匡 釗

(江蘇省揚州市食品藥品檢驗檢測中心，江蘇 揚州 225009)

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高效液相色譜法測定復方魚腥草顆粒中黃芩苷和黃芩素含量

匡 釗

(江蘇省揚州市食品藥品檢驗檢測中心，江蘇 揚州 225009)

目的 建立同時測定復方魚腥草顆粒中黃芩苷和黃芩素含量的方法。方法 采用高效液相色譜法，以Thermo-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)為色譜柱，以乙腈-0.1%甲酸溶液為流動相，進行梯度洗脫，流速為1.0 mL/min，進樣量為10 μL，檢測波長為274 nm，柱溫為25 ℃。結果 可在30 min內(nèi)完成對黃芩苷和黃芩素的色譜分析，測得的黃芩苷的線性范圍為0.069～0.34 mg/mL，r=0.999 8，平均回收率為99.5%(RSD=3.33%)；黃芩素的線性范圍為0.005～0.025 mg/mL，r=0.999 4，平均回收率為102.7%(RSD=2.44%)。結論 所建立的高效液相色譜法方便快捷、準確、簡便、重復性好，可用于復方魚腥草顆粒的質(zhì)量控制。

復方魚腥草顆粒；黃芩苷；黃芩素；高效液相色譜法

復方魚腥草顆粒是由復方魚腥草片改型的中藥四類新藥，主要是由魚腥草、黃芩、板藍根、連翹、金銀花組成，其中黃芩性寒味苦，可以用于清熱燥濕、瀉火解毒；魚腥草性微寒味腥，具有清熱解毒、利尿排膿的功效，并且能夠抗炎，抗病毒，增強機體的免疫力；板藍根性寒味苦，不僅清熱解毒，而且涼血利咽，與魚腥草合用可以增強其清熱解毒的作用；金銀花性寒味苦，具備疏散風熱、清熱解毒的功效；連翹性微寒味苦，具有清熱解毒、消腫散結的效用[1-2]。

復方魚腥草顆?？梢郧鍩岫?、散風邪、消腫痛，對細菌和病毒均有顯著的抑制作用，是治療小兒急性上呼吸道感染[1-2]、小兒急性扁桃體炎風熱證[3]、小兒急性支氣管肺炎[4]等病證的有效藥物。

方中黃芩既助君藥清熱解毒，又可瀉火通腑，使邪有出路，功兼佐使[5]。黃芩的主要活性成分為黃芩苷等黃酮類化合物，而現(xiàn)代藥理研究[6-7]表明，黃芩苷和黃芩素具有抗菌、抗氧化、解熱、鎮(zhèn)痛抗炎、抗病毒、抗變態(tài)反應的作用。因此，已有人采用薄層掃描法[8]、UPLC-MS/MS法[9]、高效液相色譜法[10]等方法對黃芩中黃芩苷和黃芩素的含量測定方法進行了研究。

目前，復方魚腥草顆粒在國內(nèi)僅由邦琪藥業(yè)獨家生產(chǎn)，執(zhí)行標準為國家食品藥品監(jiān)督管理局新藥轉(zhuǎn)正標準第62冊，該標準對方中魚腥草、連翹、金銀花進行初步的質(zhì)量控制(即薄層鑒別)，含量測定則以黃芩中黃芩苷的含量(每袋不得少于48.0 mg)為準，這具有一定的片面性，給藥品的質(zhì)量監(jiān)測帶來一定難度。本研究通過建立合理高效的高效液相色譜法來同時測定黃芩苷和黃芩素的含量，從而進一步加強對復方魚腥草顆粒的質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 安捷倫LC1260高效液相色譜儀系統(tǒng)：安捷倫科技(中國)有限公司，主要由G1311C高壓輸液泵、G1329B自動進樣器、G1316A柱溫箱、G1314B紫外檢測器和M8301AA色譜工作站組成；MS204S電子天平：梅特勒-托利多；KH-400KDB高功率數(shù)控超聲波清洗器：江蘇省昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；Millipore超純水機。

1.2 試藥 黃芩苷(baicalin)對照品：中國食品藥品檢定研究院，批號 110715-201117，含量91.7%；黃芩素(baicalein)對照品：中國藥品生物制品檢定所，批號 11595-200301；復方魚腥草顆粒：廣西邦琪藥業(yè)集團有限公司，批號分別為140403、140515、140711；乙腈(色譜純)：DIKMA科技公司；甲酸(分析純)、甲醇(分析醇)、乙醇(分析醇)：國藥集團化學試劑有限公司；去離子水：由揚州市食品藥品檢驗檢測中心自制。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱：Thermo-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流動相：乙腈(A)-0.1%甲酸(B)，梯度洗脫(0～15 min，28% A，72% B；16～40 min，45% A，55% B；41～45 min，28% A，72% B)；流速：1.0 mL/min；紫外檢測波長：274 nm；柱溫：25 ℃；進樣量10 μL。在此色譜條件下，樣品中黃芩苷和黃芩素能達到有效分離。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品儲備液 分別精密稱取黃芩苷對照品124.6 mg、黃芩素對照品12.6 mg至200 mL和100 mL棕色容量瓶，加入適量的70%甲醇溶液，超聲使溶解，再用70%甲醇溶液定容至刻度，搖勻，分別制成0.571 3 mg/mL的黃芩苷對照品溶液和0.126 mg/mL的黃芩素對照品溶液，作為對照品儲備液。

2.2.2 混合對照品溶液 精密吸取黃芩苷對照品儲備液9 mL、黃芩素對照品儲備液3 mL于同一25 mL棕色容量瓶中，然后用70%的甲醇溶液稀釋至刻度，混勻，即得0.205 7 mg/mL黃芩苷、0.015 12 mg/mL黃芩素的混合對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液 取復方魚腥草顆粒6 g，研細，精密稱定1.0 g，至100 mL具塞錐形瓶中，精密加70%甲醇溶液50 mL，稱定質(zhì)量，超聲提取20 min，放冷，用70%甲醇溶液補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，過0.45 μm微孔濾膜(上海半島實業(yè)有限公司凈化器材廠)后，得到的濾液作為供試品溶液。

2.2.4 陰性樣品溶液 按復方魚腥草顆粒的處方比例稱取魚腥草、板藍根、連翹、金銀花這四味藥材，按照復方魚腥草顆粒的制備工藝制成不含黃芩的陰性樣品，并按“2.2.3”項下操作方法，制得陰性樣品溶液。

2.3 系統(tǒng)適應性試驗和方法專屬性考察 精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，在“2.1”項下的色譜條件下測定，結果在對照品色譜和復方魚腥草顆粒供試品色譜圖的相應位置(保留時間為8.239、22.254 min)上，確認了黃芩苷和黃芩素的吸收峰，且黃芩苷、黃芩素色譜峰與其相鄰色譜峰的分離度遠大于1.5。通過對混合對照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液色譜圖的比較，可以看出，陰性樣品溶液的色譜圖中沒有黃芩苷和黃芩素的吸收峰，故可認為處方中的其他成分對測定結果無影響?；旌蛯φ掌啡芤骸⒐┰嚻啡芤汉完幮詷悠啡芤旱纳V圖分別見圖1。

圖1 混合對照品(A)、供試品(B)和陰性樣品(C)溶液的高效液相色譜圖(1.黃芩苷;2.黃芩素)

2.4 線性關系試驗 精密吸取黃芩苷對照品儲備液3、6、9、12、15 mL，黃芩素對照品儲備液1、2、3、4、5 mL，分別置于5個25 mL棕色容量瓶中，加70%的甲醇溶液定容，搖勻，得5個不同濃度的混合對照品溶液。按照“2.1”項下的色譜條件進樣測定，以濃度X為橫坐標，峰面積Y為縱坐標，繪制黃芩苷和黃芩素的標準曲線。結果表明，黃芩苷的進樣量在0.068 55～0.342 8 mg/mL范圍內(nèi)，黃芩素的進樣量在0.005 04～0.025 2 mg/mL的范圍內(nèi)，濃度與峰面積的線性關系良好(黃芩苷：Y=35 061X+31.756，r=0.999 8；黃芩素：Y=54 373X-43.722，r=0.999 4)。

2.5 精密度試驗 取“2.2.2”項下的混合對照品溶液，按照“2.1”項下的色譜條件，連續(xù)進樣6次，每次10 μL，分析黃芩苷和黃芩素的峰面積，計算得黃芩苷和黃芩素峰面積的RSD分別為0.426 9%和0.843 9%。結果表明儀器精密度良好。

2.6 重復性試驗 取同一批號的復方魚腥草顆粒(批號 140515)約10 g，按照“2.2.3”項下的供試品制備方法，平行制備6份供試品溶液，然后在“2.1”項下的色譜條件下進樣，由儀器分析得到的黃芩苷和黃芩素的峰面積分別計算出6組黃芩苷和黃芩素的含量，結果黃芩苷和黃芩素的平均含量分別為8.791 1、0.473 8 mg/g，其RSD分別為0.428 1%、0.810 6%，表明方法的重復性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗 取同一批號的復方魚腥草顆粒(批號 140515)約1 g，按照“2.2.3”項下的方法制備供試品溶液，然后分別在0、3、6、9、12、24 h時按照“2.1”項下的色譜條件進行分析，經(jīng)計算黃芩苷和黃芩素峰面積的RSD分別為0.124 1%、0.585 0%。結果表明，樣品中黃芩苷和黃芩素在室溫條件下24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗 取同一批號的復方魚腥草顆粒(140515)1袋(6 g)，研細，分為6份，每份約0.5 g，精密稱定，分別置于100 mL的具塞錐形瓶中，再分別精密加入“2.2.1”項下的黃芩苷對照品溶液8 mL及黃芩素對照品溶液2 mL，然后精密吸入70%甲醇溶液40 mL，稱定質(zhì)量，超聲20 min后，用70%甲醇溶液補足質(zhì)量，過濾，濾液過0.45 μm微孔濾膜，得到的濾液為樣品溶液，將制得的6份樣品溶液按照“2.1”項下的色譜條件進行分析。計算得黃芩苷和黃芩素的平均回收率分別為99.52%、102.68%，表明方法的回收率良好。見表1。

表1 加樣回收率試驗結果

2.9 檢測限和定量限 逐步稀釋黃芩苷和黃芩素混合對照品溶液，以信噪比為3∶1確定其最低檢測限，黃芩苷和黃芩素最低檢測限分別為0.374、0.605 μg/mL。以信噪比為10∶1確定其最低定量限，黃芩苷和黃芩素最低定量限分別為0.897、1.512 μg/mL。

2.10 樣品的含量測定 取3批復方魚腥草顆粒(批號分別為140403、140515、140711)各6 g，每批取2份，每份精密稱定1 g，按照“2.2.3”項下的供試品制備方法制備供試品溶液，再按照“2.1”項下的色譜條件進行分析，精密吸取對照品溶液和供試品溶液各10 μL，記錄色譜峰面積，按照外標一點法計算出復方魚腥草顆粒中黃芩苷和黃芩素含量。結果3批樣品中黃芩苷的平均含量分別為8.486 1、8.516 55、8.443 2 mg/g，RSD分別為0.640 7%、0.181 3%、0.775 5%；黃芩素的平均含量分別為0.495 15、0.473 85、0.479 8 mg/g，RSD分別為0.848 3%、0.698 3%、0.299 8%。結果表明，3批藥品中黃芩苷和黃芩素的含量差別較小且其RSD均小于3%，說明不同批號的復方魚腥草顆粒的質(zhì)量相差不大。

3 討論

3.1 測定波長的選擇 取黃芩苷和黃芩素的混合對照品溶液，采用DAD在190～400 nm內(nèi)全波長掃描，結果發(fā)現(xiàn)黃芩苷和黃芩素在274 nm處均有吸收，且共同吸收最大，同時可排除雜質(zhì)對待測物的干擾，所以選擇274 nm為本實驗的檢測波長。

3.2 流動相的選擇 高效液相色譜法測定黃芩苷和黃芩素的含量時，流動相組成主要有乙腈-0.1%甲酸水溶液[11]、乙腈-0.1%冰醋酸溶液[12]、甲醇-0.4%磷酸溶液[13]、甲醇-0.1%磷酸溶液[14-15]等。所以采用不同比例的甲醇-水系統(tǒng)，甲醇-甲酸水系統(tǒng)，甲醇-磷酸系統(tǒng)，乙腈-水系統(tǒng)，乙腈-甲酸水系統(tǒng)和乙腈-磷酸系統(tǒng)進行流動相的考察。結果發(fā)現(xiàn)，流動相中加入一定比例的酸有助于提高待測物與干擾峰的分離度，且由于磷酸對色譜柱會有損傷，所以最終選擇了乙腈-甲酸水系統(tǒng)。再通過對甲酸的濃度考察，最終選用乙腈-0.1%甲酸水溶液作為流動相。

流動相選定后，通過將一定比例(乙腈-甲酸水(30∶70))洗脫和各種梯度洗脫的結果進行對比，結果以乙腈(A)-0.1%甲酸水溶液(B)為流動相，線性梯度洗脫為：0～15 min，28% A；15～16 min，28%～45% A；16～40 min，45% A；40～41 min，45%～28% A；41～45 min，28% A時，洗脫效果最佳。

3.3 提取工藝的選擇

3.3.1 提取溶劑的選擇 雖然黃芩苷為苷類化合物，但其與黃芩素均含有大π苯環(huán)結構，故水溶性不是很好。為了更好地提取黃芩苷和黃芩素，本實驗決定采用有機溶劑提取。許揚彪[16]在復方魚腥草顆粒的質(zhì)量標準研究中用70%的乙醇溶液作為提取溶劑；而余星云等[17]在復方魚腥草滴丸中黃芩苷的含量測定研究中以甲醇為溶劑制備供試品溶液。故本實驗采用50%甲醇溶液、70%甲醇溶液、100%甲醇溶液、50%乙醇溶液、70%乙醇溶液和100%乙醇溶液為溶劑，用超聲10 min的方法提取復方魚腥草顆粒，結果顯示70%甲醇溶液提取得到的黃芩苷和黃芩素的含量最高，分別為10.057 6、0.554 4 mg/g。

3.3.2 提取方法的選擇 黃芩苷和黃芩素的提取方法主要有煎煮法[18]、水提酸沉法[19]、回流提取法[20]、超聲提取法[21]等，由于本次實驗選擇的溶劑為50 mL 70%甲醇溶液，故通過10、20、30 min超聲提取及10、20、30 min回流提取的實驗結果相比較，發(fā)現(xiàn)20 min超聲提取黃芩苷和黃芩素的效果最好。在此條件下，得到的黃芩苷和黃芩素的含量分別為10.1850、0.518 2 mg/g。

3.3.3 樣品稱樣量的選擇 在選定提取方法為50 mL 70%甲醇溶液超聲20 min后，就稱樣量對含量測定的影響做了研究。實驗分別稱取了0.5、1.0、1.5 g的復方魚腥草顆粒做平行試驗，結果黃芩苷的含量分別為9.183 7、10.185 0、9.693 9 mg/g；黃芩素的含量分別為0.475 9、0.518 2、0.524 1 mg/g。因此，盡管稱取1.5 g復方魚腥草顆粒樣品時，黃芩素的含量最高，但當復方魚腥草顆粒的稱樣量為1.0 g時，黃芩苷的含量最高，且黃芩素的含量也與1.5 g樣品時相差很少，故選擇1.0 g為藥品的稱樣量。

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Determination of Baicalin and Baicalein in Compound Yuxingcao Granule by High-performance Liquid Chromatography

KUANG Zhao

(Yangzhou Center for Food and Drug Control, Jiangsu Yangzhou 225009, China)

Objective To establish a method for simultaneous determination of baicalin and baicalein in compound Yuxingcao Granule. Methods High-performance liquid chromatography (HPLC) was performed on a Thermo-C18column (4.6 mm × 250 mm, 5 μm) with a mobile phase of acetonitrile-0.1% formic acid for gradient elution at a flow rate of 1.0 mL/min, a sample size of 10 μL, a detection wavelength of 274 nm, and a column temperature of 25 ℃. Results The chromatographic analysis of baicalin and baicalein was completed within 30 minutes. Baicalin and baicalein showed a good linear relationship within the ranges of 0.069-0.34 mg/mL(r=0.999 8) and 0.005-0.025 mg/mL (r=0.999 4), respectively, with average recovery rates of 99.5% (RSD=3.33%) and 102.7% (RSD=2.44%), respectively. Conclusion The HPLC method established is quick, accurate, and convenient and has good repeatability. Therefore, it can be used for quality control of compound Yuxingcao Granule.

Compound Yuxingcao Granule; Baicalin; Baicalein; High-performance liquid chromatography

匡釗(1990-)，男，藥師

R284.1

10.3969/j.issn.2095-7246.2016.06.024

2016-06-28；編輯：姚實林)