處理；AMOZ在3組水產(chǎn)品陰性組織中的回收率為94.3 %～101.0 %；AHD在3組水產(chǎn)品陰性組織中的回收率為94.3 %～100.0 %；SEM在3組水產(chǎn)品陰性組織中回收率為92.1 %～102.0 %，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均在10.0 %以下，說明肌肉組織中的4種硝基呋喃代謝物的陰性樣品加標(biāo)檢測都能得到一個(gè)穩(wěn)定可靠的回收率，說明該方法對(duì)組織中4種硝基呋喃代謝物能進(jìn)行穩(wěn)定的檢測。

3 討論與小結(jié)

硝基呋喃類代謝物殘留量的測定—(液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法)標(biāo)準(zhǔn)[13]是近年來水產(chǎn)品中硝基呋喃代謝物檢測的主要依據(jù)，在按照此標(biāo)準(zhǔn)檢測樣品時(shí)發(fā)現(xiàn)，即使同批樣品的質(zhì)控回收率滿意，陽性樣品仍有可能因?yàn)樗獠煌耆Y(jié)果偏低很多，這是由于樣品檢測過程中質(zhì)控措施是在組織樣品中加入一定量硝基呋喃代謝物標(biāo)準(zhǔn)溶液，這樣添加的硝基呋喃代謝物并不會(huì)與蛋白質(zhì)結(jié)合，即使鹽酸濃度太低，衍生化時(shí)間不長也可以達(dá)到滿意的回收率。但是對(duì)于內(nèi)源性的硝基呋喃代謝物，由于已經(jīng)與蛋白質(zhì)結(jié)合，鹽酸濃度較低時(shí)可能出現(xiàn)水解不完全，檢測結(jié)果偏低的情況。本研究在該方法的基礎(chǔ)上，對(duì)高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定水產(chǎn)品組織中硝基呋喃類代謝物的樣品前處理方法各環(huán)節(jié)進(jìn)行了優(yōu)化比較，試驗(yàn)證明影響陽性樣品檢測值偏低的主要原因是鹽酸濃度偏低及水解時(shí)間不夠。樣品檢測過程中質(zhì)控措施是在組織樣品中加入一定量標(biāo)準(zhǔn)溶液，這樣添加的硝基呋喃代謝物并不會(huì)與蛋白質(zhì)結(jié)合，低濃度的鹽酸和短時(shí)間的水解反應(yīng)也可以達(dá)到較為滿意的回收率，而對(duì)于陽性樣品，由于硝基呋喃代謝物已經(jīng)與蛋白質(zhì)結(jié)合，酸濃度要達(dá)到0.3 mol/L時(shí)且樣品在37 ℃下需反應(yīng)16 h才可以達(dá)到完全水解。硝基呋喃代謝物殘留量的測定[13]要求調(diào)節(jié)衍生化后的水解液的pH為7.0～7.5，但經(jīng)本研究發(fā)現(xiàn)水解液的pH為7.0～8.0時(shí)，對(duì)樣品的回收率沒有太大的影響，因此在處理大批量樣品時(shí)并不需要精確的調(diào)節(jié)每個(gè)的pH值，只需要調(diào)節(jié)前面幾個(gè)樣品后固定給后面的每個(gè)樣品加入同樣劑量的磷酸氫二鉀與氫氧化鈉混合溶液即可。經(jīng)改進(jìn)后該方法穩(wěn)定可靠，可提高樣品處理效率，并有效解決陽性樣品檢測值偏低的問題。

表5 回歸方程和相關(guān)系數(shù)

表6 陰性肌肉組織樣品加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)

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(責(zé)任編輯 汪羽寧)

Optimization Study on Determination of Residual Metabolites of Nitrofuran in Aquatic Products

WU Ming-yuan, WEI Xin-xian, TONG Gui-xiang, LAN Liu-chun, YANG Shu-li*

(Guangxi Academy of Fishery Sciences，Guangxi Nanning 530021，China)

An improved method for the determination of metabolites of nitrofuran in aquatic products tissues by HPLC-MS/MS was proposed. Samples were hydrolyzed with 0.3 mol/L HCl，and derivatized at 37 ℃ for 16 h with 2-nitrobenzaldenhyde.Hydrolyzed solution was adjusted to pH 7.0-8.0，extracted with ethyl acetate. The analytes were separated and detected by HPLC-MS/MS. The limits of quantification for four nitrofuran metabolites in samples were 0.1 μg/kg. The matrix-matched calibration curve showed good linearity in the range of 1-500 ng/mL. The mean recovery was between 92.1 %-103.0 % and RSD less than 11.1 %.

Metabolites of nitrofuran; Aquatic products; HPLC-MS/MS;Optimization

1001-4829(2016)07-1750-05

10.16213/j.cnki.scjas.2016.07.044

2016-01-12

廣西水產(chǎn)畜牧獸醫(yī)局科研專項(xiàng)基金(桂漁牧發(fā)[2015]11號(hào))

吳明媛(1980-)，女，廣西南寧人，工程師，主要從事水產(chǎn)品質(zhì)檢工作，*為通訊作者，E-mail：garnet.y@gmail.com。

O657.63

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