段廣亮 戴輝萍 唐婷婷 丁飛 朱桂婷

喉癌干細(xì)胞的培養(yǎng)及其放射抗拒相關(guān)miRNA的篩選研究

段廣亮 戴輝萍 唐婷婷 丁飛 朱桂婷

目的 通過培養(yǎng)Hep-2喉癌細(xì)胞株，分離并擴(kuò)增出腫瘤干細(xì)胞，放療后篩選出調(diào)控放射抗拒的miRNA。方法 含生長(zhǎng)因子的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)Hep-2喉癌細(xì)胞株，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞中側(cè)群細(xì)胞的比例。當(dāng)側(cè)群細(xì)胞比例達(dá)25%時(shí)，收集全部細(xì)胞球，篩選出CD133+、CD44+細(xì)胞作為喉癌干細(xì)胞，X線照射喉癌干細(xì)胞。miRNA生物芯片檢測(cè)照射與未照射的喉癌干細(xì)胞，篩選出喉癌干細(xì)胞中2倍差異表達(dá)的miRNA，確定用以調(diào)控放射抗拒的miRNA。結(jié)果 成功培養(yǎng)出側(cè)群細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)其比例達(dá)到26.2%，篩選出的CD133+、CD44+細(xì)胞的比例均高于91%。通過miRNA芯片成功檢測(cè)出喉癌干細(xì)胞中2倍差異表達(dá)的miRNA。結(jié)論 本研究成功培養(yǎng)出喉癌干細(xì)胞，成功篩選出喉癌干細(xì)胞中2倍差異表達(dá)的miRNA，發(fā)現(xiàn)了可能用以調(diào)控放射抗拒的miRNA。

無血清培養(yǎng)基 miRNA 側(cè)群細(xì)胞 放療

腫瘤干細(xì)胞是腫瘤組織中少數(shù)具有自我更新、無限增殖及多向分化潛能的細(xì)胞，且具有放射抵抗能力，因此腫瘤干細(xì)胞被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生、發(fā)展和放射抵抗的根源。側(cè)群細(xì)胞和CD133+、CD44+腫瘤細(xì)胞是較為認(rèn)可的頭頸部鱗狀細(xì)胞癌（HNSCC）的標(biāo)志干細(xì)胞[1]。miRNA是目前腫瘤細(xì)胞內(nèi)已知的一類最重要的基因調(diào)控分子，特異性miRNA對(duì)腫瘤干細(xì)胞的細(xì)胞特性起獨(dú)特而重要的調(diào)控作用[2-6]，包括對(duì)輻射耐受基因的調(diào)控作用。放射特異miRNA對(duì)腫瘤干細(xì)胞放射抗拒相關(guān)基因發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[7-9]。放療是治療喉癌的重要方法，但喉癌細(xì)胞的放射抗拒仍是目前嚴(yán)重干擾療效的難題。本研究通過模擬放療照射喉癌干細(xì)胞，比較照射與未照射的喉癌干細(xì)胞的基因檢測(cè)結(jié)果，篩選出喉癌干細(xì)胞中2倍差異表達(dá)的miRNA,結(jié)合miRNA靶基因預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)miGEN結(jié)果，確定擬調(diào)控的放射抗拒相關(guān)基因及miRNA，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 Anti-CD44-FITC、Anti-CD133-PE(美國(guó)e－Bioscience公司)，miRNA分離試劑盒 (美國(guó)Ambion公司)，miRNA芯片（丹麥Exiqon公司），重組表皮生長(zhǎng)因子（EGF）、成纖維生長(zhǎng)因子(bFGF)（美國(guó)PeproTech公司），流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）

1.2 方法

1.2.1 干細(xì)胞微球體分離培養(yǎng) 將Hep-2喉癌細(xì)胞株接種于含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)傳代。待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%瓶底面積時(shí)，用PBS液清洗，質(zhì)量濃度為2．5g/L的胰蛋白酶消化，吸管反復(fù)吹打制成單細(xì)胞懸液。離心除去終止消化時(shí)殘留的含血清培養(yǎng)基后重懸于無血清培養(yǎng)基中，無血清培養(yǎng)基為在DMEM/F12培養(yǎng)基中添加EGF（20μg/L）和bFGF（10μg/L）、L-谷氨酰胺（2mmol/ L）、胰島素（4U/L）、青霉素G（1×105U/L）、鏈霉素（100mg/L）。臺(tái)盼藍(lán)染色、計(jì)數(shù)重懸成103/ml單細(xì)胞懸液，接種于培養(yǎng)瓶，在37℃、5%二氧化碳、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)瓶直立、每日搖數(shù)次以利細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)，觀察微球形成，每2d在每個(gè)培養(yǎng)瓶中加入2ml新鮮無血清培養(yǎng)基，每6d傳代。喉癌細(xì)胞增殖形成細(xì)胞球4d后，Accutase消化、吹打成單細(xì)胞，洗滌后在SFM中傳代培養(yǎng)，以擴(kuò)增和富集喉癌干細(xì)胞，按1∶4的比例傳代。

1.2.2 側(cè)群細(xì)胞檢測(cè) 選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)細(xì)胞懸液密度至1×109/L。準(zhǔn)備2支無菌干燥標(biāo)準(zhǔn)流式上樣管（5ml規(guī)格，聚丙烯材料），2管中分別加入上述細(xì)胞懸液1ml，再加入Hoechst33342溶液至終濃度為5mg/L（Hoechst33342組），同時(shí)在其中1支上樣管中加入維拉帕米溶液至終濃度50mg/L（Hoechst33342+維拉帕米組）。吹打均勻后 37℃恒溫水浴箱作用120min，期間每15min柔和晃動(dòng)上樣管1次，混勻溶液使細(xì)胞充分染色。染色完成后4℃1 000r/min離心10min，棄上清液，加入4℃PBS吹洗1次，4℃1 000r/ min離心 10min，小心抽棄上清液，重懸于4℃含體積分?jǐn)?shù)為2%FBS的PBS中。置于4℃環(huán)境中待上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.3 喉癌干細(xì)胞的篩選 當(dāng)側(cè)群細(xì)胞比例達(dá)25%時(shí)，收集全部生長(zhǎng)細(xì)胞球，制成單細(xì)胞PBS懸液100μl，計(jì)數(shù)細(xì)胞密度為1×107/ml。用臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)活細(xì)胞數(shù)，要求活細(xì)胞數(shù)＞90%～95%。加入Anti-CD44-FITC和Anti-CD133-PE各5μl，4℃避光孵育30min。離心去上清液，PBS洗滌至少3次，1 500r/min，離心3min，200目細(xì)胞網(wǎng)篩過濾。加300μl PBS（pH=7.4），上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.4 喉癌干細(xì)胞的放射處理 采用模擬臨床非致死劑量對(duì)腫瘤干細(xì)胞進(jìn)行放射處理：喉癌干細(xì)胞SFM懸液，調(diào)整細(xì)胞至1×106/ml，接種于6孔培養(yǎng)板中。短期培養(yǎng)后，直線加速器對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行照射，條件為6MV X線垂直照射，劑量率為2Gy/min，照射時(shí)于培養(yǎng)板底部加入1.5cm組織等效填充物，源皮距100cm。照射5Gy/次，共3次，照射間隔72h。

1.2.5 差異miRNA的篩選 miRNA分離試劑盒富集和純化miRNA：總RNA和5倍體積的裂解/結(jié)合緩沖液相混合，加入1/10體積的miRNA勻漿添加劑，冰上孵育，加入1/3體積的無水乙醇，混勻后通過濾管。收集液體加入2/3體積的無水乙醇，混勻后95℃預(yù)熱后二次過濾。用牛腸堿性磷酸酯酶制備標(biāo)記反應(yīng)物，用T4連接酶熒光標(biāo)記miRNA并過柱純化。在熒光miRNA樣本中加入10×GE阻斷劑和2×HiRPM雜交緩沖液，并用雜交儀及其旋轉(zhuǎn)烘箱進(jìn)行miRNA芯片雜交。結(jié)束后分別將芯片在GE緩沖液中清洗，Agilent芯片掃描儀掃描讀取雜交信號(hào)，挑選2倍差異表達(dá)miRNA并分析結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 喉癌干細(xì)胞的誘導(dǎo)和富集 Hep-2喉癌細(xì)胞株接種后2～3h開始大部分細(xì)胞貼壁，第3～7天部分細(xì)胞開始懸浮并增生形成松散的串珠狀，另一部分細(xì)胞凋亡崩解，不能在無血清培養(yǎng)基中存活生長(zhǎng)。第9天時(shí)，串珠狀細(xì)胞團(tuán)分解、凋亡，但仍可見小部分細(xì)胞持續(xù)擴(kuò)增形成細(xì)胞球，輕輕搖晃培養(yǎng)瓶可見不多的細(xì)胞球沉于培養(yǎng)瓶底部。球內(nèi)細(xì)胞折光性較好，連接緊密，不能準(zhǔn)確區(qū)分細(xì)胞與細(xì)胞間的界限。新形成的腫瘤干細(xì)胞球不甚規(guī)則，新生單個(gè)細(xì)胞常以“出芽”的方式連接在球體上。Accutase消化、吹打成單細(xì)胞懸液后第l～2天單個(gè)細(xì)胞間相互聚集連接成“樹枝狀”懸浮于SFM中，第3～4天形成不規(guī)則細(xì)胞球，第5～6天逐漸形成規(guī)則球形。隨著傳代次數(shù)的增加，球體趨于圓形。見圖1。

圖1 無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)喉癌細(xì)胞形成的細(xì)胞球（×200）

2.2 側(cè)群細(xì)胞的分選 Hoechst33342組側(cè)群細(xì)胞能排出熒光染料Hoechst33342而呈弱染色狀態(tài)，位于細(xì)胞流式圖的左下角熒光弱染區(qū)域。Hoechst33342+維拉帕米組中加維拉帕米，抑制了細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能，改變了側(cè)群細(xì)胞外排熒光染料的特性，使側(cè)群細(xì)胞的比例減少到（0.0±0.0）%，經(jīng)多次擴(kuò)增和富集后成功使側(cè)群細(xì)胞達(dá)到26.2%。見圖2。

2.3 喉癌干細(xì)胞的篩選 采用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞微球體，富集喉癌干細(xì)胞。流式細(xì)胞儀分別篩選出CD133+、CD44+喉癌干細(xì)胞。分選前喉癌細(xì)胞CD133+、CD44+的表達(dá)率均低于為3%，分選后均高于91%，分選后喉癌細(xì)胞HE染色可見細(xì)胞分布均勻，體積較大，呈梭形，細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)的比例接近于1∶1，核大濃染，核仁大而突出，有病理性核分裂相，符合惡性腫瘤干細(xì)胞病理特點(diǎn)。見圖3、4。

圖2 側(cè)群細(xì)胞流式檢測(cè)圖（a:Hoechst33342組；b:Hoechst33342+維拉帕米組）

圖3 流式細(xì)胞儀篩選實(shí)體瘤來源的喉癌干細(xì)胞結(jié)果（a：CD44+細(xì)胞；b：CD133+細(xì)胞）

圖4 凋亡細(xì)胞流式檢測(cè)圖（a：喉癌干細(xì)胞；b：喉癌細(xì)胞）

2.4 差異miRNA的篩選結(jié)果 放療前后經(jīng)Agilent芯片掃描儀掃描讀取雜交信號(hào)，挑選2倍差異表達(dá)miRNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)明顯升高2倍以上的miRNA有3條，而明顯降低達(dá)2倍以上的miRNA有15條，其名稱及序列見表1。

表1 2倍差異表達(dá)的miRNA

3 討論

HNSCC居于癌癥病死率的第6位，全世界每年新發(fā)病例50萬，過去幾十年治療HNSCC的主要方法是手術(shù)和放療。臨床證明放療對(duì)HNSCC有一定作用，但治療結(jié)果的進(jìn)展有限，復(fù)發(fā)和治療失敗仍然有相當(dāng)?shù)谋嚷?。本課題組前期開展了一系列喉癌干細(xì)胞相關(guān)的研究：從Hep-2喉癌細(xì)胞株與人實(shí)體瘤組織中成功分離、鑒定并擴(kuò)增了喉癌干細(xì)胞，構(gòu)建了喉癌干細(xì)胞裸鼠成瘤模型，在喉癌干細(xì)胞耐藥/輻射耐受機(jī)制方面取得了部分研究成果。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步從基因角度深入研究喉癌干細(xì)胞放射抗拒的機(jī)制。

miRNA作為一類廣泛存在的非蛋白編碼的小分子RNA，通過轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因的表達(dá)而參與調(diào)控一系列的生命活動(dòng)，包括細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)發(fā)育、器官形成、造血、凋亡，甚至腫瘤發(fā)生。特異性miRNA在腫瘤干細(xì)胞的細(xì)胞特性方面起獨(dú)特而重要的調(diào)控作用，如對(duì)輻射耐受基因的調(diào)控作用?？梢酝茢?，放射特異的miRNA對(duì)腫瘤干細(xì)胞放射抗拒相關(guān)基因發(fā)揮著同樣調(diào)控作用?；谏鲜龇治觯狙芯繉?duì)制備的模擬放療前后喉癌干細(xì)胞的純化miRNA雜交后經(jīng)Agilent芯片掃描儀掃描讀取雜交信號(hào)，挑選2倍差異表達(dá)miRNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)明顯升高2倍以上的miRNA有3條，明顯降低2倍的有15條。國(guó)內(nèi)學(xué)者運(yùn)用基因芯片技術(shù)對(duì)miRNA在喉癌組織與正常組織中表達(dá)譜的差異進(jìn)行了篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有13種miRNA在喉癌組織中的水平較正常組織有顯著差異；其中mir-let-7a、miR-203、miR-205、miR-21、miR-98和miR-16-1的表達(dá)水平在腫瘤組織中升高，miR-100、miR-l-2、miR-122a、miR-143、miR-145、miR-26a-1和miR-34c等7種miRNA在腫瘤組織中的表達(dá)水平降低。Amin等[10]對(duì)人類癌細(xì)胞多種miRNA在放射中的反應(yīng)作了研究，發(fā)現(xiàn)在人宮頸腺癌傳代細(xì)胞系中，miR-21和miR-17-5p隨著照射時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)增加；在人結(jié)腸癌HCT1 16細(xì)胞中，照射后miR-21和miR-17-5p表達(dá)都增強(qiáng)，但在人乳腺癌SKBR3細(xì)胞和人前列腺癌PC3細(xì)胞中卻沒有發(fā)生此現(xiàn)象。這說明特異的miRNA表達(dá)水平在照射后發(fā)生的變化具有細(xì)胞特異性。但目前尚無喉癌干細(xì)胞放療前后的miRNA的表達(dá)差異研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)的這些明顯差異的miRNA為喉癌干細(xì)胞放射抗拒相關(guān)的miRNA。這可能為解決喉癌放療抗拒難題，研發(fā)新型高效的放療增敏劑，提高放療療效提供重要基礎(chǔ)資料。

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Screening of radioresistance-related miRNA from laryngeal cancer stem cells

DUAN Guangliang,DAI Huiping,TANG Tingting,et al. Department of Oncology,the Affiliated Hospital of Hangzhou Normal University,Hangzhou 310015,China

Objective To screen radioresistance-related miRNA from laryngeal cancer stem cells. Methods Laryngeal cancer Hep-2 cells were cultured in SFM containing growth factor,and cancer stem cells(CD133+CD44+)were detected and isolated with flow cytometry.The isolated laryngeal cancer stem cells were exposed to high energy X-ray.The differentially expressed miRNA(2-fold)were screened with miRNAbiologicalchips in irradiated and non-irradiated laryngealcancer stem cells. Results Overtop 91%CD133+CD44+cells were harvested by FACS.The miRNAs of2-fold differentialexpression were successfully screened from irradiated stem cells. Conclusion Laryngeal cancer stem cells have been isolated from Hep-2 cells,and miRNAs related to radioresistance have been screened from laryngealcancerstem cells.

SFM miRNA Side population Radiotherapy

2015-06-29）

（本文編輯：李媚）

2012年杭州市科技計(jì)劃引導(dǎo)項(xiàng)目[杭科計(jì)（2012）259號(hào)（17）]

310015 杭州師范大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤診治中心

段廣亮，E-mail:dglzx333@163.com