張洪亮　董天崴　張磊藝

[摘要] 目的 研究miR-21-5p在肺動脈高壓發(fā)病中的調(diào)控機制。 方法 應用qRT-PCR方法檢測miR-21-5p在正常人和先天性心臟病伴肺動脈高壓患者血清，以及常氧和缺氧處理肺動脈平滑肌細胞中的表達；利用Edu滲入法以及劃痕實驗研究miR-21-5p對肺動脈平滑肌細胞增殖及遷移的影響；應用Targetscan軟件進行靶基因預測并在肺動脈平滑肌細胞中進行驗證。 結果 肺動脈高壓患者血清miR-21-5p水平顯著高于正常人血清（P < 0.001）；與常氧相比，缺氧處理肺動脈平滑肌細胞明顯促進miR-21-5p表達（P < 0.01）；miR-21-5p能夠促進缺氧條件下的肺動脈平滑肌細胞增殖、遷移；雙熒光素酶報告系統(tǒng)證明miR-21-5p能夠結合骨形成蛋白Ⅱ型受體（BMPR2）的3UTR；鑒定miR-21-5p在肺動脈平滑肌細胞中靶向BMPR2基因。 結論 miR-21-5p調(diào)控靶基因BMPR2參與肺動脈高壓發(fā)病。

[關鍵詞] 肺動脈高壓；microRNA；骨形成蛋白Ⅱ型受體；調(diào)控

[中圖分類號] R543.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2016）10（b）-0012-04

[Abstract] Objective To reveal the role of miR-21-5p in the development of pulmonary arterial hypertention （PAH）. Methods qRT-PCR method was used to detect the expression of miR-21-5p in the serum of healthy donors and patients with PAH associated with congenital heart disease （CHD-PAH）， and the pulmonary artery smooth muscle cells （PASMC） exposed to normoxia and hypoxia. The effects of miR-21-5p on hypoxia-induced PASMC proliferation and migration were detected by Edu incorporation and wound assay. The target gene of miR-21-5p was predicted by targetscan and validated by luciferase report assay. Results miR-21-5p level was significantly increased in the serum of CHD-PAH patient as compared with healthy donors （P < 0.001）. In addition， the expression of miR-21-5p was significantly induced in PASMC treated by hypoxic as compared with normoxia （P < 0.01）. Functional analysis revealed that miR-21-5p significantly enhanced hypoxia-induced PASMC proliferation and migration. Finally， dual-luciferase reporter system proved miR-21-5p could integrate with BMPR2 3UTR， then BMPR2 was identified as a direct target of miR-21-5p. Conclusion The study demonstrates that miR-21-5p is involved in regulating PAH by targeting BMPR2.

[Key words] Pulmonary arterial hypertension； microRNA； BMPR2； Regulation

肺動脈高壓是以肺動脈壓力持續(xù)升高、肺血管阻力增加和肺小血管重構為特征的肺血管疾病[1]。肺動脈平滑肌細胞的增殖和遷移，使得肺小動脈內(nèi)徑變細，最終肺動脈阻力增加，壓力升高為其病理學特征[2-3]。

microRNA（miRNA）是一類高度保守、長度為20～25個核苷酸的非編碼單鏈小RNA[4]。miRNA通過與靶基因mRNA 3′非翻譯區(qū)（3′-UTR）特異結合，在轉錄后水平對基因進行調(diào)控[5]。研究表明，miRNA參與肺動脈高壓的發(fā)生發(fā)展進程[6-7]。miRNA通過促進肺動脈平滑肌細胞的分化和抗凋亡效應來參與肺動脈高壓的進程[8-9]。本研究對miR-21-5p調(diào)控BMPR2參與肺動脈高壓的發(fā)病機制進行初步探索。

1 材料與方法

1.1 患者血清標本采集

血清標本來源于北京阜外醫(yī)院先天性心臟病伴有肺動脈高壓（CHD-PAH）患者及健康人各24例。肺動脈高壓的診斷標準為在海平面靜息狀態(tài)下右心導管檢查肺動脈收縮壓>4 kPa（30 mmHg）和/或肺動脈平均壓>3.33 kPa（25 mmHg）。血液樣本在室溫下靜置1 h，4℃離心機3000 r/min離心10 min，上清液保存于-80℃冰箱。

1.2 miR-21-5p實時熒光定量檢測

應用qRT-PCR檢測試劑盒（深圳盎然生物）進行檢測。miRNA經(jīng)加poly A后立即逆轉錄反應形成cDNA，snoRNA44作為內(nèi)參。每個樣本PCR反應做3個復孔，引物如下：miR-21-5p 5′-GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTCAACAT-3′（RT），5′-TTCGGTAGCTTACAGACTGA-3′（Forward）； SNORD44：5′ -GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTAGTCAG-3′（RT），5′-TGGCCTGGATGATGATAAGCA-3′ （Forward）。

1.3 肺動脈平滑肌細胞的分離和培養(yǎng)

人肺動脈平滑肌細胞（HPASMC）購自美國Science Cell公司，大鼠肺動脈平滑肌原代細胞（RPASMC）分離自SD大鼠[北京市維通利華實驗動物技術有限公司，合格證號：SCXK（京）2011-0011]肺動脈。

1.4 靶基因3-UTR熒光素酶載體及其突變載體的構建

以大鼠的基因組DNA為模板，將pGL3-ccdb載體經(jīng)雙酶切后與基因的3-UTR產(chǎn)物連接。BMPR2的3-UTR突變引物，擴增產(chǎn)物連接到雙酶切后的pGL3-ccdb載體，連接后轉化酶切鑒定后進行測序分析。

1.5 BMPR2蛋白表達檢測

采用Western blot法進行蛋白檢測。4%～10%的預制膠電泳分離蛋白質，經(jīng)濕轉法將蛋白轉移至硝酸纖維素膜上，一抗4℃搖床孵育過夜，用Totallab TL100圖像分析軟件對特異條帶進行灰度掃描，并用相對灰度值表示蛋白相對含量。一抗?jié)舛确謩e為：抗BMPR2（Abcam）1∶1000，抗β-Tubulin（Santa Cruz）1∶2000；二抗?jié)舛葹?∶2000。

1.6 細胞增殖實驗

根據(jù)試劑盒（廣州銳博生物），接種細胞于48孔板，加入20 μmol/L EdU繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，用4%多聚甲醛室溫固定30 min，0.5%Triton X-100透化10 min，每孔細胞加入150 μL染色反應液反應30 min。DNA用1×Hochest （150 μL/孔）染色5 min，在熒光顯微鏡下拍照。

1.7 細胞遷移實驗

細胞密度達到90%以上時進行劃痕（每組劃3～5個位置），更換成含0.5%FBS的SmGM-2培養(yǎng)基進行饑餓處理，并標記和拍照，所有細胞遷移實驗重復3次。

1.8 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 miR-21-5p在CHD-PAH患者血清中及缺氧條件下肺動脈平滑細胞中的表達

RT-PCR檢測結果顯示：miR-21-5p在CHD-PAH血清中表達升高，與正常人血清樣本比較，差異有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.001）；RPASMC和HPASMC分別在常氧條件下培養(yǎng)48 h以及缺氧條件下分別培養(yǎng)12、24、48 h，收集細胞后檢測miR-21-5p的表達，結果顯示缺氧條件下miR-21-5p的表達升高最明顯，與常氧比較在24 h達到高峰值（P < 0.001）。

2.2 miR-21-5p對人肺動脈平滑肌細胞增殖的影響

觀察在缺氧條件下分別轉染miRNA-control、miR-21-5p mimic、anti-cnotrol、anti-miR-21-5p后對HPASMC增殖影響。從圖2（封四）結果可見，與對照組相比，過表達miR-21-5p能促進HPASMC增殖（P < 0.01），相反，當轉染miR-21-5p拮抗物后抑制了HPASMC增殖（P < 0.01）。

2.3 miR-21-5p在人肺動脈平滑肌細胞遷移過程中的作用

實驗表明，在缺氧24 h條件下miR-21-5p具有促進HPASMC遷移作用（P < 0.01）；應用miR-21-5p抑制物缺氧24 h后，anti-21-5p抑制了HPASMC的遷移功能（P < 0.01）。

2.4 miR-21-5p靶基因預測及3-UTR熒光素酶報告系統(tǒng)驗證

TargetScan在線軟件預測候選靶基因中BMPR2的3-UTR與miR-21-5p結合位點（圖4A）。雙熒光素酶檢測結果顯示，過表達miR-21-5p使野生型BMPR2報告載體熒光素酶活性下降，與野生型對照組比較，差異有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01），突變的熒光素酶報告基因的活性與對照組比較大致不變（P > 0.05）（圖4B）。

2.5 miR-21-5p抑制內(nèi)源性BMPR2的表達

與對照組比較，轉染miR-21-5p mimic組中BMPR2表達水平明顯上調(diào)（P < 0.001），轉染miR-21-5p inhibitor組BMPR2表達水平明顯降低（P < 0.001）（圖5A、B）。應用Western blot檢測BMPR2蛋白表達水平，結果顯示，與mimic-control相比，過表達miR-21-5p BMPR2蛋白表達下降；抑制miR-21-5p的表達，能使HPASMC中BMPR2蛋白表達水平上調(diào)（圖5C）。

3 討論

既往研究證明miRNA參與肺動脈高壓的發(fā)病機制[10-11]。本研究檢測肺動脈高壓患者血清及缺氧誘導的肺動脈平滑肌細胞中miR-21-5p表達升高，細胞功能實驗在缺氧條件下miR-21-5p具有促進細胞增殖和遷移功能，應用Target scan在線軟件預測miR-21-5p靶基因為BMPR2，實驗證實miR-21-5p通過靶向BMPR2參與肺動脈高壓的細胞增殖和血管重構過程。

肺動脈高壓發(fā)病機制中BMPR2基因突變會引發(fā)肺動脈高壓易感性[12-13]。BMPR2是轉錄生長因子-β家族的重要成員，很早就有實驗證實BMPR2基因雜合子突變是肺動脈高壓家族患者人群的重要遺傳易感因素[14]。在肺動脈高壓患者的家族人群檢測結果顯示：大約有75%的家庭中檢測到BMPR2基因突變[15]。實驗證明，BMPR2和其下游信號途徑在肺血管重構中扮演著重要角色，通過激活BMPR2基因阻止細胞周期從而抑制肺動脈平滑肌細胞的分化[16-17]。

microRNA參與肺動脈高壓的調(diào)控機制已經(jīng)在多個研究中得到證實，miR-145通過靶向BMPR2參與肺動脈高壓[18]，抑制miR-20a導致BMPR2下游基因Id-1和Id-2的激活，從而抑制肺動脈平滑肌細胞的增殖[19]。miR-21在肺動脈高壓的動物模型肺組織中高表達，通過激活RhoB信號途徑促進肺動脈高壓的發(fā)生[20]。本研究發(fā)現(xiàn)缺氧條件下，過表達miR-21-5P具有促進肺動脈平滑肌細胞的遷移和增殖功能。說明在缺氧條件下，miR-21-5p對肺動脈的重構過程具有重要的作用。

本研究只探討了miR-21-5p通過BMPR2基因對HPASMC增殖和遷移的影響，Target scan軟件預測miR-21-5p同時靶向多個靶基因，其他靶基因是否同時參與了肺動脈高壓的調(diào)控需要下一步驗證。

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（收稿日期：2016-07-13 本文編輯：程 銘）