吳遠(yuǎn)華 司凱隆

(貴陽中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，貴州 貴陽 550002)

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苗藥對三叉神經(jīng)痛大鼠三叉神經(jīng)節(jié)p-ERK1/2表達(dá)的影響

吳遠(yuǎn)華 司凱隆1

(貴陽中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，貴州 貴陽 550002)

目的 探討三叉神經(jīng)痛的發(fā)病機(jī)制及苗藥血飛蓽茇定痛湯治療該癥的應(yīng)用價(jià)值。方法 采用祛風(fēng)清熱通絡(luò)法，運(yùn)用慢性縮窄環(huán)法制作三叉神經(jīng)痛模型大鼠，造模成功后進(jìn)行模型動(dòng)物三叉神經(jīng)節(jié)離體培養(yǎng)，對培養(yǎng)后的神經(jīng)節(jié)進(jìn)行WEIL髓鞘染色、HE染色與甲苯胺藍(lán)染液染色和常規(guī)電鏡制片。采用免疫組化檢測p-ERK1/2的表達(dá)。結(jié)果 光電鏡結(jié)果顯示：陰性和低劑量組神經(jīng)纖維變性，軸突不規(guī)則或消失；中、高劑量組及空白組神經(jīng)纖維未見明顯變化?？R西平組三叉神經(jīng)節(jié)p-ERK1/2表達(dá)量最低，其余造模組均高于卡馬西平組，依次為：中劑量組<高劑量組<陰性對照組<低劑量組<空白組；苗藥對卡馬西平組三叉神經(jīng)節(jié)p-ERK1/2表達(dá)的抑制作用最強(qiáng)，高、中劑量組明顯低于空白組，高、中劑量組p-ERK1/2表達(dá)量下調(diào)(P<0.05)。結(jié)論 一定劑量的苗藥可能緩解三叉神經(jīng)痛，可能是通過抑制ERK的激活而實(shí)現(xiàn)的。

三叉神經(jīng)痛；三叉神經(jīng)節(jié)；祛風(fēng)清熱通絡(luò)法

原發(fā)性三叉神經(jīng)痛是一種臨床上常見的疾病，其特點(diǎn)是面部發(fā)作性的劇烈疼痛，發(fā)病率達(dá)0.4%～0.5%〔1〕，但其發(fā)病機(jī)制尚不完全明確。中醫(yī)認(rèn)為：肝風(fēng)內(nèi)動(dòng)，肝胃火盛，風(fēng)火相燔，竄逆于面，瘀阻脈絡(luò)，不通則痛，腎功能失常亦通過影響肝胃而致病，故在病機(jī)分析中肝胃為主病臟腑。苗藥有祛風(fēng)清熱通絡(luò)之功效，常用來祛瘀止痛等。根據(jù)中醫(yī)肝胃藏象及經(jīng)絡(luò)理論，在苗藥血飛蓽茇定痛湯穴臨床運(yùn)用療效滿意的基礎(chǔ)上，擬以祛風(fēng)清熱通絡(luò)法為核心治法對三叉神經(jīng)痛模型大鼠展開實(shí)驗(yàn)研究，探討苗藥血飛蓽茇定痛湯治療的作用機(jī)制和靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物 苗藥血飛蓽茇定痛湯方藥制劑由貴陽中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院中藥制劑室提供，配方組成：見血飛(飛龍掌血)、苕葉細(xì)辛、白芷、全蝎，蜈蚣、大血藤、川芎、赤芍、白芍、炙甘草。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇、分組及給藥方法 成年雄性健康SD大鼠，體質(zhì)量(250±20)g。在術(shù)前對疼痛閾值(作為基礎(chǔ)痛閾)進(jìn)行測定，并實(shí)施左側(cè)眶下神經(jīng)-慢性縮窄損傷(ION-CCI)環(huán)扎術(shù)。術(shù)后14 d，觀察大鼠是否出現(xiàn)痛覺超敏現(xiàn)象，并納入出現(xiàn)該現(xiàn)象的大鼠。納入大鼠通過隨機(jī)數(shù)字表法分組：空白組：自然環(huán)境、普通飼料飼養(yǎng)，以生理鹽水灌胃，1次/d，共14 d；陰性組：測定術(shù)前疼痛閾值(作為基礎(chǔ)痛閾)后，進(jìn)行左側(cè)眶下神經(jīng)(ION-CC)環(huán)扎術(shù)制作三叉神經(jīng)痛大鼠模型，通過對環(huán)扎線標(biāo)記比較其松緊度及手術(shù)線的選擇等優(yōu)化選擇造模方法的指標(biāo)，選出最優(yōu)造模方案。造模成功后以生理鹽水灌胃，1次/d，共14 d；治療組：造模成功后給予苗藥血飛蓽茇定痛湯灌胃，高、中、低劑量分別按成人臨床用藥劑量的20倍、10倍、5倍計(jì)算，灌胃1次/d，共14 d；陽性對照藥卡馬西平組：造模成功后給予卡馬西平治療，相當(dāng)于成人劑量的10倍，灌胃1次/d，共14 d。

1.3 超微結(jié)構(gòu)與病理形態(tài)學(xué)觀察 術(shù)后14 d，處死各組大鼠，將大鼠三叉神經(jīng)節(jié)、眶下神經(jīng)組織取出后，選擇10%甲醛固定，石蠟包埋后切片，分別進(jìn)行WEIL髓鞘染色、蘇木素-伊紅(HE)染色與甲苯胺藍(lán)染液染色(著色后的節(jié)細(xì)胞藍(lán)染)。之后常規(guī)電鏡制片，進(jìn)行觀察。

1.4 p-ERK1/2表達(dá)的檢測 各組大鼠完成實(shí)驗(yàn)后，在規(guī)定時(shí)間內(nèi)通過1%戊巴比妥鈉行腹腔麻醉(40 mg/kg體重)。麻醉后予以開胸，將右心耳剪開，并從左心室插管至主動(dòng)脈，選擇150 ml 0.9%氯化鈉注射液(室溫)快速灌注后，再以含40 g/L多聚甲醛的0.1 mol/L磷酸鈉鹽緩沖液(PBS)500 ml(4℃)灌注固定2 h。將大鼠腦組織取出，置入含300 g/L蔗糖的0.1 mol/L PBS內(nèi)，在4℃冰箱中放置，直到沉底。冠狀冰凍切片，切片厚度為20 μm。嚴(yán)格按照說明書要求進(jìn)行p-ERK免疫組織化學(xué)染色。通過IPP 6.0圖像分析系統(tǒng)對表達(dá)進(jìn)行檢測，并對三叉神經(jīng)節(jié)(10×20倍)視野中p-ERK陽性細(xì)胞區(qū)域的積分光密度值總和(Dsum)予以測定，計(jì)算平均光密度值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0軟件行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 光鏡觀察 低劑量組與陰性組大鼠神經(jīng)纖維變性增粗、腫脹，軸突不規(guī)則或消失，未見神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，半髓鞘增厚，疏松、瓦解或呈節(jié)段性脫髓鞘，纖維松解斷，神經(jīng)周圍小動(dòng)脈管壁增厚，管腔狹窄，大部分病例神經(jīng)周圍纖維組織增生。中、高劑量組及空白組神經(jīng)纖維未見明顯變化。見圖1。

2.2 電鏡觀察 陰性和低劑量組神經(jīng)纖維髓鞘增生、結(jié)構(gòu)紊亂，軸突變細(xì)或消失；線粒體腫脹，數(shù)量增多，位于軸突的邊緣。中、高劑量組及空白組神經(jīng)纖維髓鞘及線粒體未見明顯變化。見圖2。

圖1 各組光鏡檢查結(jié)果(HE染色)

圖2 各組電鏡檢查結(jié)果

2.3 三叉神經(jīng)節(jié)中p-ERK1/2表達(dá) 卡馬西平組三叉神經(jīng)節(jié)p-ERK1/2表達(dá)量最低(0.271 2±0.036 3)，其余造模組均高于卡馬西平組，依次為：中劑量組(0.284 8±0.019 3)<高劑量組(0.289 7±0.032 9)<陰性對照組(0.317 2±0.031 3)<低劑量組(0.337 7±0.032 5)<空白組(0.344 8±0.047 5)；苗藥對卡馬西平組三叉神經(jīng)節(jié)p-ERK1/2表達(dá)的抑制作用最強(qiáng)，高、中劑量組明顯低于空白組(P<0.05)。

3 討 論

祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為，面痛為肝膽風(fēng)火或陽明燥熱，久病入絡(luò)，瘀血阻滯經(jīng)脈所致。面部為陽明經(jīng)(胃經(jīng))及少陽經(jīng)(膽經(jīng))所過之處。根據(jù)經(jīng)絡(luò)理論，胃與大腸均屬陽明、膽為少陽，足厥陰肝經(jīng)與膽、胃二經(jīng)經(jīng)氣相通?！鹅`樞·經(jīng)脈》曰：“肝足厥陰之脈…，挾胃，屬肝、絡(luò)膽。本病呈發(fā)作性，突發(fā)突止，符合肝風(fēng)的特性，肝膽火盛，肝胃郁熱或肝腎陰虛，虛風(fēng)內(nèi)動(dòng)，挾胃膽二經(jīng)之氣血隨之升騰上逆，上擾面之清竅，流竄面之經(jīng)絡(luò)，引動(dòng)絡(luò)之伏邪而發(fā)為面痛。故該病與肝胃關(guān)系密切，治療以祛風(fēng)清熱通絡(luò)法為核心，以血飛蓽茇定痛湯平肝熄風(fēng)，清胃瀉熱，祛瘀止痛。

原發(fā)性三叉神經(jīng)痛屬神經(jīng)系統(tǒng)常見病，主要表現(xiàn)為三叉神經(jīng)分布區(qū)不同程度的針刺樣、撕裂樣及電擊樣疼痛，持續(xù)時(shí)間十幾秒到數(shù)分鐘不等，呈陣發(fā)性，疼痛劇烈且急驟，嚴(yán)重者甚至?xí)捉兰罢Z言功能造成影響，復(fù)發(fā)率高，病程遷延難愈?？R西平是目前治療該癥的首選藥物，但此藥物可引起多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的副作用，患者難以耐受，治療依從性較差。

對于原發(fā)性三叉神經(jīng)痛的病因一直存在爭議，有研究發(fā)現(xiàn)三叉神經(jīng)痛的半月神經(jīng)節(jié)和周圍支有明顯的髓鞘增生與退行性變〔2〕。與本研究的觀察結(jié)果一致，提示三叉神經(jīng)的脫髓鞘改變是三叉神經(jīng)痛的主要病理改變和主要病因，髓鞘變性，可使神經(jīng)節(jié)部分或全部脫髓鞘，使神經(jīng)軸突暴露，當(dāng)這些暴露的神經(jīng)軸突相互接觸時(shí)，可產(chǎn)生觸電樣的陣發(fā)性疼痛。當(dāng)脫髓鞘的軸突與一個(gè)失去了雪旺細(xì)胞并且變性的無髓鞘軸突相接觸時(shí)，同樣可發(fā)生這樣的情況。這種短路一直要持續(xù)到變性的神經(jīng)軸突消失為止，疼痛才能緩解。當(dāng)產(chǎn)生其他脫髓鞘神經(jīng)軸突變性時(shí)，疼痛又可再度發(fā)生而使病情加劇。

有研究指出：白芷中的總香豆素類成分具有明顯的鎮(zhèn)痛作用〔3〕；血藤中的地血香成分具有祛風(fēng)除濕，散瘀活絡(luò)等作用〔4〕；赤芍與其他中藥聯(lián)合使用，具有行氣止痛、活血定痛等功效，起到保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的作用〔5〕；而見血飛具有明顯的鎮(zhèn)痛效果在文獻(xiàn)中也有提到〔6〕；在現(xiàn)代藥理研究中提到川芎具有擴(kuò)張血管，加速血流，開放毛細(xì)血管網(wǎng)，改善微循環(huán)的作用〔7〕。用祛風(fēng)清熱通絡(luò)法治療三叉神經(jīng)痛，其療效好，可以緩解三叉神經(jīng)痛患者的疼痛癥狀。

真核細(xì)胞內(nèi)存在廣泛的絲分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，對細(xì)胞的分化、增殖以及細(xì)胞凋亡抑制等功能具有促進(jìn)作用，其主要由3條通路組成，分別為P38信號通路、ERK1/2信號通路、JNK信號通路〔8〕。而在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)中處于樞紐地位的ERK1/2通路會(huì)受到神經(jīng)遞質(zhì)、激素、血管肽類及炎性因子等細(xì)胞外信號分子刺激，并通過G-蛋白和細(xì)胞內(nèi)一系列蛋白激酶級聯(lián)活化反應(yīng)及跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，使膜受體出現(xiàn)一系列生物學(xué)效應(yīng)，如表達(dá)調(diào)變、細(xì)胞生長、分化、增殖和移動(dòng)等〔9，10〕；細(xì)胞外信號相關(guān)蛋白激酶(ERK)是信號通路多個(gè)上游區(qū)調(diào)節(jié)器的最后共同效應(yīng)器，是將信號從膜表面受體轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞核的關(guān)鍵。因此只要阻滯了ERK的激活，就有可能阻止胞外信號向胞內(nèi)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而影響中樞致敏和突觸的可塑性〔11〕。有研究指出，ERK1/2在三叉神經(jīng)脊束核痛覺信號的傳導(dǎo)和調(diào)節(jié)中起重要作用〔12〕。p-ERK是初級傳入感受傷害神經(jīng)元興奮的重要解剖學(xué)標(biāo)志〔13〕。因此，監(jiān)測p-ERK1/2的表達(dá)量可衡量痛覺信號傳導(dǎo)。

本研究結(jié)果推測，苗藥中某些成分使p-ERK1/2表達(dá)下調(diào)，影響細(xì)胞信號的傳導(dǎo)，負(fù)責(zé)疼痛信號傳導(dǎo)的蛋白或酶不能接受信號而不能發(fā)生后續(xù)的酶聯(lián)反應(yīng)，從而減少了疼痛的表現(xiàn)。相類似的研究如Chen等〔14〕發(fā)現(xiàn)，在周圍神經(jīng)CCI術(shù)后引起的神經(jīng)病理性痛的動(dòng)物模型中，鞘內(nèi)給予ERK抑制劑PD98059后可以減輕大鼠神經(jīng)病理性痛的表現(xiàn)，說明在產(chǎn)生痛覺敏化的過程中脊髓背角ERK的激活起了關(guān)鍵作用。

另外，苗藥中含有多種止痛鎮(zhèn)痛的成分。在多種成分的共同鎮(zhèn)痛作用下，使起作用的有效分子的含量增高，而細(xì)胞外信號分子含量相對減少，信號不能從胞內(nèi)傳到胞外，跨膜分子的級聯(lián)反應(yīng)受到影響，ERK激活受阻，進(jìn)而影響其合成，疼痛信號傳導(dǎo)不能正常進(jìn)行。

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〔2016-02-17修回〕

(編輯 袁左鳴)

貴州省科學(xué)技術(shù)基金項(xiàng)目：黔科合J字〔2011〕2303號

1 貴陽中醫(yī)學(xué)院

司凱隆(1989-)，男，住院醫(yī)師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合神經(jīng)性疼痛的研究。

吳遠(yuǎn)華(1976-)，男，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合治療腦血管病研究。

R745.1+1

A

1005-9202(2016)23-5824-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.23.022