尹居鑫, 李祖宏, 牟 穎, 呂紹武, 羅貴民

(1. 吉林大學(xué)分子酶學(xué)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 2. 生命科學(xué)學(xué)院, 長(zhǎng)春 130012;3. 浙江大學(xué)智能系統(tǒng)與控制研究所, 杭州 310027)

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具有谷胱甘肽過氧化物酶活力的含硒三肽

尹居鑫1,2, 李祖宏1,3, 牟 穎1,3, 呂紹武1,2, 羅貴民1

(1. 吉林大學(xué)分子酶學(xué)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 2. 生命科學(xué)學(xué)院, 長(zhǎng)春 130012;3. 浙江大學(xué)智能系統(tǒng)與控制研究所, 杭州 310027)

合成了由硒代半胱氨酸(U)、 谷氨酰胺(Q)和色氨酸(W)組成的QUW, QWU, WQU, WUQ, UWQ和UQW 6個(gè)具有谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)活力的含硒三肽; 采用雙酶偶聯(lián)法進(jìn)行了GPx活力測(cè)定和穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)分析; 通過噻唑藍(lán)(MTT)比色法、 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)和Western blot技術(shù)表征了含硒三肽對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移能力的影響. 結(jié)果表明, 當(dāng)U位于氨基端時(shí), 含硒三肽的GPx活力高于U位于中間位置或者羧基端時(shí). UWQ催化谷胱甘肽(GSH)還原H2O2的活力最高, 其催化機(jī)制為乒乓機(jī)制. UWQ可使HepG2細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力減弱, 降低肝癌細(xì)胞的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移能力.

谷胱甘肽過氧化物酶; 模擬物; 含硒三肽

Fig.1 Catalytic triad of GPx(PDB data: 1gp1)[3]

谷胱甘肽過氧化物酶(GPx, EC.1.11.1.9)是生物體內(nèi)最重要的抗氧化酶之一[1,2], 結(jié)構(gòu)解析結(jié)果表明, 硒代半胱氨酸(Sec, U)、 谷氨酰胺(Gln, Q)和色氨酸(Trp, W)組成了天然GPx的催化三聯(lián)體(圖1)[3], 但未闡明催化三聯(lián)體中各氨基酸的催化貢獻(xiàn)規(guī)律. GPx能發(fā)揮維持體內(nèi)活性氧(ROS)平衡的重要作用, 對(duì)預(yù)防和治療癌癥、 心血管病等多種疾病效果明顯[4]. 但作為天然GPx催化中心的U由終止密碼子UGA編碼, 難以采用基因工程方法量產(chǎn), 限制了其深入研究和應(yīng)用, 因此GPx模擬物的研究成為該領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一[5]. 為了模擬GPx活性部位的結(jié)構(gòu), 已合成了多種類型的以Ebselen為代表的有機(jī)硒化合物[6]. 雖然引入個(gè)別氨基酸會(huì)使Ebselen展示不同的GPx活力, 但這些氨基酸殘基對(duì)活性中心硒原子(Se)活性的影響尚不明確[7,8].

本文合成了由天然GPx催化三聯(lián)體U, W和Q形成的QUW, QWU, WQU, WUQ, UQW和UWQ 6個(gè)具有GPx活力的含硒三肽, 研究了催化三聯(lián)體中各氨基酸殘基的活力貢獻(xiàn)規(guī)律; 并以肝癌為研究對(duì)象[9], 表征了活力最佳的UWQ抗肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的能力. 本文結(jié)果對(duì)設(shè)計(jì)高活力含硒肽或氨基酸摻雜化合物等GPx模擬物, 深入研究其抗癌機(jī)制具有一定的指導(dǎo)意義.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

N-芴甲氧羰基-N-叔丁氧羰基-L-色氨酸[Fmoc-Trp(Boc)-OH]、N-芴甲氧羰基-N-三苯甲基-L-谷氨酰胺[Fmoc-Gln(Trt)-OH]、N-芴甲氧羰基-N-叔丁氧羰基-L-色氨酸-4-芐氧基芐酯[Fmoc-Trp(Boc)-Wang-Resin]、N-芴甲氧羰基-N-三苯甲基-L-谷氨酰胺-4-芐氧基芐酯[Fmoc-Gln(Trt)-Wang-Resin]、N-羥基苯并三氮唑(HOBt)、 三氟乙酸(TFA)和1,2-乙二硫醇(EDT), 吉爾生化(上海)有限公司;N,N-二甲基甲酰胺(DMF)和乙腈, 美國(guó)TND公司; 還原型谷胱甘肽(GSH)、 還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷(NADPH)、 谷胱甘肽還原酶(GR)和辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗, Sigma公司; 杜爾伯科改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)及胎牛血清, Gibco公司; 其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純; 參照文獻(xiàn)[10]方法制備N-芴甲氧羰酰基-1,4-對(duì)甲氧基芐基-硒代半胱氨酸[Fmoc-Sec(PMB)-OH]; 人肝癌細(xì)胞(HepG2細(xì)胞)來(lái)源于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù).

MIKRO-22型臺(tái)式高速離心機(jī)(德國(guó)Hettich公司); HZQ-X100型恒溫振蕩培養(yǎng)箱(哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)公司); Waters 600型高效液相色譜(HPLC)儀(美國(guó)Waters公司); ALPHA 2-4型凍干機(jī)(德國(guó)CHIST公司); MCO-15AC型CO2培養(yǎng)箱(日本Sanyo公司); IMT-2型倒置顯微鏡(日本Olympus公司).

1.2 含硒三肽的制備

采用Fmoc固相肽合成法合成含硒三肽, 用反相高效液相色譜進(jìn)行分離純化[11], 經(jīng)冷凍干燥后含硒三肽樣品純度可達(dá)95%以上. 含硒三肽樣品通過質(zhì)譜和氫化物原子熒光光譜鑒定為二聚體.

1.3 性能表征

采用酶偶聯(lián)法[4]進(jìn)行含硒三肽的GPx活力測(cè)定和穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)分析. 將37 ℃下每分鐘氧化1 μmol NADPH所需含硒三肽的量定義為1個(gè)酶活力單位, 比活力用U/μmol表示. 進(jìn)行動(dòng)力學(xué)分析時(shí), 保持一種底物的濃度不變, 改變另一種底物的濃度, 通過測(cè)定NADPH在340 nm處光吸收值的變化來(lái)確定其初速度. 采用噻唑藍(lán)(MTT)比色法測(cè)定含硒三肽對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2的體外殺傷作用[12]. 采用劃痕愈合實(shí)驗(yàn)測(cè)定含硒三肽對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2體外遷移能力的影響[13]. 建模前裂痕寬度為Wbefore, 24 h后的裂痕寬度為Wafter, 遷移距離為Wbefore-Wafter. 相對(duì)遷移率定義為遷移距離與建模前裂痕寬度的比值, 即(Wbefore-Wafter)/Wbefore×100%. 采用Western blot技術(shù)[14]檢測(cè)含硒三肽對(duì)HepG2細(xì)胞中MMP-9和AFP蛋白表達(dá)情況的影響.

2 結(jié)果與討論

2.1 含硒三肽的酶學(xué)性質(zhì)分析

對(duì)比6個(gè)含硒三肽的GPx活力數(shù)據(jù)(見表1)可知, 其活力順序?yàn)閁WQ>UQW>WUQ/QUW>QWU/WQU. 含硒三肽中U所處位置的不同會(huì)導(dǎo)致其GPx活力存在差異, 即U位于氨基端時(shí)其GPx活力明顯高于U位于中間位置或者羧基端時(shí). 前文[15]已證實(shí), 將含有氨基/亞氨基的基團(tuán)引入到催化中心Se原子附近能明顯提高模擬物的GPx活力. 這是由于硒原子附近引入的氨基/亞氨基可以將催化中間體硒醇活化為在動(dòng)力學(xué)上更有活性的硒醇陰離子[16], 從而提高酶活力. 當(dāng)U位于氨基端時(shí), W和Q分子內(nèi)的亞氨基/氨基(酰胺鍵)結(jié)構(gòu)所處空間位置與催化中心的Se原子相距較遠(yuǎn), 對(duì)催化的貢獻(xiàn)比U分子內(nèi)的游離氨基小很多; 當(dāng)U位于羧基端時(shí), U分子內(nèi)的游離羧基不利于底物H2O2將Se原子氧化為亞硒酸而進(jìn)入催化循環(huán)[17], 因此GPx的活力最低.

Table 1 GPX-like activies of 3P and other GPX mimics

由動(dòng)力學(xué)參數(shù)可知, 在UWQ和UQW中, W和Q所處位置不同對(duì)形成催化中間體的貢獻(xiàn)相近, 因

Fig.2 Double-reciprocal plots for the reduction of H2O2 by GSH catalyzed by UWQ

Table 2 Kinetic parameters of GPx mimics

此kmax(UWQ)和kmax(UQW)值接近.Km是酶的特征常數(shù)之一, 其值可反映酶與底物的親和力大小:Km值大表明親和力小;Km值小表明親合力大. 在天然GPx的結(jié)構(gòu)中, Q中酰胺鍵的氧原子可與底物GSH的游離氨基形成氫鍵從而增加底物結(jié)合能力[19], 而位于羧基端QUWQ的自由度比位于中間位置QUQW的自由度大, 更容易與GSH的游離氨基形成氫鍵, 因此Km,GSH(UWQ)

2.2 UWQ對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞的生物活性

Fig.3 Cell viability of HepG2 cells treated by WUQ for 24 h

體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)可用于評(píng)價(jià)模擬物的藥效, UWQ是一種分子量小、 結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單且活性較高的GPx模擬物, 本文以HepG2細(xì)胞為對(duì)象, 研究了UWQ對(duì)其生長(zhǎng)增殖及運(yùn)動(dòng)侵襲性的影響. MTT法因具有靈敏度高及重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)而成為評(píng)價(jià)細(xì)胞存活的重要手段, 由圖3可見, 不同濃度的UWQ可使HepG2細(xì)胞的存活率降低, 隨著UWQ濃度的增加, HepG2細(xì)胞存活率降低更加顯著, 呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系. 在UWQ的濃度為10 μmol/L時(shí), HepG2細(xì)胞的存活率下降至約50%, 以Ebselen為陽(yáng)性對(duì)照, 在相同的實(shí)驗(yàn)條件下, Ebselen的濃度達(dá)到32 μmol/L時(shí)才能使HepG2細(xì)胞存活率下降至約50%. 上述結(jié)果表明, UWQ可以有效殺傷HepG2細(xì)胞, 降低其細(xì)胞存活率, 且殺傷效果強(qiáng)于Ebselen.

細(xì)胞遷移是細(xì)胞正常的生理學(xué)過程, 采用劃痕愈合實(shí)驗(yàn)可以研究細(xì)胞的遷移能力. 劃痕24 h后, 用顯微鏡測(cè)量劃痕寬度, 觀察各組細(xì)胞劃痕的“愈合”情況, 遷移率高的實(shí)驗(yàn)組中細(xì)胞相對(duì)遷移能力強(qiáng). 結(jié)果表明, 未加UWQ的HepG2細(xì)胞基本爬滿劃痕區(qū)域[圖4(A)], 其遷移率為91.5%, 達(dá)到劃痕愈合; 而加入U(xiǎn)WQ后, HepG2細(xì)胞的遷移能力明顯降低, 細(xì)胞劃痕愈合能力隨著UWQ濃度的增加而減弱, 當(dāng)加入的UWQ濃度為15 μmol/L時(shí), 遷移率僅為15.8%[圖4(B)]. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, GPx模擬物UWQ可使HepG2細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)侵襲能力顯著下降, 這是由于癌細(xì)胞與正常細(xì)胞相比處于氧化還原異常的狀態(tài)[20], 而細(xì)胞內(nèi)的抗氧化酶GPx能降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平, 削弱癌細(xì)胞的生存優(yōu)勢(shì), 降低其運(yùn)動(dòng)侵襲能力, 因此GPx模擬物UWQ能發(fā)揮降低癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)侵襲能力的作用.

Fig.4 Cell migratory ability(A) and relative wound closue(B) of HepG2 cells treated by WUQ for 24 h

基底的降解是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的重要過程, 基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-9是參與基底降解的最重要基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)之一[21]. 通過Western blot技術(shù)檢測(cè)了UWQ對(duì)HepG2細(xì)胞中MMP-9表達(dá)的影響[圖5(A)]. HepG2細(xì)胞中MMP-9明顯表達(dá), 分別在92000和83000處顯示前體(pro-MMP-9)和活化型(MMP-9)的特異條帶. 加入不同濃度的UWQ均能抑制該蛋白的表達(dá)[圖5(B)], 經(jīng)5, 10和15 μmol/L UWQ處理的HepG2細(xì)胞中pro-MMP-9(MMP-9)的表達(dá)率分別為61.2%(66.3%), 40.9%(45.8%)和26.3%(24.7%), 表明UWQ可抑制92000前體生成, 進(jìn)而導(dǎo)致83000活化型的減少. 上述結(jié)果說(shuō)明, UWQ能明顯抑制MMP-9的表達(dá), 且呈現(xiàn)一定的計(jì)量依賴關(guān)系. 由于癌細(xì)胞的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的起始都是從分泌基質(zhì)金屬蛋白酶開始的, 而UWQ抑制MMP-9蛋白表達(dá)即可減少基底的降解, 從而降低了腫瘤細(xì)胞的侵襲性. 由于癌細(xì)胞內(nèi)異常增加的活性氧(ROS)具有刺激其增殖、 轉(zhuǎn)移及提高基因突變率等生物學(xué)功能[22], 而GPx模擬物UWQ可以高效地清除癌細(xì)胞內(nèi)的ROS, 通過抑制MMP-9蛋白表達(dá)的方式降低腫瘤細(xì)胞的侵襲性, 這與劃痕愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致.

Fig.5 Western blot analysis of MMP-9 and AFP protein expression(A) and relative protein expression(B) in HepG2 cells treated by WUQ for 24 h(B) Error bars represent mean±SE for n=3. # p<0.05; ## p<0.01.

肝癌的侵襲和轉(zhuǎn)移是其最主要的生物特征, 甲胎蛋白(AFP)是肝癌發(fā)生、 侵襲過程中表達(dá)的重要蛋白質(zhì), 是肝癌診斷的標(biāo)志性蛋白. 采用不同劑量的UWQ處理HepG2細(xì)胞12 h后, 提取細(xì)胞總蛋白進(jìn)行Western blot檢測(cè). 結(jié)果表明, 與未經(jīng)UWQ處理的HepG2細(xì)胞相比, 經(jīng)UWQ處理的HepG2細(xì)胞的AFP蛋白表達(dá)均被抑制, 且呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系, 當(dāng)UWQ濃度為15 μmol/L時(shí)抑制率可達(dá)83.7%[圖5(B)]. HepG2細(xì)胞表達(dá)的AFP蛋白是促進(jìn)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、 增殖及遷移等生理現(xiàn)象的重要蛋白, 而能夠抑制AFP蛋白表達(dá)的UWQ可以有效抑制上述生理現(xiàn)象的產(chǎn)生, 與細(xì)胞存活率、 劃痕愈合及MMP-9蛋白表達(dá)的研究結(jié)果一致.

綜上所述, 合成了由天然GPx催化三聯(lián)體U, W和Q組成的6個(gè)具有GPx活力的含硒三肽, 研究了催化三聯(lián)體中各氨基酸殘基的活力貢獻(xiàn)規(guī)律, 證明了活力最佳的UWQ是一種能有效抑制肝癌侵襲和轉(zhuǎn)移的GPx模擬物, 具有開發(fā)成預(yù)防和治療肝癌藥物的應(yīng)用前景.

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? Supported by the National Major Scientific Instruments Development Project, China(No.2013YQ470781) and the Natural Science Foundation of Jilin Province, China(No.20130101159JC).

Tripeptide Containing Selenium with Glutathione Peroxidase Activity?

YIN Juxin1,2, LI Zuhong1,3, MU Ying1,3, Lü Shaowu1,2*, LUO Guimin1

(1.KeyLaboratoryforMolecularEnzymologyandEngineering,MinistryofEducation,2.CollegeofLifeSciences,JilinUniversity,Changchun130012,China;3.InstituteofCyber-SystemsandControl,ZhejiangUniversity,Hangzhou310027,China)

Six selenium-containing tripeptides(QUW, QWU, WQU, WUQ, UWQ and UQW) were synthesized by solid-phase synthesis technology based on the catalytic triad of native glutathione peroxidase(GPx). The GPx activities and the kinetics of the tripeptide were determined by the enzyme coupling method. The effects of tripeptide on HepG2 cells growth and migration were assessed using the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT) assay, wound assay and Western blot method. The results showed that the GPx activity of the tripeptide with U at the amino terminal was higher than that of U at the middle position or the carboxyl terminal. Among the six tripeptide, the activity of UWQ catalyzed by glutathione(GSH) reduced by hydrogen peroxide(H2O2) was higher than those of other tripeptides, and its catalytic mechanism was Ping-Pong mechanism. UWQ can dosedependently discrease migration speed of HepG2 cells to exercise, and reduce the invasion and metastasis of HepG2 cells.

Gluathione peroxidase; Mimics; Tripeptide containing selenium

2016-02-18.

日期: 2016-06-16.

國(guó)家重大科學(xué)儀器設(shè)備開發(fā)專項(xiàng)(批準(zhǔn)號(hào): 2013YQ470781)和吉林省自然科學(xué)基金(批準(zhǔn)號(hào): 20130101159JC)資助.

10.7503/cjcu20160101

O629; Q554+.6

A

?2016-02-17. 網(wǎng)絡(luò)出版日期: 2016-06-15.

聯(lián)系人簡(jiǎn)介: 呂紹武, 男, 博士, 副教授, 主要從事模擬酶方面的研究. E-mail: lvsw@jlu.edu.cn