金洪國 周敏 何松彬 唐維國

Synphilin-1轉(zhuǎn)基因小鼠紋狀體多巴胺代謝變化的研究

金洪國 周敏 何松彬 唐維國

目的 探討Synphilin-1蛋白對小鼠黑質(zhì)紋狀體多巴胺能神經(jīng)元遞質(zhì)傳遞的影響。方法 利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)制備Synphilin-1轉(zhuǎn)基因小鼠（轉(zhuǎn)基因組，11只），另以野生型小鼠為非轉(zhuǎn)基因組（11只）作對照。通過加速轉(zhuǎn)圈測試和足跡分析觀察兩組小鼠的運動能力。分別測定兩組小鼠的多巴胺及其代謝產(chǎn)物，并且測定參與紋狀體多巴胺代謝酶的表達水平，進行分析比較。結(jié)果 轉(zhuǎn)基因組小鼠的運動能力較非轉(zhuǎn)基因組下降（轉(zhuǎn)圈能力減弱、步長較短），且轉(zhuǎn)基因組小鼠表現(xiàn)為短暫步態(tài)。Synphilin-1蛋白使黑質(zhì)紋狀體多巴胺能神經(jīng)元的多巴胺代謝產(chǎn)物/多巴胺的比例明顯下降（P＜0.05），而參與多巴胺代謝的酶的含量并無明顯變化（P＞0.05）。結(jié)論 Synphilin-1蛋白引起小鼠運動能力損害，對黑質(zhì)紋狀體多巴胺代謝影響主要是通過改變突觸前膜多巴胺能神經(jīng)元遞質(zhì)傳遞來實現(xiàn)的。

Synphilin-1 帕金森病 轉(zhuǎn)基因小鼠 多巴胺 3，4-二羥基苯乙酸

帕金森病是一種緩慢進展的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，主要病理特征是中腦黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元變性、丟失及殘存神經(jīng)元中路易小體的形成[1-2]。帕金森病的病因和發(fā)病機制尚不清楚，可能是遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。家族性帕金森病與遺傳因素有關(guān)，但大多數(shù)患者的病因尚不明了。Synphilin-1是α-Synuclein的相互作用蛋白，在路易小體內(nèi)含量豐富，能促進路易小體樣包涵體的形成，并參與突觸傳遞的許多環(huán)節(jié)[3]，但目前醫(yī)學界對該蛋白的功能仍知之甚少。筆者為了進一步了解Synphilin-1對黑質(zhì)紋狀體多巴胺能神經(jīng)遞質(zhì)傳遞的影響，在Synphilin-1轉(zhuǎn)基因小鼠進行了研究，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料和方法

1.1 轉(zhuǎn)基因小鼠的制備 鼠朊蛋白啟動子載體Mo-PrP.XhoI由美國模式培養(yǎng)物保藏所提供。亞克隆有人類Synphilin-1的cDNA編碼區(qū)的pcDNA3載體，購自美國BD Biosciences公司（批號VT2051），在結(jié)構(gòu)內(nèi)用HA序列作標記[4]。然后將用HA作標簽的全長Synphilin-1 cDNA亞克隆到MoPrP.XhoI載體的XhoI位點上。NotI位切除MoPrPHA-Synphilin-1質(zhì)粒注入到C57BL/6小鼠受精卵，構(gòu)造轉(zhuǎn)基因小鼠[5]。首建小鼠與野生型C57BL/6小鼠交配產(chǎn)生純合子轉(zhuǎn)基因小鼠[5]。通過PCR檢測后代小鼠尾巴活組織內(nèi)的DNA，確定基因型并篩選出轉(zhuǎn)基因小鼠。采用11只轉(zhuǎn)基因小鼠作為轉(zhuǎn)基因組，40～41（40±4）周齡;體重29～37（33±4）g;11只野生型小鼠作為對照組，40～41（40±3）周齡;體重25～37（31±6）g。本實驗在東方生物服務中心及廣島大學神經(jīng)內(nèi)科研究所進行。

1.2 小鼠基因型確定 每只小鼠剪斷1cm尾巴，從尾巴的活組織中提取DNA進行PCR檢測。HA標記的5′端區(qū)域Synphilin-1 DNA通過PCR擴增，使用以下的正向和反向引物：5′-TGTACCCATACGATGTTCC-3′和5′-GTACACATCAGCGATTCCT-3′。

1.3 轉(zhuǎn)基因小鼠運動能力分析 轉(zhuǎn)圈試驗采用日本成茂SR-5R型轉(zhuǎn)圈試驗系統(tǒng)，按照文獻[6]所述進行。小鼠分別置于轉(zhuǎn)圈速度為32r/min及從4r/min加速至40r/min的旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)子上。每只小鼠連續(xù)接受兩種速度的轉(zhuǎn)圈試驗，記錄每只小鼠轉(zhuǎn)圈最長時間用于結(jié)果分析。依據(jù)文獻[7]所述進行步態(tài)分析。小鼠前爪蘸藍色無毒涂料后放置在步行軌道的一端，當小鼠順利步行到軌道的另一端，留下藍色足跡后更換新的白色紙依次進行實驗。連續(xù)6個足跡測定和連續(xù)串行6個足印的步長用于結(jié)果分析。

1.4 高效液相色譜法測定多巴胺及其代謝產(chǎn)物、多巴胺代謝比水平 采用日本島津公司LC-20A型高效液相色譜儀測定兩組黑質(zhì)紋狀體內(nèi)多巴胺、3，4-二羥基苯乙酸（3，4-dihydroxyphenylacetic acid，DOPAC）、高香草酸、3-甲氧酪胺（3-methoxytyra mine，3-MT）含量。然后測定高香草酸+DOPAC/多巴胺、DOPAC/多巴胺、高香草酸/多巴胺、3-MT/多巴胺等多巴胺代謝比水平。色譜柱：ODS柱（日本Eicom公司，AC-ODS型）；流動相：0.1mol/L檸檬酸、0.1mol/L乙酸鈉（87%）、甲醇（13%）、辛烷磺酸鈉（160mg/L），pH 3.9；流速：1.0ml/ min；柱溫：25°C；進樣量：20μl。用氟烷吸入麻醉小鼠后，迅速取出大腦放置于5倍體積的冰冷裂解緩沖液中（0.5%Triton X-100，50mM Tris-HCl，pH 7.4，140 mM KCl和3mM EDTA），并加入蛋白酶抑制劑，勻漿1min后，15 000×g條件下離心20min，取上清液，過纖維膜過濾，將過濾得到的均漿在上述條件下再離心15min，再過濾后進行分析[4]。

1.5 蛋白免疫印跡法測定多巴胺代謝相關(guān)蛋白的表達 用CO2處死小鼠并將其腦組織冷藏（－80°C）。提取腦組織蛋白（50μg）加混有蛋白酶抑制劑（德國Roche Applied Science公司，批號4693116001）的TES緩沖液（50mM Tris，pH 7.5；2mM EDTA；100mM NaCl）經(jīng)4°C變性 30min，在2000×g條件下離心20min，提取上清液，上樣于10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠中電泳1.5h；通過轉(zhuǎn)移系統(tǒng)將分離的蛋白轉(zhuǎn)移至硝化纖維膜上（Whatman型），約60min。5%脫脂奶粉溶液于室溫封閉1h，用TBST（10mM Tris，pH 7.5；0.15M NaCl；0.1%Tween 20）漂洗10min×3次；加入β-肌動蛋白抗體（1∶10 000，Sigma公司A4700型）室溫孵育1h，TBST漂洗10min×3次；加ECL發(fā)光顯色劑，暗室內(nèi)壓片，用洗脫緩沖液洗消化纖維膜30min，測定與多巴胺代謝相關(guān)蛋白：單胺氧化酶A（MAO-A），單胺氧化酶B（MAO-B），兒茶酚氧位甲基轉(zhuǎn)移酶（catechol-O-methyltransferase,COMT）表達水平。α-微管蛋白（αtubulin）作為內(nèi)參，與目的蛋白對比，得到目的蛋白/內(nèi)參比值。

1.6 統(tǒng)計學處理 應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。計量資料用表示，組間比較采用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 Synphilin-1轉(zhuǎn)基因小鼠運動能力分析 在恒定的低速轉(zhuǎn)圈試驗，兩組小鼠比較運動能力差異無統(tǒng)計學意義（數(shù)據(jù)未示出）。然而，在32r/min高速旋轉(zhuǎn)和從4r/min至40r/min的加速轉(zhuǎn)圈測試條件下，轉(zhuǎn)基因組轉(zhuǎn)圈能力（[108±15）、（7±3）s]較非轉(zhuǎn)基因組（[156±38）、（27±15）s]減弱，兩組比較差異均有統(tǒng)計學意義（t= 3.89、4.33，均P＜0.05，圖1A）。兩組連續(xù)6個足跡測定結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因組較非轉(zhuǎn)基因組表現(xiàn)短暫步態(tài)（圖1 B）。兩組連續(xù)串行6個足印的步長統(tǒng)計分析顯示，轉(zhuǎn)基因組步長 （[3.8±0.3）cm]明顯短于非轉(zhuǎn)基因組 （[4.5± 0.2）cm]，差異有統(tǒng)計學意義（t=6.48，P＜0.05，圖1C）。

2.2 Synphilin-1對黑質(zhì)紋狀體中多巴胺及其代謝產(chǎn)物含量的影響 見表1。

表1 Synphilin-1對黑質(zhì)紋狀體中多巴胺及其代謝產(chǎn)物含量的影響（ng）

由表1可見，轉(zhuǎn)基因組黑質(zhì)紋狀體中多巴胺及其代謝產(chǎn)物含量低于非轉(zhuǎn)基因組，但兩組差異無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。

2.3 Synphilin-1對黑質(zhì)紋狀體中多巴胺代謝比水平的影響 見表2。

由表2可見，轉(zhuǎn)基因組的黑質(zhì)紋狀體中多巴胺代謝比水平均低于非轉(zhuǎn)基因組，兩者比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或0.01）。

2.4 兩組的多巴胺代謝相關(guān)蛋白免疫電泳及蛋白表達水平比較 見圖2。

表2 Synphilin-1對黑質(zhì)紋狀體中多巴胺代謝比水平的影響

圖1 Synphilin-1轉(zhuǎn)基因小鼠運動能力分析（A：兩組轉(zhuǎn)圈能力比較；B：兩組的足跡測定比較，轉(zhuǎn)基因組較非轉(zhuǎn)基因組表現(xiàn)短暫步態(tài)；C：兩組的步長比較；N：非轉(zhuǎn)基因組；Tg：轉(zhuǎn)基因組）

圖2 兩組的多巴胺代謝相關(guān)蛋白免疫電泳及蛋白表達水平比較（Tg-：非轉(zhuǎn)基因組；Tg+：轉(zhuǎn)基因組）

由圖2可見，兩組黑質(zhì)紋狀體內(nèi)參與多巴胺代謝酶的水平比較，差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。

3 討論

目前已經(jīng)明確證實有4個基因突變后導致帕金森病，包括α-Synuclein、Parkin、泛素羧基端水解酶-L1和DJ-1[8-12]。在這4個突變基因中，有關(guān)α-Synuclein的研究較多。研究發(fā)現(xiàn)，α-Synuclein在多巴胺能神經(jīng)傳遞中起負性調(diào)節(jié)的作用[13-15]。Synphilin－1蛋白是與α-Synuclein相互作用的蛋白[3，16]。Synphilin-1基因突變是否是引起α-Synuclein聚集，Synphilin-1蛋白 與α-Synuclein之間的關(guān)系如何目前尚不清楚。據(jù)此本研究制備了Synphilin-1轉(zhuǎn)基因小鼠模型，并通過步態(tài)分析評價轉(zhuǎn)基因小鼠的運動能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因小鼠的運動能力減弱，導致這一結(jié)果的關(guān)鍵因素可能是Synphilin-1參與多巴胺的傳遞及分解代謝過程。多巴胺能神經(jīng)元遞質(zhì)傳遞及攝取抑制主要表現(xiàn)為多巴胺及其代謝產(chǎn)物的比例變化。本次研究結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)基因組與非轉(zhuǎn)基因組比較，3-MT/多巴胺、DOPAC/多巴胺、高香草酸/多巴胺代謝比明顯減低。

黑質(zhì)紋狀體內(nèi)的多巴胺為匯集于神經(jīng)末梢的多巴胺（占大部分）和被釋放出的多巴胺的總和。高香草酸為被釋放出的多巴胺和神經(jīng)細胞內(nèi)多巴胺的代謝產(chǎn)物。3-MT為被釋放出細胞外多巴胺的代謝產(chǎn)物，是一個重要的多巴胺釋放指數(shù)；相反，DOPAC是多巴胺在細胞內(nèi)代謝時產(chǎn)生。有研究結(jié)果顯示，Synphilin-1基因表達于突觸前膜，可以通過抑制鉀離子濃度的升高而促進多巴胺的釋放，使細胞內(nèi)游離的多巴胺減少，而細胞間隙多巴胺含量增加，這一結(jié)果或許可以解釋DOPAC/多巴胺比例下降的原因[17]。但是，長期的去極化又可導致多巴胺能神經(jīng)元受抑制，進而影響其遞質(zhì)傳遞及運輸過程；3-MT/多巴胺比例下降說明細胞外多巴胺的代謝減低，即突觸后膜多巴胺的攝取減少所致，進而使細胞間隙多巴胺含量增加。目前還不清楚Synphilin-1蛋白對多巴胺的攝取及傳遞的具體作用機制，但本研究結(jié)果已經(jīng)可以初步證實Synphilin-1蛋白具有促進多巴胺在突觸囊泡的運輸傳遞而抑制神經(jīng)末梢的再攝取過程。

4 志謝

感謝日本廣島大學神經(jīng)內(nèi)科松本教授對本課題給予的幫助與指導。

[1] Jin H G,Yamashita H,Nakamura T,et al.Synphilin-1 transgenic mice exhibit mild motor impairments[J].Neurosci Lett,2008,445 (1):12-17.

[2] Sangram S,Parelkar,Juan G,et al.The Parkin-Like Human Homolog of Drosophila Ariadne-1(HHARI)Can Induce Aggresome Formation in Mammalian Cells and Is Immunologically Detectable in Lewy Bodies[J].J MolNeurosci,2012,46(1):109-121.

[3] Soehn AS,Franck T,Biskup S,et al.Periphilin is a novelinteractor of synphilin-1,a protein implicated in Parkinson's disease[J]. Neurogenetics,2010,11(2):203-215.

[4] Sutachan J J,Casas Z,Albarracin S L,et al.Cellular and molecular mechanisms of antioxidants in Parkinson's disease[J].Nutr Neurosci,2012,15(3):120-126.

[5] Hoshino T,Kawase Y,Okamoto M,et al.Cutting edge:IL-18-transgenic mice:in vivo evidence of a broad role for IL-18 in modulating immune function[J].JImmunol,2001,166(12):7014-7018.

[6] Goldberg M S,Fleming S M,Palacino J J,et al.Parkin-deficient mice exhibit nigrostriatal deficits but not loss of dopaminergic neurons[J].J BiolChem,2003,278(44):43628-43635.

[7] Masliah E,Rockenstein E,Veinbergs I,et al.Dopaminergic loss and inclusion body formation in α-Synuclein mice:implications for neurodegenerative disorders[J].Science,2000,287(5456): 1265-1269.

[8] Hennis M R,Marvin M A,Taylor C M 2nd,et al.Surprising behavioral and neurochemical enhancements in mice with combined mutations linked to Parkinson's disease[J].Neurobiol Dis,2014, 62:113-123.

[9] Oczkowska A,Kozubski W,Dorszewska J,et al.Alpha-synuclein in Parkinson's disease[J].PrzeglLek,2014,71(1):26-32.

[10] Yasuda T,Mochizuki H.The regulatory role of α-Synuclein and parkin in neuronal cell apoptosis;possible implications for the pathogenesis ofParkinson's disease[J].Apoptosis,2010,15(11): 1312-1321.

[11] Andersson F I,Werrell E F,McMorran L,et al.The effect of Parkinson's disease associated mutations on the deubiquitinating enzyme UCH-L1[J].J MolBiol,2011,407(2):261-272.

[12] VilottiS,Codrich M,DalFerro M,et al.Parkinson's disease DJ-1 L166P alters rRNA biogenesis by exclusion of TTRAP from the nucleolus and sequestration into cytoplasmic aggregates via TRAF6[J].PLoS One,2012,7(4):e35051.

[13] Anwar S,Peters O,Millership S,et al.Functionalalterations to the nigrostriatal system in mice lacking all three members of the synuclein family[J].J Neurosci,2011,31(20):7264-7274.

[14] Nuber S,Franck T,Wolburg H,et al.Transgenic overexpression of the alpha-synuclein interacting protein synphilin-1 leads to behavioral and neuropathological alterations in mice[J].Neurogenetics,2010,11(1):107-120.

[15] Pelkonen A,Yavich L.Neuromuscular pathology in mice lacking alpha-synuclein[J].NeurosciLett,2011,487(3):350-353.

[16] Szargel R,Rott R,Engelender S,et al.Synphilin-1 isoforms in Parkinson s disease:regulation by phosphorylation and ubiquitylation[J].CellMolLife Sci,2008,65(1):80-88.

[17] Nagano Y,Yamashita H,Takahashi T,et al.Siah-1 facilitates ubiquitination and degradation of synphilin-1[J].J Biol Chem, 2003,278(51):51504-51514.

Metabolic changes of dopaminergic neurons in synphilin-1 transgenic mice

JIN Hongguo，ZHOU Min，HE Songbin，et al.Department of Neurology，Zhoushan Hospital，Zhoushan 316021,China

Objective To investigate the effect of synphilin-1 on the metabolism of dopamine in dopaminergic neurons. Methods Rotarod performance test and step length test were conducted in 11 synphilin-1-transgenicmiceand 11 non-transgenic mice(controls).The levels of dopamine,dopamine metabolites and related enzymes were measured. Results The motor function was exhibited in synphilin-1-transgenic mice (P＜0.05).The enzyme activities related to dopamine metabolism in transgenic mice were not changed compared to control group(P＞0.05). Conclusion Synphilin-1 is involved in motor functional impairments,which may be associated with the release and repackage of dopamine at the presynaptic membrane of dopaminergic neuron.

Synphilin-1 Parkinson's disease Transgenic mice Dopamine 3,4-Dihydroxyphenylacetic acid

2014-07-24）

（本文編輯：楊麗）

浙江省科技廳錢江人才計劃項目（2010R10078）

316021舟山醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

金洪國，E-mail：jhgyj2003@163.com